趙雅寧孫竹梅劉俊杰李建民薛承景陳長(zhǎng)香

·論 著·

大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血后細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2 激活介導(dǎo)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞自噬☆

趙雅寧*孫竹梅*劉俊杰*李建民△☆薛承景△陳長(zhǎng)香*

目的 探討大鼠蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage,SAH）后海馬區(qū)細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2 （extracellular regulated protein kinases，ERK1/2）激活與神經(jīng)細(xì)胞自噬的關(guān)系。方法 120只雄性SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、SAH組、ERK1/2抑制劑U0126組、自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素（rapamycin,Rap）組。采用枕大池二次注血法制作SAH大鼠模型；U0126組和Rap組分別于造模前30min側(cè)腦室注射U0126（5μg/μL）和Rap（10nmol/μL）。光鏡觀察海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)；免疫組化法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)海馬區(qū)磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）、ERK1/2 mRNA和自噬標(biāo)志蛋白（Beclin-1和Beclin-1mRNA、LC3-Ⅱ和LC3mRNA）表達(dá)水平。結(jié)果 與假手術(shù)組比較，SAH組神經(jīng)細(xì)胞死亡率增加（14.9%±5.7%，28.3%±9.8%，44.2%±10.9%）（q值依次為27.56、35.65、44.81；均P＜0.05），ERK1/2 mRNA、Beclin-1 mRNA和LC3 mRNA水平增加（1.83±0.01，2.82±0.06，1.34±0.04；1.46±0.02，1.76±0.02，1.35±0.02；1.52±0.04，1.89±0.01，1.31±0.04）(q值依次為42.99、60.66、48.08，71.26、72.46、49.50，48.49、82.40、41.18；均P＜0.05），p-ERK1/2、Beclin-1和LC3–II蛋白水平增加（均P＜0.05）；與SAH組比較，U0126組神經(jīng)細(xì)胞死亡率增加（19.6±6.5%，36.2±7.7%，58.2±12.7%）（q值依次為9.59、10.43、14.66；均P＜0.05），U0126組ERK1/2 mRNA、Beclin-1 mRNA和LC3 mRNA表達(dá)降低（1.23±0.02，1.40±0.02，1.12±0.02；1.22± 0.04，1.48±0.06，1.24±0.03；1.34±0.04，1.33±0.02，1.14±0.04）(q值依次為 75.66、65.35、31.11，37.18、26.70、15.56，16.79、51.85、22.58；P＜0.05），p-ERK1/2、Beclin-1和LC3–II蛋白水平降低（P＜0.05）；與SAH組比較，Rap組神經(jīng)細(xì)胞死亡率降低（9.1%±4.6%，18.8%±8.6%，28.21%±9.2%）（q值依次為11.86、12.54、16.74；均P＜0.05），Rap組 Beclin-1mRNA和LC3mRNA增加（1.78±0.02，2.27±0.05，1.86±0.04；1.97±0.06，2.31±0.08，1.85± 0.00）(q值依次為49.57、48.63、72.12、41.96、38.88、71.73；P＜0.05），Beclin-1和LC3–II蛋白增加（P＜0.05），ERK1/2 mRNA變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (q值依次為2.63、2.65、2.83，P＞0.05），p-ERK1/2蛋白變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論 SAH后激活的ERK1/2激活，可促進(jìn)Beclin-1和LC3-Ⅱ表達(dá)介導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞丟失。

蛛網(wǎng)膜下腔出血 細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2 自噬 微管相關(guān)蛋白-1

自噬是真核細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞防御機(jī)制。應(yīng)激狀態(tài)下自噬的程度對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境平衡起到不可忽視的作用。研究顯示蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage,SAH）病理過程中伴隨自噬的發(fā)生，進(jìn)一步誘導(dǎo)自噬可減低SAH后早期腦損傷（early brain injury,EBI）的神經(jīng)細(xì)胞凋亡，改善神經(jīng)功能損傷[1],但SAH后自噬發(fā)生的機(jī)制尚未明確。細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases，ERK1/2）是有絲分裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinases，MAPKs)家族重要成員之一；已證實(shí)ERK1/2信號(hào)活化在多種中樞神經(jīng)疾病如腦卒中、腦創(chuàng)傷、阿爾茨海默病等等病理過程中具有關(guān)鍵作用，是神經(jīng)細(xì)胞存活調(diào)控靶點(diǎn)之一[2-3]。那么，SAH后神經(jīng)細(xì)胞自噬是否與ERK1/2信號(hào)活化有關(guān)，目前報(bào)道甚少。因此，本研究通過建立大鼠SAH，分別應(yīng)用ERK1/2抑制劑和自噬誘導(dǎo)劑進(jìn)行干預(yù)，觀察海馬區(qū)ERK1/2激活、自噬關(guān)鍵因子Beclin-1和微管相關(guān)蛋白1（輕鏈LC3-Ⅱ）表達(dá)以及神經(jīng)細(xì)胞丟失情況，探討SAH后神經(jīng)細(xì)胞自噬與ERK1/2信號(hào)活化的關(guān)系，為SAH后EBI的早期救治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 清潔級(jí)雄性SD大鼠120只，體質(zhì)量350～450g購(gòu)置于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)SCXK(京)2009-003。按照隨機(jī)數(shù)字表法，將大鼠分為假手術(shù)（Sham）組、SAH組、ERK1/2抑制劑U0126組、自噬誘導(dǎo)劑Rap組。每組又分6、24、72h 3個(gè)時(shí)間。

1.2 動(dòng)物模型制作 采用自體血二次枕大池注血法[4]制備大鼠SAH模型。Sham組向枕大池2次注入0.3 mL等滲鹽水，余操作均與SAH組一致。U0126組和Rap組分別于造模前30min側(cè)腦室注射U0126（5μg/μL）和Rap（10nmol/μL），然后再制備SAH模型。模型判定標(biāo)準(zhǔn)：①當(dāng)行第二次枕大池注血時(shí)，可見少量血性腦脊液在穿刺部位滲出，說明穿刺針位置準(zhǔn)確；②剝離腦部時(shí)肉眼可以見到極其顯眼的血性液體散在分布于腦底基底池部位，或光鏡下見到蛛網(wǎng)膜下腔有明顯血性液體（圖1）。模型制作過程中，SAH組死亡7只，1只模型不符合標(biāo)準(zhǔn)被剔除；U0126組和Rap組分別死亡6只，各組有2只模型不符合標(biāo)準(zhǔn)被剔除；上述被剔除動(dòng)物依次補(bǔ)齊，最終各組30只動(dòng)物納入統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

圖1 SAH動(dòng)物模型的判定。A：肉眼見到血性液體分布于腦底基底池部位；B:光鏡下見到蛛網(wǎng)膜下腔有明顯血性液體。

1.3 腦組織海馬區(qū)形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 各組各時(shí)間點(diǎn)取5只動(dòng)物，常規(guī)麻醉后處死；用4%多聚甲醛灌注固定后，截取視交叉平面至大腦橫裂腦組織。經(jīng)石蠟包埋、冠狀切片（片厚5 μm）、HE染色。參照文獻(xiàn)[5]在有測(cè)微尺的光學(xué)顯微鏡（400×）下觀察海馬CA1區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化；應(yīng)用Motic-6.0圖像采集和分析系統(tǒng)計(jì)算每個(gè)視野的死亡神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量（每只動(dòng)物取5張海馬區(qū)切片，每張切片選取4個(gè)不重復(fù)的視野，即每組各100個(gè)視野），以視野下神經(jīng)細(xì)胞平均死亡百分率（CA1區(qū)死亡細(xì)胞數(shù)量與總細(xì)胞數(shù)量比值百分?jǐn)?shù)）表示。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè) ERK1/2、Be

clin-1、LC3mRNA各組各時(shí)間點(diǎn)取5只大鼠，動(dòng)物按照規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)處死，快速斷頭取腦，用冰箱中預(yù)冷的器械在冰上分離出雙側(cè)海馬組織，稱量0.6 g，加入1mL RNAiso Plus溶液后勻漿，室溫（26℃）靜置5min后，12000r/min 4℃離心5min，取上清移至新的1.5mL離心管內(nèi)，加入1/5RNAiso Plus溶液體積的氯仿，震蕩混勻后室溫靜置5min，12000 r/min4℃離心15min，將上清液轉(zhuǎn)移至新離心管中，加入0.5～1倍RNAiso Plus溶液體積的異丙醇，室溫靜置10min，12000 r/min4℃離心10min，棄掉上清液，用與RNAiso Plus溶液等量的75%乙醇清晰沉淀，7500 r/min4℃離心5min，棄上清保留沉淀，干燥（不可加熱），溶解于30μL DEPC處理水中，測(cè)量OD260/280值，根據(jù)OD260計(jì)算RNA濃度，-80℃保存。

ERK1/2序列：5’-GCCGCCGCCGCCGCCAT-3’；ERK1 Forward primer：5’-TACACGCAGTTGCA GTACATCG-3’；ERK1 Reverse primer：5’-CGCAG GATCTGGTAGAGGAAGT-3’；ERK2Forwardprimer：5’-GGAGCTTGTGGAAATACCTTGG -3’；ERK2 Reverse primer：GACGCAGTGTGGAAATACCTTGG-3’；Beclin1序列：Forward primer：CTCTCGTCAAGGCGTCACTTC；Reverse primer：CCTTAGACCCCTCCATTCCTCA。 LC3序 列 ：Forward primer：ACCCTCTACGATGCTGGTGA Reverse primer：GCTGTCCTCAATGTCCTTCTG（上海生工生物技術(shù)有限公司合成）。進(jìn)行Real Time One Step實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)：Satge 1、2（反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），Reps，1，42℃5min，95℃10s；Stage3（PCR反應(yīng)），Reps，40，95℃5s，60℃31s；Stage4（融解曲線分析），Dissociation Protocol。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)磷酸化ERK1/2、Beclin-1、LC3-II陽性表達(dá) 標(biāo)本采集同HE染色，切片常規(guī)脫蠟至去離子水、滴加復(fù)合消化液、37℃溫箱孵育20 min，PBS洗滌3次，每次5 min，用3%過氧化氫封閉內(nèi)源性過氧化物酶15 min，PBS洗滌、滴加兔抗鼠p-ERK1/2、Beclin-1和LC3-II多克隆抗體（1:200，1：250，1：250），置于冰箱保鮮層4℃過夜；37℃復(fù)溫45 min，PBS洗滌、滴加生物素化二抗，37℃孵育40 min，PBS洗滌，DAB顯色，蘇木精輕度復(fù)染、脫水透明、封片。陽性率的定量分析:每只動(dòng)物取5張海馬區(qū)切片，將每張切片的CA1區(qū)平均分為3個(gè)等份，每個(gè)等份選取一個(gè)相同部位的4個(gè)視野（100個(gè)視野），應(yīng)用Motic-6.0圖像采集及圖像分析系統(tǒng)分析各組陽性細(xì)胞進(jìn)行吸光度(absorbance，A)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，組間分析采用單因素方差分析，兩組間比較的SNK-q(Student-Newman-keuls)檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 組織病理學(xué)結(jié)果 Sham組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列整齊、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常,神經(jīng)元胞體較大，胞核大而圓，核仁清晰。SAH組海馬區(qū)可見神經(jīng)細(xì)胞變性水腫,細(xì)胞輪廓模糊;亦可見死亡神經(jīng)細(xì)胞，表現(xiàn)為細(xì)胞出現(xiàn)核溶解、核碎裂或核消失結(jié)構(gòu)不清。多組間神經(jīng)細(xì)胞死亡率有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（各時(shí)間點(diǎn) F為 156.60、193.50、151.13，均 P＜0.05）。與Sham組比較，SAH組各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞死亡率均明顯增加（q值依次為27.56、35.65、44.81；均P＜0.05）；U0126組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷進(jìn)一步加重，視野中死亡神經(jīng)細(xì)胞增多，與SAH組比較，各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞死亡率均明顯增多（q值依次為9.59、10.43、14.66；均P＜0.05）；Rap組神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷減輕，視野中死亡的神經(jīng)細(xì)胞減少，與SAH組比較，各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)細(xì)胞死亡率均明顯降低（q值依次為11.86、12.54、16.74；均P＜0.05）。見圖2、表1。

表1 各組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞死亡率比較（n=15，±s）

表1 各組海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞死亡率比較（n=15，±s）

1）與Sham組比較，P＜0.05；2）與SAH比較，P＜0.05

組別Sham組SAH組U0126組Rap組6h 1.4%±0.3% 14.9%±5.7%1）19.6%±6.5%2）9.1%±4.6%2）24h 1.3%±0.4% 28.3%±9.8%1）36.2%±7.7%2）18.8%±8.6%2）72h 1.4%±0.4% 44.2%±10.9%1）58.2%±12.7%2）28.2%±9.2%2）

2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)結(jié)果 用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)ERK1/2 mRNA、Beclin-1 mRNA和LC3 mRNA的表達(dá)，以GAPDH為內(nèi)參基因，以Sham 組ERK1/2 mRNA、Beclin-1 mRNA和LC3 mRNA表達(dá)為1，計(jì)算各組ERK1/2 mRNA、Beclin-1 mRNA和LC3 mRNA的Ct值（公式（△Ct=目的基因平均Ct值‐管家基因平均Ct值，△△Ct=實(shí)驗(yàn)組△Ct‐對(duì)照組△Ct，相對(duì)表達(dá)量=2-△△Ct）。與Sham組比較，SAH組各時(shí)間點(diǎn)ERK1/2 mRNA、Beclin-1 mRNA和 LC3 mRNA水平上調(diào) (q值依次為42.99、60.66、48.08，71.26、72.46、49.50，48.49、82.40、41.18；均P＜0.05）；與SAH組比較，U0126組中各時(shí)間ERK1/2 mRNA、Beclin-1 mRNA和LC3 mRNA持續(xù)減少 (q值依次為75.66、65.35、31.11，37.18、26.70、15.56，16.79、51.85、22.58；P＜0.05）；與SAH組比較，Rap組中ERK1/2 mRNA差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (q值依次為2.63、2.65、2.83，P＞0.05）；Beclin-1 mRNA和LC3mRNA水平顯著上調(diào) (q值依次為49.57、48.63、72.12、41.96、38.88、71.73；P＜0.05），見表2。

圖2 各組大鼠72 h海馬區(qū)組織病理形態(tài)的變化。A～D分別為sham組、SAH模型組、U0126組、Rap組海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)變化（H E染色，40×10）

表2 各組海馬區(qū)ERK1/2、Beclin-1、LC3-ⅡmRNA表達(dá)水平比較（n=15，±s）數(shù)

表2 各組海馬區(qū)ERK1/2、Beclin-1、LC3-ⅡmRNA表達(dá)水平比較（n=15，±s）數(shù)

1）與Sham組比較，P＜0.05；2）與SAH比較，P＜0.05

組別Sham組SAH組U0126組Rap組6h 1.00±0.00 1.83±0.011）1.23±0.022）1.82±0.011）ERK1/2 mRNA Beclin-1 mRNA LC3 mRNA 24h 1.00±0.00 2.82±0.061）1.40±0.022）2.79±0.061）72h 1.00±0.00 1.34±0.041）1.12±0.022）1.32±0.031）6h 1.00±0.00 1.46±0.021）1.22±0.042）1.78±0.022）24h 1.00±0.00 1.76±0.021）1.48±0.062）2.27±0.052）72h 1.00±0.00 1.35±0.02 1.24±0.032）1.86±0.042）6h 1.00±0.00 1.52±0.041）1.34±0.042）1.97±0.062）24h 1.00±0.00 1.89±0.011）1.33±0.022）2.31±0.082）72h 1.00±0.00 1.31±0.04 1.14±0.042）1.85±0.002）

表3 各組海馬區(qū)p-ERK1/2、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平比較（n=15，±s）

表3 各組海馬區(qū)p-ERK1/2、Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平比較（n=15，±s）

與Sham組比較，P＜0.05；2）與SAH比較，P＜0.05

組別Sham組SAH組U0126組Rap組p-ERK1/2 Beclin-1 LC3-II 6h 2.48±0.49 9.48±2.561）6.33±2.112）8.96±2.631）24h 2.52±0.55 16.68±4.561）8.52±2.232）15.72±4.701）72h 2.48±0.52 14.60±2.291）7.44±2.112）14.06±2.411）6h 2.49±0.70 9.41±2.581）5.08±2.152）11.24±3.882）24h 2.50±0.67 18.98±3.721）7.44±2.222）22.89±4.552）72h 2.52±0.69 14.22±4.441）10.36±2.962）17.12±4.322）6h 2.44±0.69 7.82±2.331）4.88±1.842）11.88±3.012）24h 2.33±0.63 15.39±4.221）5.77±2.112）19.12±4.442）72h 2.44±0.65 12.25±3.991）9.22±2.772）17.01±3.992）

2.3 各組免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果 磷酸化ERK1/2、Beclin-1、LC3-II陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞核，陽性細(xì)胞的胞核可見細(xì)小的棕黃色顆粒（圖3）。與Sham組比較，SAH組各時(shí)間點(diǎn)p-ERK1/2、Beclin-1和LC3-II水平上調(diào) (q值依次為32.85、40.81、61.03，26.72、52.17、33.91，25.12、40.13、31.05，均P＜0.05）；與 SAH組比較，U0126組中各時(shí)間 p-ERK1/2、Beclin-1和LC3-II持續(xù)減少(q值依次為14.78、23.52、36.05、16.72、36.53、11.19、13.73、29.56、9.59，P＜0.05）；與SAH組比較，Rap組中p-ERK1/ 2差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q值依次為2.44、2.77、2.72，P＞0.05）；Beclin-1和LC3-II水平顯著上調(diào) (q值依次為 7.07、12.38、8.41，18.96、11.46、15.06，P＜0.05）,見表3。

3 討論

腦損傷狀態(tài)下，適度自噬激活能夠清除細(xì)胞內(nèi)異常蛋白質(zhì)及受損細(xì)胞器，調(diào)節(jié)能量代謝，減輕細(xì)胞損傷程度，降低神經(jīng)細(xì)胞死亡的發(fā)生率；但過度的自噬可以促進(jìn)Caspase-3裂解，加重神經(jīng)細(xì)胞死亡[5]。ZHAO等[6]通過改良的顱內(nèi)動(dòng)脈穿刺法建立蛛網(wǎng)膜下腔出血模型，應(yīng)用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤進(jìn)行預(yù)處理處理，發(fā)現(xiàn)腦組織含水量和血腦屏障滲透率進(jìn)一步加劇及神經(jīng)細(xì)胞凋亡，神經(jīng)功能評(píng)分下降。本研究應(yīng)用自噬誘導(dǎo)劑Rap進(jìn)行預(yù)處理，結(jié)果顯示該組自噬蛋白分子Beclin-1、LC3-II表達(dá)顯著增加，同時(shí)該組神經(jīng)細(xì)胞死亡率顯著降低，提示SAH早期自噬激活有利于神經(jīng)細(xì)胞的存活，與目前報(bào)道結(jié)果相似。

ERK1/2信號(hào)激活在腦損傷中的作用一直存有爭(zhēng)議。Zhao[7]等在糖尿病大鼠腦缺血模型中觀察到，ERK1/2活性降低伴隨DNA依賴蛋白激酶Ku70表達(dá)持續(xù)減少，神經(jīng)細(xì)胞死亡增多現(xiàn)象，有學(xué)者指出，ERK1/2活化是神經(jīng)細(xì)胞耐受缺血缺氧應(yīng)激損傷的核心。但亦有研究指出ERK1/2活化可通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控炎癥因子如腫瘤壞死因子-α，白細(xì)胞介素1β表達(dá)水平，加重腦缺血缺氧造成的炎癥反應(yīng)和腦水腫[8]。本研究結(jié)果顯示與SAH組比較，U0126組ERK1/2mRNA、Beclin-1mRNA、LC3mRNA減少、磷酸化ERK1/2、Beclin-1、LC3-II免疫陽性染色降低，神經(jīng)細(xì)胞死亡率增加；而Rap組ERK1/2變化不明顯，這一方面說明SAH早期ERK1/2活化對(duì)神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，同時(shí)也提示作為自噬激活的上游通路，ERK1/2活化可調(diào)控自噬的激活，ERK1/2活性降低導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞自噬不足，而導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞丟失嚴(yán)重。目前關(guān)于ERK1/ 2信號(hào)和自噬關(guān)系的研究主要來自體外的實(shí)驗(yàn)研究，如用氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑VK3誘導(dǎo)Hela細(xì)胞自噬，ERK1/2激活，U0126可阻斷該過程中LC3-II的表達(dá)[9]。近期李冉[10]等采用非開顱血管內(nèi)穿線法制備小鼠SAH模型，觀察到代謝型谷氨酸受體1選擇性拮抗劑可降低海馬區(qū)Beclin-1、LC3-II表達(dá)，且這種變化過程中伴隨ERK1/2活性的改變，亦從側(cè)面提示SAH后ERK1/2信號(hào)激活與神經(jīng)細(xì)胞自噬有關(guān)。

圖3 各組大鼠24h海馬磷酸化ERK1/2、Becl i n-1和LC3-II免疫組織化學(xué)結(jié)果。A1～D1：分別為sham組、SAH組、U0126組、Rap組海馬區(qū)磷酸化ERK1/2免疫組織化學(xué)結(jié)果（40×10）；A2～D2：分別為sham組、SAH組、U0126組、Rap組海馬區(qū)Becl i n-1免疫組織化學(xué)結(jié)果（40×10）；A3～D3：分別為sham組、SAH組、U0126組、Rap組海馬區(qū)LC3-II免疫組織化學(xué)結(jié)果（40×10）

綜上所述，SAH后ERK1/2信號(hào)通路激活，激活的ERK1/2可通過誘導(dǎo)Beclin-1和LC3-Ⅱ表達(dá)從而參與神經(jīng)細(xì)胞丟失。ERK1/2信號(hào)通路是連接大多數(shù)細(xì)胞外信號(hào)與膜受體、轉(zhuǎn)錄因子和各基因調(diào)節(jié)的中央信號(hào)通路之一，本研究從神經(jīng)細(xì)胞自噬的角度闡明了其在SAH后EBI神經(jīng)細(xì)胞丟失的關(guān)鍵作用，為SAH后EBI的早期干預(yù)提供了一定的理論依據(jù)。

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The activation of extracellular regulated protein kinase 1/2 induces neuron autophagy in the hippocampousin a rat model of subarachnoid hemorrhage.

ZHAO Yaning,SUN Zhumei，LIU Junjie，LI Janmin,XUE Chengjing，CHEN Changxiang.The North China University of science and technology,college of Nursing and Rehabilitation,Hebei 063000,China.Tel:0315-3725385

Objective To investigate the relationship of extracellular regulated protein kinases activation and neural cells autophagy in rats after subarachnoid hemorrhage.Methods One hundred twenty male SD rats were ran-domly divided into sham operated group,SAH group,ERK1/2 inhibitor U0126 group,autophagy inducer rapamycin (Rap)group.The animal models were established by injecting the autologous blood into cisterna magna twice.U0126 (5μg/μL)and Rap (10nmol/μL)were injected into lateral ventricles in U0126 group and Rap group 30min before SAH.The morphology of hippocampal nerve cells were examined by using light microscopy.The expression levels of phosphorylated ERK1/2（p-ERK1/2），ERK1/2mRNA and autophagy markers(Beclin-1and Beclin-1 mRNA、LC3-Ⅱand LC3mRNA)in the hippocampus were detected by using immunohistochemistry and real-time fluorescence quantitative PCR.Result Compared with sham group,the rate of dead nerve cells,the mRNA levels of ERK1/2,Beclin-1 and LC3 as well as the levels of the p-ERK1/2,Beclin-1 and LC3-II increased in SAH group（P＜0.05）.Compared with SAH group,the rate of dead nerve cells increased（P＜0.05）,the ERK1/2 mRNA,Beclin-1 mRNA and LC3 mRNA,and p-ERK1/2,Beclin-1andLC3-II in U0126 group decreased（P＜0.05）;the rate of dead nerve cells decreased （P＜0.05）,the Beclin-1 mRNA and LC3 mRNA,the Beclin-1and LC3-II level increased in Rap group（P＜0.05）,but ERK1/2 mRNA and p-ERK1/2 remained unchanged（P＞0.05）.Conclusion Activation of the ERK1/2 signaling pathway after SAH,can induce nerve cells death by increasing Beclin-1 and LC3-II expressions.

Subarachnoid hemorrhage Extracellular regulated protein kinases Autophagy Microtubule-associated protein 1

R651.1

A

2016-11-16)

(責(zé)任編輯：甘章平)

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.02.010

☆河北省衛(wèi)生廳重點(diǎn)醫(yī)學(xué)項(xiàng)目（編號(hào)：zd2013087）；唐山市科技局課題（編號(hào)：14130220B）

* 華北理工大學(xué)護(hù)理與康復(fù)學(xué)院（唐山 063000）

△華北理工大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科