李 敏，韓 艷，王華林，王義雯，李 靜，王 斌

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 ，陜西 西安 712046)

基于TLR4-NF-κB 的柴胡黃芩水煎液抑制CCl4誘導(dǎo)大鼠肝星狀細(xì)胞激活作用機(jī)制研究

李 敏，韓 艷，王華林，王義雯，李 靜，王 斌

(陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 ，陜西 西安 712046)

目的 探討柴胡黃芩水煎液(CQ)對(duì)CCl4誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)激活的作用及機(jī)制。方法 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HSC，在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，以1.5×109·L-1濃度接種到培養(yǎng)板中過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)分組如下：空白對(duì)照組(無(wú)藥物處理)，CCl4誘導(dǎo)組(6 mmol·L-1CCl4作用6 h)，給藥組(6 mmol·L-1CCl4作用6 h后，再用400、500、600 mg·L-1的CQ作用24 h)，TLR4阻斷劑TAK-242、NF-κB阻斷劑BAY 11-7082組(6 mmol·L-1CCl4作用6 h后，再用TAK-242 10 mol·L-1、BAY 11-7082 2 mol·L-1作用24 h)。處理之后，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)培養(yǎng)基中透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase，HA)、層黏連蛋白(laminin，LN)、Ⅲ型前膠原(procollagen Ⅲ，PCⅢ)、Ⅳ型膠原(collagen type Ⅳ，Ⅳ-C)濃度，RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞中Toll樣受體4(Toll-like receptors 4，TLR4)、核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)基因的表達(dá)，應(yīng)用Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中TLR4、NF-κB蛋白的表達(dá)。結(jié)果 研究發(fā)現(xiàn)，與CCl4干預(yù)組比較，CQ量效相關(guān)性降低CCl4誘導(dǎo)的HSC增殖。600 mg·L-1的CQ可以明顯降低HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C細(xì)胞釋放水平及TLR4、NF-κB基因、蛋白的表達(dá)。NF-κB抑制劑TAK-242、BAY 11-7082也可降低CCl4造成的HSC增殖，HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C細(xì)胞釋放水平及NF-κB基因、蛋白表達(dá)，不能下調(diào)TLR4基因、蛋白表達(dá)。結(jié)論 CQ可以抑制CCl4誘導(dǎo)的炎癥因子基因、蛋白表達(dá)，減輕肝纖維化相關(guān)指標(biāo)的含量，其作用機(jī)制可能與TLR4-NF-κB轉(zhuǎn)錄活性及蛋白活性相關(guān)，提示其在抗肝纖維中的作用及機(jī)制。

肝纖維化；柴胡-黃芩水煎液；HSC；CCl4誘導(dǎo)；TLR4；NF-κB

肝纖維化是多種肝損傷發(fā)展過(guò)程中的一種病理狀態(tài),肝纖維化過(guò)程中肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)持續(xù)激活是肝纖維化發(fā)展過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。HSC在多種因素刺激后被激活轉(zhuǎn)換成為肌成纖維樣細(xì)胞，細(xì)胞大量增殖，合成細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)并在肝臟過(guò)度沉積,產(chǎn)生肝纖維化[1]。課題組前期研究表明，柴胡黃芩配伍水煎液(CQ)對(duì)大鼠肝纖維化模型有良好的保護(hù)作用[2]，對(duì)四氯化碳(CCl4)損傷L02細(xì)胞有良好的保護(hù)作用[3]。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步觀察柴胡黃芩水提液對(duì)HSC增殖的影響以及干預(yù)CCl4誘導(dǎo)活化HSC的作用。從體內(nèi)TLR4-NF-κB信號(hào)通路的角度闡釋柴胡黃芩水煎液抗肝纖維化的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6，購(gòu)自灝洋生物公司；改良型RPMI 1640培養(yǎng)基，購(gòu)自博士德生物科技公司；胎牛血清，購(gòu)自Hyclone公司；胰酶，購(gòu)自Trypsin。TAK-242購(gòu)自 InvivoGen 公司；BAY 11-7082購(gòu)自江蘇碧云天生物工程公司；透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase，HA)、層黏連蛋白(laminin，LN)、Ⅲ型前膠原(procollagen Ⅲ，PCⅢ)、Ⅳ型膠原(collagen type Ⅳ，Ⅳ-C)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京永輝生物科技有限公司；TLR4、NF-κB p65一抗、二抗購(gòu)自武漢博士德生物工程公司。CO2培養(yǎng)箱:新加坡ESCO；倒置顯微鏡: 奧特BDS200；酶標(biāo)儀: 美國(guó)BioTek ELx808；離心機(jī): 湘儀L530；雙人型超凈工作臺(tái)：新加坡ESCO。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

1.2.1 柴胡黃芩配伍水提液 中藥材柴胡和黃芩購(gòu)自陜西中醫(yī)藥大學(xué)校醫(yī)院中藥房，經(jīng)鑒定為正品。參照文獻(xiàn)及前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，稱(chēng)取柴胡50 g和黃芩25 g，用水浸泡30 min后，以8倍水煎煮2次，將2次水提液混勻濃縮至75 mL。

1.2.2 CCl4溶液的制備 將100 μL CCl4與100 μL DMSO混勻，再用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋?zhuān)蛊浣K濃度為6 mmol·L-1。

1.3 大鼠HSC培養(yǎng)及藥物處理 大鼠肝星狀細(xì)胞株(HSC-T6)于改良型RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%的胎牛血清、100 kU·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素)，37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并傳代。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HSC，在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，以1.5×109·L-1濃度接種到培養(yǎng)板中過(guò)夜。實(shí)驗(yàn)分組如下：空白對(duì)照組(無(wú)藥物處理)，CCl4誘導(dǎo)組(6 mmol·L-1CCl4作用6 h)，給藥組(6 mmol·L-1CCl4作用6 h后，再用400、500、600 mg·L-1的CQ作用24 h)，TLR4阻斷劑TAK-242、NF-κB阻斷劑BAY 11-7082組(6 mmol·L-1CCl4作用6 h后，再用TAK-242 10 mol·L-1、BAY 11-7082 2 mol·L-1作用24 h)。

1.4 CQ對(duì)CCl4誘導(dǎo)活化的HSC增殖的影響 各組培養(yǎng)24 h后，加入5 g·L-1MTT 10 μL，37℃孵育4 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入DMSO 150 μL,低速震蕩10 min，以溶解被還原的MTT結(jié)晶，酶標(biāo)儀單波長(zhǎng)檢測(cè)各孔吸光度值，按下列公式計(jì)算大鼠HSC增殖抑制率。細(xì)胞抑制率/%=[1-(實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值)]×100%。

1.5 CQ對(duì)CCl4誘導(dǎo)活化的HSC分泌HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的影響 各組培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，參照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)，應(yīng)用ELISA法檢測(cè)HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C含量。

1.6 CQ對(duì)CCl4誘導(dǎo)活化的HSC細(xì)胞TLR4和NF-κB p65的mRNA水平的影響 各組培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，胰酶消化收集，至少以1×106個(gè)為樣本檢測(cè)量。孵育24 h后抽提細(xì)胞總RNA，去除DNA污染后，通過(guò)RT-PCR的方法，檢測(cè)TLR4和NF-κB p65 mRNA表達(dá)，PCR引物序列見(jiàn)Tab 1。

Tab 1 Primer sequences for RT-PCR

1.7 CQ對(duì)CCl4誘導(dǎo)活化的HSC中TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響 各組培養(yǎng)24 h后，棄去上清液，胰酶消化收集，PBS洗滌2次，加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑充分裂解，4 ℃、12 000 r·min-1離心30 min。取上清，BCA試劑盒蛋白定量，細(xì)胞總蛋白加上樣緩沖液煮沸變性，用10% SDS-PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后，用5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫雜交2 h，洗膜后，加入ECL發(fā)光液，進(jìn)行檢測(cè)，觀察結(jié)果并掃描分析。TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)水平用目的條帶積分吸光度值(integrated absorbance，IA)與內(nèi)參GAPDH蛋白條帶的IA比值定量表示。

2 結(jié)果

2.1 CQ對(duì)CCl4誘導(dǎo)活化的HSC增殖的影響 與空白對(duì)照組比較，CCl4干預(yù)后，明顯促進(jìn)HSC增殖(P<0.01)，CQ對(duì)CCl4誘導(dǎo)的HSC增殖具有明顯抑制作用，特別是劑量為600 mg·L-1時(shí)，作用最為明顯；TAK-242和BAY 11-7082也對(duì)CCl4誘導(dǎo)的HSC增殖具有明顯抑制作用。見(jiàn)Tab 2。

GroupDoseODvalueNormal-0．32±0．14??CCl46mmol·L-10．54±0．08CQ600mg·L-10．33±0．06??500mg·L-10．36±0．07?400mg·L-10．40±0．08?TAK?24210mol·L-10．31±0．15?BAY11?70822mol·L-10．33±0．10??

*P<0.05,**P<0.01vsCCl4group

2.2 CQ對(duì)CCl4誘導(dǎo)活化的HSC分泌HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的影響 與空白對(duì)照組比較，CCl4干預(yù)后，HSC細(xì)胞分泌的HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C含量明顯升高，CQ、TAK-242 和BAY 11-7082對(duì)CCl4誘導(dǎo)的HSC細(xì)胞分泌的HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C具有明顯抑制作用，特別是CQ劑量為600 mg·L-1時(shí)，作用最為明顯。見(jiàn)Tab 3。

2.3 RT-PCR檢測(cè)大鼠HSC中TLR4和NF-κB p65 mRNA表達(dá) 與空白對(duì)照組比較，CCl4干預(yù)后，HSC中TLR4和NF-κB p65 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，CQ和BAY 11-7082對(duì)CCl4誘導(dǎo)的HSC細(xì)胞TLR4和NF-κB p65 mRNA表達(dá)有下調(diào)作用，TAK-242對(duì)CCl4誘導(dǎo)的HSC細(xì)胞NF-κB p65 mRNA表達(dá)有下調(diào)作用，其中CQ 600 mg·L-1組、TAK-242和BAY 11-7082組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)Tab 4。

2.4 Western blot法檢測(cè)HSC中TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá) 與空白對(duì)照組比較，CCl4干預(yù)后，HSC中TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)增強(qiáng)，CQ、TAK-242對(duì)CCl4誘導(dǎo)的HSC中TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)有下調(diào)作用，BAY 11-7082對(duì)CCl4誘導(dǎo)的HSC中NF-κB p65蛋白表達(dá)有下調(diào)作用，其中CQ 600 mg·L-1、TAK-242和BAY 11-7082組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)Tab 5、Fig 1。

GroupDoseHA/μg·L-1Ⅳ?C/μg·L-1LN/μg·L-1PCⅢ/μg·L-1Normal-234．26±29．64??10．69±2．01??42．67±6．28??80．21±7．61??CCl46mmol·L-1498．36±98．0825．34±2．6471．25±10．21142．65±9．92CQ600mg·L-1326．94±72．06?11．54±2．90??46．42±12．03??89．29±10．24??500mg·L-1376．22±69．49?15．02±2．87?56．15±9．52?115．39±10．04?400mg·L-1473．67±72．8423．64±2．9159．21±11．65138．57±11．68TAK?24210mol·L-1259．26±59．37??12．89±2．98?43．24±9．87??90．21±12．54??BAY11?70822mol·L-1309．18±81．65?11．03±1．24??40．21±10．24??84．15±9．34??

*P<0.05,**P<0.01vsCCl4group

GroupDoseNF?κBTLR4Normal-20．90±0．50?38．32±2．83?CCl46mmol·L-124．37±0．4742．40±1．55CQ600mg·L-121．34±1．92?40．02±0．03?500mg·L-122．46±0．1842．01±1．19400mg·L-123．45±0．1844．00±0．63TAK?24210mol·L-121．45±1．20?42．19±0．82BAY11?70822mol·L-123．24±0．08?41．19±3．10?

**P<0.01,*P<0.05vsCCl4group

GroupDoseNF?κBTLR4Normal-0．35±0．00?0．20±0．01?CCl46mmol·L-10．80±0．020．60±0．02CQ600mg·L-10．14±0．03??0．16±0．01??500mg·L-10．24±0．02?0．18±0．00?400mg·L-10．61±0．010．16±0．04?TAK?24210mol·L-10．18±0．03?0．14±0．02??BAY11?70822mol·L-10．15±0．02??0．52±0．01

*P<0.05,**P<0.01vsCCl4group

Fig 1 Effect of CQ on protein expressions of TLR4,NF-κB in HSC

1: Normal group; 2: CCl4group; 3: CQ 600 mg·L-1group; 4: CQ 500 mg·L-1group; 5: CQ 400 mg·L-1group; 6: TAK-242; 7:BAY 11-7082

3 討論

TLR4是細(xì)胞表面識(shí)別病原相關(guān)分子的一個(gè)重要識(shí)別受體，該受體激活后能通過(guò)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活其下游的NF-κB，導(dǎo)致炎性介質(zhì)大量釋放，引起肝臟損害[4-6]。經(jīng)刺激活化的HSC是肝纖維化ECM的主要來(lái)源細(xì)胞。HSC在多種因素刺激后被激活轉(zhuǎn)換成為肌成纖維樣細(xì)胞,細(xì)胞大量增殖，合成ECM,并在肝內(nèi)過(guò)量沉積,發(fā)生肝纖維化，可見(jiàn)，TLR4-NF-κB信號(hào)通路異常與肝損傷關(guān)系密切[7-8]。文獻(xiàn)研究[9-11]及課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，柴胡黃芩配伍水煎劑有明顯防治大鼠肝纖維化作用，其體內(nèi)調(diào)控機(jī)制可能與TLR4-NF-κB信號(hào)通路調(diào)控的炎癥反應(yīng)有關(guān)[1]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究柴胡黃芩配伍水煎劑對(duì)HSC增殖影響，及對(duì)CCl4誘導(dǎo)活化后的HSC的分泌功能、TLR4和NF-κB p65基因及蛋白表達(dá)的影響，探討其抗肝纖維化可能的作用機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HSC經(jīng)CCl4激活，大量增殖,其培養(yǎng)液中HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C含量明顯高于空白對(duì)照組?？梢?jiàn)，CCl4對(duì)HSC增殖有一定激活作用，導(dǎo)致肝纖維化相關(guān)因子HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C分泌增加，表現(xiàn)出肝纖維化傾向。給予CQ干預(yù)后，HSC增殖受到一定抑制，并且HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C含量也降低，可見(jiàn)，CQ有一定抗肝纖維化作用。通過(guò)RT-PCR法和Western blot法檢測(cè)CCl4活化后的HSC中TLR4和NF-κB p65 mRNA及蛋白的表達(dá)，與空白組比較，TLR4和NF-κB p65 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均明顯增加，CQ干預(yù)后，TLR4和NF-κB p65 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)均明顯降低，其中CQ 600 mg·L-1時(shí)作用最為明顯。同時(shí)，應(yīng)用TLR4的拮抗劑TAK-242后，TLR4和NF-κB p65 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)明顯降低，而應(yīng)用NF-κB p65拮抗劑BAY 11-7082后，NF-κB p65 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)也明顯降低，TLR4 mRNA表達(dá)和蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯變化?？梢?jiàn)，CQ能夠減輕CCl4激活HSC的增殖，并降低肝纖維化因子HA、LN、PCⅢ、Ⅳ-C的含量，其作用機(jī)制之一是通過(guò)調(diào)控TLR4-NF-κB信號(hào)通路，具體的調(diào)控機(jī)制，還需進(jìn)一步研究。

(致謝：本文實(shí)驗(yàn)在陜西中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)科研實(shí)驗(yàn)中心完成，在整個(gè)研究過(guò)程中得到了王宇老師、史迎莉的悉心指導(dǎo)和熱忱幫助，在此次深表謝意！)

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Inhibitory effects ofBupleurumchinense-Scutellariabaicalensisdecoction on activation of rat HSC induced by CCl4

LI Min, HAN Yan, WANG Hua-lin,WANG Yi-wen,LI Jing,WANG Bin
(CollegeofPharmacy,ShanxiUniversityofChineseMedicine,Xian712046,China)

Aim To investigate the inhibitory effect ofBupleurumchinense-Scutellariabaicalensisdecoction(CQ) on activation of rat HSC induced by CCl4and the mechanism.Methods Cells in logarithmic growth phase were cultured in culture medium without FBS for 24 h.After disassociated using 0.25% EDTA-trypsin, the cells were seeded into respective plates at the density of 1.5×109· L-1and cultured overnight. The cells were divided into the following groups:control group(no treatment)，model group(treated with 6 mmol·L-1CCl4for 24 h)，CQ groups(pretreated with 6 mmol·L-1CCl4for 24 h and 400,500,600 mg·L-1CQ for 24 h). Concentrations of hyaluronidase(HA), laminin(LN), procollagen Ⅲ(PCⅢ),collagen type Ⅳ(Ⅳ-C) were assayed by ELISA kits. Gene expressions of Toll-like receptor 4 (TLR4) and NF-κB were examined by RT-PCR analysis. Protein expression of TLR4 and NF-κB was examined by Western blot.Results CQ could significantly inhibit cell proliferation induced by CCl4. Furthermore, CQ at 600 mg·L-1significantly downregulated gene and protein expressions of TLR4 and NF-κB. And CQ reduced the secretion of HA,LN,PCⅢ,Ⅳ-C. Further studies disclosed that the TLR4 inhibitor TAK-242 and NF-κB inhibitor BAY 11-7082 could significantly inhibit the gene and protein expressions of NF-κB，but could not change gene and protein expression of TLR4,and reduced the secretion of HA,LN,PCⅢ,Ⅳ-C. Conclusion CQ could inhibit inflammatory responses in HSC induced by CCl4probably by inhibiting the transcription activity and protein expression of TLR4-NF-κB, which indicates its possible therapeutic effect on liver fibrosis.

liver fibrosis;Bupleurumchinense-Scutellariabaicalensisdecoction; HSC; induced by CCl4; TLR4; NF-κB

2016-12-28,

2017-01-22

陜西省科技廳項(xiàng)目(No 2013jk4023)； 陜西省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目(No zy06)；陜西省教育廳項(xiàng)目(No 12JK1016)

李 敏(1978-)，女，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥基礎(chǔ)理論，E-mail：413159921@qq.com； 王 斌(1978-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中醫(yī)藥抗腦缺血，通訊作者，E-mail：wangbin812@126.com

時(shí)間：2017-4-24 11:21

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1121.052.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.026

A

1001-1978(2017)05-0729-04

R-332；R282.71；R283.6；R322.47；R392.11；R575.2；R977.6