石金鳳，張星慧，李美香，佘美華，賀鵬程，田期先，Moshe Laudon，尹衛(wèi)東,，張 瑤

(1.南華大學(xué)心血管疾病研究所，2.南華大學(xué)藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)系，3.衡陽愛爾眼科醫(yī)院，湖南 衡陽 421001；4.常德市第一人民醫(yī)院，湖南 常德 415000；5.Neurim Pharmaceuticals Ltd，以色列)

Neu-P11通過抑制氧化應(yīng)激降低急性高眼壓大鼠眼內(nèi)壓

石金鳳1，張星慧3，李美香1，佘美華2，賀鵬程2，田期先1，Moshe Laudon5，尹衛(wèi)東1,2，張 瑤4

(1.南華大學(xué)心血管疾病研究所，2.南華大學(xué)藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院生物技術(shù)系，3.衡陽愛爾眼科醫(yī)院，湖南 衡陽 421001；4.常德市第一人民醫(yī)院，湖南 常德 415000；5.Neurim Pharmaceuticals Ltd，以色列)

目的 褪黑素(melatonin, Mel)是由松果體分泌的一類吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素，具有調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律和抗氧化等廣泛的生物學(xué)作用。新型褪黑素非選擇性受體激動劑Neu-P11與褪黑素作用相似。該文旨在研究Neu-P11對急性高眼壓大鼠眼內(nèi)壓的影響及其相關(guān)機制。方法 采用Trendelenburg臥位(頭低腳高80°位置)法將30只健康8周齡SD大鼠建立急性高眼壓模型，即動物被置于Trendelenburg臥位，用Tonopen XL接觸眼壓計每5 min測量1次眼內(nèi)壓，取20 min最大值。建模后將大鼠隨機分為5組：正常眼壓+生理鹽水組、高眼壓+生理鹽水組、高眼壓+10 mg·kg-1Mel組、高眼壓+20 mg·kg-1Neu-P11組、高眼壓+50 mg·kg-1Neu-P11組，每組6只。給藥后平位休息2 h，再次置于Trendelenburg臥位45 min后，連續(xù)監(jiān)測6 h眼內(nèi)壓(每小時1次)。連續(xù)給藥1周后，注射過量戊巴比妥鈉處死SD大鼠，心臟取血，檢測急性高眼壓大鼠血清中MDA、SOD和GSH-Px的活性；留取各組大鼠眼球進(jìn)行常規(guī)組織學(xué)切片，觀察SD大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果 Trendelenburg臥位誘導(dǎo)模型組大鼠眼內(nèi)壓值比正常組升高了約202.9%(P<0.01)，且視網(wǎng)膜增厚，層次不清，機體氧化應(yīng)激水平明顯升高。而經(jīng)Neu-P11和褪黑素治療后，明顯改善了機體氧化應(yīng)激水平和視網(wǎng)膜水腫，降低大鼠眼內(nèi)壓。結(jié)論 Neu-P11可能通過抑制機體氧化應(yīng)激水平，降低急性高眼壓大鼠眼內(nèi)壓。

Neu-P11；褪黑素；眼內(nèi)壓；特倫德倫伯臥位；MDA；SOD；GSH-Px

目前認(rèn)為，眼內(nèi)壓(intraocular pressure, IOP)升高是引起青光眼的最主要原因和可變的危險因素，降低IOP是治療青光眼的有效途徑[1]。氧化應(yīng)激與眼內(nèi)壓升高密切相關(guān)，在高眼壓狀態(tài)下，自由基的產(chǎn)生與消除失衡導(dǎo)致活性氧在視網(wǎng)膜細(xì)胞內(nèi)蓄積而引發(fā)的細(xì)胞毒性，導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞受損[2]。吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素褪黑素(melatonin, Mel)，具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等廣泛的生物學(xué)作用[3]，可以作為黃斑變性和青光眼的一種輔助治療藥物[4]。然而，褪黑素存在藥物合成提取相當(dāng)困難復(fù)雜、半衰期短和個體差異大等不足。因此，科學(xué)家們不斷地尋找有效的替代新藥。以色列研制出的新型褪黑素非選擇性受體激動劑——Neu-P11是能夠克服以上缺陷的一種新藥。我們前期研究表明，Neu-P11具有抗抑郁、抗氧化、降低正常新西蘭兔的眼內(nèi)壓等作用[5-8]，但Neu-P11是否能降低高眼壓動物的眼內(nèi)壓及其相關(guān)機制，目前尚未明確。

1 材料與方法

1.1 動物與材料 選取30只健康8周齡SD大鼠[購自南華大學(xué)動物部，體質(zhì)量(220±25)g]，每3只大鼠為1籠，被喂以普通飼料，自由飲水與進(jìn)食。正式實驗前，常規(guī)適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)1周(通風(fēng)，溫度18℃～25℃，濕度40%，光照與黑暗時間各12 h)。Neu-P11由Neurim Pharmaceuticals Ltd公司提供；GSH-Px、SOD、MDA測試盒購自南京建成；Tonopen XL接觸式眼壓計購自美國Reichert公司。

1.2 模型建立與分組 將30只SD大鼠分為正常對照組(NIS)(n=6)和模型組(n=24)。采用Trendelenburg臥位(頭低腳高80°位置)法建模[9]。即每天上午固定時間(8 ∶00～9 ∶00 am)，動物被置于Trendelenburg臥位并監(jiān)測眼壓，測量20 min內(nèi)眼壓值，每5 min測1次，共4次，取最大眼內(nèi)壓值。模型組分為正常對照組、高眼壓對照組(HIS)、Mel(10 mg·kg-1)治療組(HIS-M)、Neu-P11(20 mg·kg-1)處理組(HIS-N)、Neu-P11(50 mg·kg-1)處理組(HIS-NH)，每組6只，通過腹腔注射固定體積(1 mL)藥物進(jìn)行治療。給藥后水平位置休息2 h，再次放置于Trendelenburg臥位45 min，置于平面，采用Tonopen XL接觸眼壓計測量大鼠眼內(nèi)壓值，每小時測1次，連續(xù)監(jiān)測6 h，重復(fù)實驗1周。

1.3 MDA含量、GSH-Px和SOD酶活性的測定 注射過量戊巴比妥鈉處死SD大鼠，心臟取血于離心管中，3 000 r·min-1高速離心5 min，收集血清并分裝儲存于-20℃冰箱。MDA含量、GSH-Px和SOD酶活性的測定分別用相應(yīng)測試盒檢測，7 d內(nèi)完成檢測。

1.4 視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)檢查 過量戊巴比妥鈉麻醉處死SD大鼠后，迅速摘除大鼠眼球并標(biāo)記，立即放入眼科固定液(Carrnov25改良液)中固定24～36 h，期間換液5次。脫水5 h后“開窗”，顯微鏡下自9 ∶00～3 ∶00水平面剖開。二甲苯透明30 min，期間換1次。石蠟包埋后，制作厚5 μm切片，裱于用多聚賴氨酸處理的載玻片上，烤干進(jìn)行HE染色。

2 結(jié)果

2.1 Trendelenburg臥位對SD大鼠眼內(nèi)壓的影響 采用Trendelenburg臥位法建立急性高眼壓大鼠模型。結(jié)果如Fig 1所示，經(jīng)Trendelenburg臥位誘導(dǎo)后，模型組SD大鼠的眼壓值升高約為Normal組3倍以上(P<0.01)，差異有顯著性，即急性高眼壓大鼠模型建立成功。

Fig 1 Effect of Trendelenburg position on IOP in SD rats

**P<0.01vsnormal group

2.2 Neu-P11對急性高眼壓大鼠眼內(nèi)壓的影響 如Fig 2所示，與高眼壓對照組相比，HIS-M和HIS-N/NH組都能明顯降低眼內(nèi)壓(P<0.05)，且HIS-N組的降壓效果優(yōu)于高濃度HIS-NH處理組。結(jié)果提示Neu-P11腹腔注射給藥治療具有降低高眼壓大鼠眼內(nèi)壓的效果，且適當(dāng)濃度(如20 mg·kg-1)的治療效果更佳。

Fig 2 Effects of intraperitoneal administration of Neu-P11 or melatonin on IOP in SD rats

*P<0.05,**P<0.01vsHIS group

2.3 Neu-P11對急性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)的影響 HE染色結(jié)果如Fig 3所示，正常組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，分層清晰，各層細(xì)胞均排列整齊，邊界也十分清楚。高眼壓大鼠眼壓升高過程中視網(wǎng)膜的厚度發(fā)生了變化，高眼壓組大鼠視網(wǎng)膜明顯增厚水腫，胞質(zhì)空亮，層次清晰度欠佳，內(nèi)層視網(wǎng)膜細(xì)胞間隙增大變厚。經(jīng)藥物Neu-P11/Mel治療后，各組視網(wǎng)膜均不同程度地變薄，細(xì)胞排列較整齊，各層分界較清晰，而HIS-NH組相較于其他組而言，改善效果不明顯。

Fig 3 Histopathological examination in retina of rats by HE staining(×400)

A：NIS；B：HIS；C：HIS-M；D：HIS-N；E：HIS-NH

2.4 Trendelenburg臥位對大鼠血清中MDA含量、SOD和GSH-Px酶活性的影響 為了研究Trendelenburg臥位對大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平的影響，我們檢測了大鼠血清氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的水平。結(jié)果如Fig 4所示，HIS組大鼠血清氧化應(yīng)激參數(shù)與正常組相比，出現(xiàn)明顯異常，高眼壓模型組血清中MDA含量明顯升高(Fig 4A)，而相關(guān)抗氧化酶活性(SOD、GSH-Px)明顯降低(P<0.01)(Fig 4B、4C)。經(jīng)Neu-P11/Mel治療后，與HIS組相比，MDA含量明顯下降，逆轉(zhuǎn)了抗氧化酶的活性，SOD和GSH-Px酶活性明顯提升(P<0.01)，各項指標(biāo)接近正常值，且HIS-N比HIS-NH組提高抗氧化酶GSH-Px活性和降低脂質(zhì)過氧化物MDA的含量的作用更強，對SOD酶活性作用相似，提示適量濃度Neu-P11(20 mg·kg-1)比高濃度Neu-P11(50 mg·kg-1)有更好改善機體氧化應(yīng)激水平的作用。即Neu-P11/Mel治療均能改善機體氧化應(yīng)激水平。

3 討論

眼內(nèi)壓增加與青光眼的發(fā)展密切相關(guān)，大量實驗表明降低眼內(nèi)壓是治療青光眼的重要措施[10]。在青光眼的發(fā)生發(fā)展中，氧化損傷占有重要作用。氧化自由基和活性氧族通過影響人小梁網(wǎng)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，使房水的流出受阻，引起眼內(nèi)壓增高[11]。眼組織缺血缺氧會造成包括青光眼、糖尿病性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞等疾病[12]。

褪黑素是一類具有調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律和強效抗氧化作用的吲哚類神經(jīng)激素，具有降低眼內(nèi)壓的作用[9]。褪黑素受體主要集中在視網(wǎng)膜上的光感受器和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)，具有保護(hù)光感受器和改善由高眼壓引起的視網(wǎng)膜功能損傷的作用。褪黑素受體激動劑Neu-P11與褪黑素有類似功能，具有抗炎和抗氧化等作用[5-8]。席守民等[13]研究表明，Neu-P11能夠降低正常狀態(tài)下兔的眼內(nèi)壓，而其是否能降低高眼壓狀態(tài)下眼內(nèi)壓目前尚不明確。因此，本實驗旨在研究Neu-P11對急性高眼壓大鼠眼內(nèi)壓的影響及其相關(guān)機制，這對青光眼類眼科疾病的防治具有十分重要意義。

本實驗采用Trendelenburg臥位(頭低腳高80°位置)構(gòu)建高眼壓動物模型[9]，結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠眼內(nèi)壓約升高了202.9%(P<0.01)，約為正常組的3倍，提示高眼壓模型建立成功。且模型組大鼠視網(wǎng)膜明顯增厚水腫，細(xì)胞層次不清晰，其血清中脂質(zhì)過氧化物MDA的含量升高，抗氧化物酶SOD和GSH-Px活性明顯下降，提示機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。而經(jīng)褪黑素(10 mg·kg-1)和Neu-P11(20、50 mg·kg-1)治療后，機體各項指標(biāo)都有不同程度的改善，趨于正常化，且Neu-P11(20 mg·kg-1)比高濃度Neu-P11(50 mg·kg-1)治療效果更佳(P<0.05)。

Fig 4 Effects of Neu-P11 on MDA,SOD and GSH-Px activities in SD rat serum

Comparative effects of Neu-P11 on MDA content(A),SOD(B) and GSH-Px(C) enzyme activities in high IOP rats.*P<0.05,**P<0.01vsHIS group.

綜上所述，Trendelenburg臥位狀態(tài)下，SD大鼠眼內(nèi)壓升高，視網(wǎng)膜受損，機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)。褪黑素及其受體激動劑Neu-P11全身治療可降低機體氧化應(yīng)激水平，保護(hù)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性，降低眼內(nèi)壓。總之， Neu-P11有降低大鼠高眼壓狀態(tài)下的眼內(nèi)壓的作用，這為青光眼的預(yù)防和治療提供了一個廣闊的發(fā)展前景。

(致謝：本實驗在南華大學(xué)藥學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗室、南華大學(xué)心血管疾病研究所以及南華大學(xué)動物部完成。在此，對各位老師和同學(xué)的指導(dǎo)和幫助表示誠摯的謝意。)

[1] Hu Q, Huang C, Wang Y, et al. Expression of leukemia inhibitory factor in the rat retina following acute ocular hypertension[J].MolMedRep,2015,12(5): 6577-83.

[2] Cairns E A,Baldridge W H,Kelly M E.The endocannabinoid system as a therapeutic target in glaucoma[J].NeuralPlast, 2016,2016: 9364091.

[3] Karaaslan C, Suzen S. Antioxidant properties of melatonin and its potential action in diseases[J].CurrTopMedChem,2015,15(9): 894-903.

[4] Sánchez-Barceló E J, Mediavilla M D,Tan D X,et al. Clinical uses of melatonin: evaluation of human trials[J].CurrMedChem,2010,17(19): 2070-95.

[5] He P, Ouyang X, Zhou S, et al. A novel melatonin agonist Neu-P11 facilitates memory performance and improves cognitive impairment in a rat model of Alzheimer′s disease[J].HormBehav,2013,64(1):1-7.

[6] Wang P P,She M H,He P P, et al. Piromelatine decreases triglyceride accumulation in insulin resistant 3T3-L1 adipocytes: role of ATGL and HSL[J].Biochimie,2013,95(8): 1650-4.

[7] Huang L, Zhang C, Hou Y, et al. Blood pressure reducing effects of piromelatine and melatonin in spontaneously hypertensive rats[J].EurRevMedPharmacolSci, 2013, 17(18): 2449-56.

[8] 張 瑤,張星慧,佘美華,等. Neu-P11對急性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜AQP4表達(dá)及眼內(nèi)壓的影響[J].中國藥理學(xué)通報,2016,32(11):1624-5.

[8] Zhang Y,Zhang X H, She M H, et al. Effects of Neu-P11 on retina AQP4 expression and IOP of acute high intraocular pressure rats[J].ChinPharmacolBull,2016,32(11):1624-5.

[10]Wagner A H, Anand V N, Wang W H, et al. Exon-level expression profiling of ocular tissues[J].ExpEyeRes,2013,111:105-11.

[11]Ferreira S M,Lerner S F,Brunzini R,et al. Oxidative stress markers in aqueous humor of glaucoma patients [J].AmJOphthalmol, 2004,137(1):62-9.

[12]Li S Y, Fu Z J, Ma H, et al. Effect of lutein on retinal neurons and oxidative stress in a model of acute retinal ischemia/reperfusion[J].InvestOphthalmolVisSci,2009,50(2): 836-43.

[13]席守民, 楊五彪, 馬靈筠,等. 褪黑素受體激動劑Neu-P11對兔眼組織AQP1表達(dá)的影響[J].中國藥理學(xué)通報, 2013, 29(9): 1329-30.

[13]Xi S M, Yang W B, Ma L J, et al. Effect of melatonin receptor agonist Neu-P11 on expression of AQP1 in rabbit eyes[J].ChinPharmacolBull, 2013, 29(9):1329-30.

Neu-P11 reduces IOP through inhibiting oxidative stress level of acute high IOP rats

SHI Jin-feng1,ZHANG Xing-hui3,LI Mei-xiang1,SHE Mei-hua2,HE Peng-cheng2,TIAN Qi-xian1, Moshe Laudon5,YIN Wei-dong1,2,ZHANG Yao4
(1.InstituteofCardiovascularDisease, 2.DeptofBiotechnology，InstituteofPharmaceuticalandBiologicalSciences，UniversityofSouthChina,HengyangHunan421001,China; 3.AierEyeHospitalofHengyang，HengyangHunan421001，China;4.theFirstPeople′sHospitalofChangde,ChangdeHunan415000，China;5.NeurimPharmaceuticalsLtd，Israel)

Aim To explore the effect of Neu-P11, a novel melatonin agonist with similar function of melatonin, on IOP of acute high IOP animals and the related mechanism. Methods The experiment used the Trendelenburg position(head low feet high position of 80°) to establish acute high IOP model. Rats were placed in the Trendelenburg position and used Tonopen XL contact tonometer to measure IOP (every 5 minutes measured once IOP, and the maximum value in 20 minutes) in 8 ∶00～9 ∶00 am. And then, thirty Sprague-Dawley rats(8 week-old) were divided into five groups: normal IOP+normal saline, high IOP+normal saline, high IOP+10 mg·kg-1Mel, high IOP+20 mg·kg-1Neu-P11, high IOP+50 mg·kg-1Neu-P11.Put in a flat to rest 2 h, animals were placed in Trendelenburg position again and then, IOP was measured every hour in the flat by 6 hours. After excessive sodium pentobarbital administration continuous for 1 week, the serum was collected and stored for subsequent detection at the end of the experiment. The level of MDA, SOD and GSH-Px enzyme activity of the rat serum was tested by kit accordingly. HE staining method was used to identify the SD rat retinal morphological changes.Results Trendelenburg position could induce IOP of model group rats, which was increased by 202.9%(P<0.01) and the content of MDA, reduced the activity of SOD and GSH-Px enzyme, retinal thickening was observed and its level was not clear. Neu-P11/Mel could significantly improve oxidative stress level and retinal edema in rats.Conclusion Neu-P11 could reduce IOP of the acute high IOP animals, which might be involved in the lower level of oxidative stress in the body.

Neu-P11; melatonin; intraocular pressure; Trendelenburg position; malondialdehyde;superoxide dismutase; glutathion peroxidase

2016-12-07,

2017-01-08

湖南省自然科學(xué)基金資助項目(No 14JJ2084)；湖南省教育廳基金項目(No 15C1203)；湖南省衛(wèi)生計生委基金(No C2015-19)；南華大學(xué)‘蒸湘學(xué)者計劃′資助(Xiangyang Tang)

石金鳳(1977-)，女，博士生，研究方向：糖尿病的分子機制，E-mail：759843257@qq.com； 張 瑤(1991-)，女，碩士，研究方向：糖尿病的分子機制，通訊作者，E-mail：909878558@qq.com

時間：2017-4-24 11:20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1120.020.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.010

A

1001-1978(2017)05-0637-05

R-332；R322.91；R770.426；R775；R977.1