王少華丁凱景劉瑞湘張婕楊潤許周惠至楊晨劉璐康傳媛

·論 著·

DAT1 和DRD4 基因啟動子區(qū)甲基化與注意缺陷多動障礙臨床癥狀的關(guān)聯(lián)研究☆

王少華*丁凱景*劉瑞湘*張婕*楊潤許*周惠至*楊晨*劉璐△康傳媛*

目的 探索注意缺陷多動障礙（attention deficit hyperactivity disorder，ADHD）患兒多巴胺轉(zhuǎn)運體基因（dopamine transporter gene，DAT1）、多巴胺D4受體基因（dopamine receptor D4 gene，DRD4）啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)與其臨床癥狀嚴重程度的相關(guān)性。 方法 收集111例ADHD患兒精神類疾病家族史資料，并采用ADHD癥狀分級父母評定量表（attention deficit hyperactivity disorder rating scale-Ⅳ home version，ADHD-RS-Ⅳ）及自編對立違抗障礙（oppositional defiant disorder，ODD）量表對患者臨床癥狀進行評定。采用亞硫酸氫鈉測序法，檢測患者外周血的DAT1、DRD4啟動子區(qū)CpG島目標片段甲基化狀態(tài)。 結(jié)果 無抑郁、焦慮和ADHD家族史的患兒DAT1啟動子區(qū)甲基化水平高于有抑郁、焦慮或ADHD家族史的患兒（P＜0.05）。DAT1和DRD4甲基化水平在ADHD-RS-Ⅳ總分（≤30分組與＞30分組）、注意缺陷因子分（≤17分組與＞17分組）、多動沖動因子分（≤13分組與＞13分組）低分和高分組的比較中差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。ODD量表＜9分的患兒DAT1甲基化水平較ODD量表得分≥9分的患兒高（P＜0.05），且患兒DAT1甲基化水平與ODD量表得分呈負相關(guān)（r=-2.203，P=0.033)。 結(jié)論 DAT1啟動子區(qū)甲基化水平可能影響ADHD患者對立違抗行為的嚴重程度，且與患者有無抑郁、焦慮和ADHD家族史存在一定關(guān)系。

注意缺陷多動障礙 DNA甲基化 多巴胺轉(zhuǎn)運體基因 多巴胺D4受體基因

注意缺陷多動障礙（attention deficit hyperactivity disorder,ADHD）主要表現(xiàn)為與年齡不相符的注意力易分散、多動沖動伴對立違抗障礙及情緒障礙。ADHD的發(fā)病機制尚未完全闡明，但目前普遍認為其為遺傳性疾病，雙生子研究發(fā)現(xiàn)其遺傳率為76%[1]。目前研究得最為充分的兩個候選功能基因為多巴胺轉(zhuǎn)運體基因（dopamine transporter gene，DAT1）和多巴胺受體D4基因（dopamine receptor D4 gene，DRD4）[2]。另一方面，越來越多證據(jù)表明，ADHD是由基因和環(huán)境相互作用的結(jié)果[3]。表觀遺傳學(xué)是連接基因與環(huán)境因素的橋梁，其形式包括基因甲基化[4]、組蛋白修飾和染色質(zhì)重塑等。其中啟動子區(qū)CpG島的異常甲基化被認為是一些疾病的穩(wěn)定特征，可以改變相應(yīng)基因的表達水平，從而影響疾病的發(fā)生及嚴重程度。目前國內(nèi)尚未見研究探索ADHD兩個易感基因DAT1、DRD4啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)對癥狀的影響。為此，本研究采用亞硫酸氫鈉測序法對111例ADHD患兒DAT1、DRD4啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)進行檢測，探索其甲基化水平與ADHD臨床癥狀嚴重程度的關(guān)聯(lián)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 ADHD患兒來自于2010年11月至2013年12月至昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院精神科門診就診的患者。納入標準：①5～15歲，性別不限；②漢族；③符合《美國精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,Fourth Edition，DSM-Ⅳ）ADHD診斷標準，由1名副高職稱兒童精神科醫(yī)師通過詢問病史、體檢、量表初篩及智力和認知檢查作出臨床診斷，再經(jīng)另1名主治醫(yī)師通過兒童臨床診

斷性會談量表（clinical diagnostic interview scale，CDIS）與家長進行半定式訪談核實診斷。排除標準：①患有癲癇、精神發(fā)育遲滯（智力商數(shù)＜70分），或其它符合DSM-Ⅳ軸Ⅰ診斷的精神障礙（對立違抗障礙除外）；②有嚴重慢性軀體疾病病史。所有入組患兒均由父母簽署知情同意書。本項目通過昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 研究工具

1.2.1 一般資料 患兒一般資料由患兒父母提供，父母在就診時填寫自編調(diào)查表，內(nèi)容包括患兒性別、年齡、精神類疾病家族史（包括與患者具有血緣關(guān)系的直系、旁系親屬）。根據(jù)目前主流的精神疾病發(fā)病相關(guān)假說，將精神類疾病家族病史分為：①缺乏多巴胺的疾病，包括抑郁[5]、焦慮[6]、ADHD；②多巴胺過多的疾病，包括精神分裂癥[7]。

1.2.2 兒童臨床診斷性會談與韋氏兒童智力測試

采用CDIS量表對兒童家長進行半定式訪談，確定ADHD診斷和其他共患病情況。采用龔耀先修訂的中國韋氏兒童智力量表（Chinese Wechsler intelligence scale for children，C-WISC）評定被試患兒的智力商數(shù)（intelligence quotient，IQ）。量表評估均在患兒初入組未用藥時進行，由我院專業(yè)的心理測量師施測。

1.2.3 ADHD癥狀評估 ADHD癥狀分級父母評定量表（attention deficit hyperactivity disorder rating scale-Ⅳhome version，ADHD-RS-Ⅳ）根據(jù)DSM-Ⅳ中ADHD的診斷標準編制而成，由患兒父母填寫。該量表共18項條目，各條目采用4級評分法（0～3分表示癥狀從“無”到“非常多見”），1～9項得分為注意缺陷分（inattention score，I分），10～18項得分為多動沖動分（hyperactivity/impulsivity score，HI分），18項條目得分之和為臨床癥狀總分[7]。以入組患兒該量表得分的中位數(shù)為界值，將其劃分為高分組和低分組。

1.2.4 對立違抗癥狀評估 根據(jù)DSM-Ⅳ中對立違抗障礙（oppositional defiant disorder,ODD）的8項條目自編量表。各條目按照行為出現(xiàn)的頻率采用4級評分法（1～4分表示從“無”到“常見”），8項條目的總分反映對立違抗行為的程度。以入組患兒該量表得分的中位數(shù)為界值，將其劃分為高分組和低分組。

1.3 DAT1、DRD4啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)檢測

1.3.1 標本采集及DNA提取 入組兒童每例采集外周靜脈血2～3 mL，EDTA抗凝，-80℃冰箱保存，2周內(nèi)采用柱式小量血液基因組DNA抽提試劑盒（上海華舜生物技術(shù)有限公司）提取DNA并檢測純度與濃度。

1.3.2 DNA甲基化水平檢測及目標片段選定 使用DNA甲基化試劑盒EZ DNA Methylation-Gold Kit（美國ZYMO RESEARCH公司），按照操作說明書對樣本DNA進行亞硫酸氫鹽修飾。采用亞硫酸氫鈉測序法檢測DAT1、DRD4啟動子區(qū)CpG島甲基化水平。應(yīng)用美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）中的BLAST（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ blast.cgi）設(shè)計引物。DRD4外擴引物為 5’-G AATTTTTTGTTGYGTTTTGTAAGTAT-3’，5’-GCC AAACGCAAAAAAACCTAAACTC-3’，內(nèi)擴為5’-TTGTTGYGTTTTGTAAGTATTTTTTT-3’，5’-CAAC CTCTAACCCTCAACCCC-3’；DAT1外擴引物為5’-TTAGGGGCGACGTATAGAGTTGG-3’，5’-CCGCT CCACGCTCTAACCAA-3’，內(nèi)擴為5’-GGTTTGGG GGTTTTATTTTTT-3’，5’-AATCCTTCCGTAACCTT AAAATCTC-3’。應(yīng)用Takara LA Taq/Takara Ex Taq對亞硫酸氫鹽處理后的基因組DNA進行兩次降落PCR（touch down PCR）擴增。外擴反應(yīng)體系12.5 μL，含模版DNA 4 μL、上下游引物（20 μmol/L）各0.25 μL、TaKaRa LA Taq 0.125 μL、10×LA PCR Buffer II 1.25 μL、dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）2 μL；反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s、62℃退火30 s（每循環(huán)降落2℃）、72℃延伸1 min，7個循環(huán)，72℃鏈接10 min，4℃保持。內(nèi)擴反應(yīng)體系50 μL，含模版DNA 2 μL、上下游引物（20 μmol/L）各1 μL、TaKaRa Ex Taq 0.25 μL、10× Ex Taq Buffer II 5 μL、dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）4 μL；反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s、62℃退火30 s（每循環(huán)降落1℃）、72℃延伸1 min，13個循環(huán)，72℃鏈接 10 min，4℃保持。用Wizard SV Gel and PCR Clean-up System試劑盒（美國Promega）及Competent Cell Preparation Kit（寶生物大連工程有限公司）對擴增產(chǎn)物進行純化、連接質(zhì)粒載體、挑單克隆，測序（上海生工生物工程公司）后與原序列對比，獲得候選基因DAT1、DRD4啟動子區(qū)甲基化水平。使用UltraEdit32軟件編輯整理DNA甲基化測序所得堿基序列，計算每例患者DAT1和DRD4基因的甲基化水平。甲基化水平=實際甲基化位點數(shù)目/目標片段中可甲基化位點總數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)采用EpiData 3.1軟件雙錄入核對后轉(zhuǎn)入SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析。甲基化水平為非正態(tài)分布數(shù)據(jù)，采用中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）[M（QL，QU）]描述，Mann-Whitney U秩和檢驗進行組間比較，患兒甲基化水平與各癥狀量表評分的關(guān)系采用Spearman相關(guān)分析。檢驗水準α為0.05，雙側(cè)檢驗。對統(tǒng)計檢驗中的陰性結(jié)果，使用G*power軟件計算統(tǒng)計效力（1-β）值。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料及DAT1、DRD4甲基化情況 111例ADHD患兒均完成候選基因甲基化檢測?；純褐心?7例（87.4%），女14例（12.6%）；年齡5～15歲，平均（9.25±2.08）歲；所用患者均未接受過藥物治療；有精神類疾病家族史者31例（27.9%），其中有抑郁、焦慮或ADHD家族史者26例（23.4%），有精神分裂癥家族史者5例（4.5%）?；純篈DHDRS-Ⅳ總分中位數(shù)為30（24，38）分，I分和HI分分別為17（14，21）分和13（8，18）分；ODD分中位數(shù)9（5，12）分。

DAT1啟動子區(qū)甲基化率中位數(shù)為 16.0%（8.0%，28.0%），最高為100.0%（1例），最低為0.0%（8例）；DRD4啟動子區(qū)甲基化率中位數(shù)為78.3%（70.0%，82.6%），最高100.0%（2例），最低為47.8%（1例）。

2.2 不同家族史情況患兒DAT1、DRD4甲基化水平 無抑郁、焦慮和ADHD家族史的患者DAT1甲基化水平高于有抑郁、焦慮或ADHD家族史的患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-3.236，P=0.001），而兩者DRD4甲基化水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（Z=-0.056，P=0.955），其（1-β）值均為0.60，見表1。有無精神分裂癥家族史的患兒DAT1與DRD4甲基化水平差異均無統(tǒng)計意義（P＞0.05），其（1-β）均值為0.19。

2.3 不同臨床癥狀患兒DAT1、DRD4甲基化水平

ADHD-RS-Ⅳ量表總分及其I分、HI分的低分和高分組間DAT1和DRD4甲基化水平分別比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），其（1-β）值均為0.74。ODD量表分≤9分組的DAT1甲基化水平高于＞9分組（Z=2.726，P=0.006），而兩者DRD4甲基化水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其（1-β）值為0.73。見表2。

2.4 DAT1、DRD4甲基化水平與癥狀相關(guān)性 患兒DAT1甲基化水平與ODD量表分呈負相關(guān)（r=-0.203，P=0.033），但與ADHD-RS-Ⅳ量表總分、I分、HI分的相關(guān)均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。DRD4甲基化水平與ADHD-RS-Ⅳ量表總分、I分、HI分、ODD量表分相關(guān)均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

3 討論

既往多項研究提示前額葉多巴胺（dopamine，DA）功能低下和ADHD相關(guān)[8]，而DAT1和DRD4是與多巴胺功能密切相關(guān)的兩個基因。DAT1編碼Na+和Cl-依賴的多巴胺轉(zhuǎn)運體蛋白，該蛋白位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)DA神經(jīng)元突觸前膜，能再攝取突觸間隙DA，中止神經(jīng)細胞信號傳遞，影響DA突觸間隙的濃度和作用時間；DRD4編碼DA的第四種G蛋白偶聯(lián)受體，該受體位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)DA神經(jīng)元突觸后膜，影響神經(jīng)細胞信號的傳遞。

本研究提示有抑郁、焦慮或ADHD家族史的患兒DAT1甲基化水平低于無相關(guān)家族史的ADHD患兒。DAT1甲基化水平低可能提示中樞神經(jīng)系統(tǒng)DA處于低水平，而存在抑郁、焦慮或ADHD的個體也有低DA水平情況[8]，提示父代的低DA水平可能遺傳給子代，因此本結(jié)果在一定程度上從側(cè)面支持ADHD是遺傳性的疾病[9]。

DADDS等[10]研究提示DRD4甲基化水平與ADHD患兒注意缺陷及認知障礙相關(guān)，HASLER等[11]的研究提示DAT1甲基化水平與多動沖動癥狀相關(guān)，而本研究中DAT1和DRD4甲基化水平與ADHD臨床癥狀嚴重程度的相關(guān)性無統(tǒng)計學(xué)意義。但由于本研究樣本量小，統(tǒng)計檢驗的把握度不高，故此結(jié)果還需擴大樣本量進一步證實。

表1 有無抑郁、焦慮、ADHD家族史患兒DAT1、DRD4啟動子區(qū)甲基化水平[M（QL,QU）]

表2 各癥狀量表不同得分患兒DAT1、DRD4啟動子區(qū)甲基化水平[M（QL,QU）]

對立違抗障礙是一種以針對成人和權(quán)威表現(xiàn)出違抗、敵意和沖動行為特征的外顯性行為障礙，常與ADHD共患，其共患率約35%～65%，共患對立違抗障礙可進一步加重ADHD患者的社會功能損害[13]。哌醋甲酯可通過提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)DA的功能而改善ODD癥狀，提示ODD癥狀可能與中樞神經(jīng)系統(tǒng)低DA水平相關(guān)[14]。既往也有研究提示DAT1參與ODD的發(fā)生[15]，然而，尚無研究報道DAT1甲基化水平與ODD癥狀相關(guān)。DAT1啟動子區(qū)的低甲基化水平可能導(dǎo)致DAT1的表達水平增高，DAT數(shù)量增多，神經(jīng)元細胞突觸間DA水平下降[16]。本研究發(fā)現(xiàn)ODD癥狀重的患兒其DAT1甲基化水平低，進一步支持中樞神經(jīng)系統(tǒng)DA的水平和ODD癥狀相關(guān)，但該結(jié)論還需在其他獨立樣本中進一步證實。

本研究尚存在一些缺陷。首先，甲基化存在組織特異性，本研究檢測DAT1、DRD4甲基化選用的外周血液樣本，無法完全代表腦組織中的甲基化狀態(tài)。此外，DAT1、DRD4甲基化水平只是影響腦中DA濃度的一個方面，還需進一步研究基因甲基化、轉(zhuǎn)錄、翻譯到蛋白表達的這一復(fù)雜過程才能全面闡述ADHD臨床癥狀與DA水平及DAT1、DRD4的相關(guān)性。第三，本研究的所有陰性結(jié)果把握度均較低，所得結(jié)論需擴大樣本進一步證實。

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Association between methylation status of CpG island in DAT1 and DRD4 genes and clinical symptoms ofADHD.

WANG Shaohua,DING Kaijing,ZHANG Jie,YANG Runxu,ZHOU Huizhi,YANG Chen,LIU Lu,KANG Chuanyuan.Department of Psychiatry,the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Yunnan 650032, China.Tel:0871-65324888.

Objective To investigate the correlation of methylation status in DAT1 and DRD4 genes and severity of clinical manifestations in ADHD patients.MethodsOne hundrd eleven DSM-Ⅳ defined ADHD patients were enrolled in this study and the demographic data were collected.Clinical symptoms were also assessed by Attention Deficit Hyperactivity Disorder Rating Scale-Ⅳ Home Version(ADHD-RS-Ⅳ)and self-developed Oppositional Defiant Disorder(ODD)rating scale.Bisulfite genomic sequencing(BGS)was used to detect the methylation status of every CpG site in DAT1 and DRD4 promoter CpG island in peripheral venous blood.ResultsThe DNA methylation level in total CpG island for DAT1 was higher in individuals without depression,anxiety or ADHD family history compared to individuals with above family histories (P＜0.05).The differences on methylation levels for DAT1 and DRD4 were not significant between high and low ADHD-RS-Ⅳtotal score (≤30 vs.＞30),ADHD-RS-Ⅳinattention score(≤17vs.＞17),and ADHD-RS-Ⅳhyperactivity/impulsivity score (≤13 vs.＞13)subgroups (all P＜0.05).The methylation levels in total CpG island in DAT1 was higher in individuals whose ODD score were＜9 compared to those whose ODD score were≥9 (P＜0.05).Conclusions Methylation status of CpG island in DAT1 may influence the severity of oppositional defiant symptom in ADHD patients,which is correlated with depression,anxiety and ADHD family histories.

Attention deficit hyperactivity disorder DNA methylation Dopamine transporter gene(DAT1/ SLC6A3)Dopamine receptor D4 gene(DRD4)

R749.94

A

2016-08-29)

(責(zé)任編輯：肖雅妮)

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.02.007

☆國家自然科學(xué)基金（編號：30900488，81460218）；國家科技支撐計劃項目（編號：2015BAI13B01）

* 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院精神科（昆明 650032）

△國家精神心理疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心（北京大學(xué)第六醫(yī)院）