司春楓，魯美鈺，王巧云，仲維蘭，周 玲，楊小平，徐茂磊

(濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院“方劑效應(yīng)與臨床評價”國家中醫(yī)藥管理局重點實驗室，山東 煙臺 264003)

VEGF融合蛋白疫苗聯(lián)合環(huán)磷酰胺抗小鼠H22肝癌實驗研究

司春楓，魯美鈺，王巧云，仲維蘭，周 玲，楊小平，徐茂磊

(濱州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院“方劑效應(yīng)與臨床評價”國家中醫(yī)藥管理局重點實驗室，山東 煙臺 264003)

血管內(nèi)皮生長因子；抗血管生成；環(huán)磷酰胺；蛋白疫苗；H22肝癌；腫瘤聯(lián)合治療

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)都與腫瘤新生血管密切相關(guān)，因此，抗血管生成療法已成為腫瘤治療的一種重要手段[1-2]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是特異性最強的一種血管生長因子，VEGF特異性抑制劑Avastin等抗血管治療藥物作為腫瘤臨床治療的輔助用藥顯示了良好的治療效果，但因其半衰期短、價格昂貴以及非人源化單克隆抗體應(yīng)用時會出現(xiàn)的人抗鼠抗體反應(yīng)(human anti-mouse antibody reaction, HAMA reaction)等缺陷，限制了其在臨床上的應(yīng)用。

主動免疫的方法可以通過依靠自身機體產(chǎn)生特異性的抗VEGF免疫反應(yīng)，抑制腫瘤血管的生成，達到抗腫瘤目的。但是，在胚胎發(fā)育初期機體已對VEGF產(chǎn)生免疫耐受，免疫原性較弱，難以誘導(dǎo)有效的免疫應(yīng)答[3]。針對VEGF免疫原性較弱的特點，我們前期將破傷風(fēng)毒素2個強T細胞輔助表位618～627位肽段和831～838位肽段替換hVEGF121的1～8位和115～121位2個肽段，構(gòu)建了hVEGF121突變體I，并在突變體Ⅰ的基礎(chǔ)上，通過加端PCR方法將熱休克蛋白mHSP70分子中具有免疫激活調(diào)節(jié)作用的407～426片段串聯(lián)2次，以柔性肽連接于hVEGF121突變體Ⅰ的C末端，構(gòu)建了hVEGF121突變體Ⅱ。實驗證實，hVEGF121突變體Ⅱ蛋白疫苗激發(fā)機體產(chǎn)生了較強的針對VEGF的免疫應(yīng)答，顯示了一定的抗腫瘤作用[4-5]。

臨床上，血管生成抑制劑主要用于與化療聯(lián)合的腫瘤綜合治療方案，但關(guān)于主動治療的VEGF蛋白疫苗與化療聯(lián)用的報道仍較少。在本實驗中，我們選用肝癌的一線化療藥物環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)作為研究對象，進一步考察hVEGF121突變體Ⅱ蛋白疫苗與低劑量CTX聯(lián)用能否產(chǎn)生抗腫瘤協(xié)同增效的作用，并初步研究該協(xié)同增效的作用機制，期望可以為VEGF蛋白疫苗的進一步臨床開發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物與細胞株 ♂ BALB/c小鼠，4～5周齡，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK-(軍)2012-007；小鼠H22肝癌細胞購自中國科學(xué)院上海細胞所，在本實驗室培養(yǎng)保存。

1.1.2 試劑 環(huán)磷酰胺注射液，由江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，批號：國藥準字H32020857；RPMI 1640培養(yǎng)基，購自美國Hyclone公司；細胞培養(yǎng)用胎牛血清，購自杭州四季青生物工程材料研究所；細胞培養(yǎng)用青霉素鏈霉素混合液、TMB單組份顯色液，購自北京索萊寶科技有限公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記兔抗小鼠IgG抗體、DAB顯色試劑盒，購自北京中杉金橋生物科技有限公司；其他試劑均為市售。

1.2 方法

1.2.1 H22皮下移植瘤模型建立 將24只4～5周齡的♂ BALB/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分成4組，每組6只，分別為PBS空白對照組、環(huán)磷酰胺組(CTX)、hVEGF121突變體Ⅱ疫苗組(V2)和環(huán)磷酰胺與hVEGF121突變體Ⅱ疫苗聯(lián)合(V2+CTX)組。調(diào)整H22肝癌細胞濃度為1×1010·L-1，每只小鼠右肋皮下接種100 μL腫瘤細胞懸液，建立H22肝癌皮下移植瘤模型。

1.2.2 治療性免疫策略 分別于接種腫瘤后的d 2、6、12，V2組及V2+CTX組每只小鼠左肋皮下免疫V2疫苗100 μL，劑量為0.5 g·L-1；CTX組及V2+CTX組腹腔注射CTX 100 μL，劑量為30 mg·kg-1，空白對照組注射等量PBS。成瘤后，隔天測量腫瘤大小，按公式V=0.52×長徑×短徑2計算腫瘤體積；接種腫瘤后的d 15處死所有小鼠，剝?nèi)∧[瘤，測量瘤重并拍照，并對腫瘤組織切片進行HE染色，處死前眼眥靜脈叢取血分離各組小鼠血清，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)對免疫血清抗VEGF抗體水平檢測 用純化的VEGF融合蛋白為抗原，將其溶解在碳酸鹽緩沖液中，每孔100 μL，4℃過夜包被96孔酶標板。每孔加1 ∶50倍稀釋的小鼠免疫血清，37℃孵育2 h，PBST洗滌后，加1 ∶100 000倍稀釋的HRP標記的兔抗小鼠IgG抗體，TMB顯色，酶標儀450 nm波長下檢測吸光度值。

1.2.4 蛋白免疫印跡(Western blot)法對免疫血清抗VEGF抗體特異性檢測 將純化的VEGF融合蛋白進行15%的SDS-PAGE分離。以1 ∶50倍稀釋的小鼠免疫血清為一抗，以1 ∶10 000倍稀釋的HRP標記的兔抗小鼠IgG抗體為二抗進行Western blot，檢測小鼠免疫血清中抗VEGF抗體的特異性。采用DAB顯色試劑盒顯色，對特異性條帶進行分析。

1.2.5 皮內(nèi)瘤血管生成模型建立 將12只4～5周齡的♂ BALB/c小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分成4組，每組3只，分別為PBS空白對照組、CTX組、V2組以及V2+CTX組。按預(yù)防性免疫策略進行免疫，連續(xù)免疫4周，第4次免疫結(jié)束后接種皮內(nèi)腫瘤。在接種皮內(nèi)瘤的前1天，將各組小鼠腹部毛發(fā)刮去；每只小鼠皮內(nèi)接種50 μL濃度為1×1010·L-1的H22腫瘤細胞懸液，建立皮內(nèi)瘤血管生成模型。接種腫瘤細胞后，每天觀察腫瘤生長情況，待瘤塊鼓起約5～6 mm時，處死小鼠，剝離腹部外層皮膚，顯微鏡下觀察瘤塊附近的血管分布情況，包括主血管和分支血管，并計數(shù)。

1.2.6 安全性考察 在治療性動物實驗過程中，對小鼠的飲食及日常行為進行檢測，并稱量體重。實驗結(jié)束后，取各組小鼠心、肝、脾、肺、腎等臟器，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，進行HE染色，200倍光學(xué)顯微鏡下觀察是否對臟器有明顯毒副作用。

2 結(jié)果

2.1 治療性免疫中V2聯(lián)合CTX協(xié)同抗肝癌增效作用 如Fig 1所示，與PBS組相比，CTX組、V2組以及聯(lián)合治療組對皮下移植瘤均有一定的抑制作用(P<0.05)，其中聯(lián)合治療組抑制作用最明顯，與V2組及CTX組差別均有顯著性(P<0.05)。瘤重結(jié)果也顯示，聯(lián)合治療組平均瘤重明顯低于V2組及CTX組(P<0.05vsV2,P<0.01vsCTX)。以上實驗結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺與融合蛋白V2疫苗聯(lián)用可起到協(xié)同抗腫瘤增效作用。

2.2 腫瘤組織HE染色觀察 為了進一步確證聯(lián)合治療方案的抗腫瘤效果，我們對剖取的各組腫瘤進行HE染色觀察。如Fig 2所示，PBS組腫瘤生長情況良好，細胞結(jié)構(gòu)完整，血供較豐富，V2疫苗組、CTX組及聯(lián)合治療組均出現(xiàn)了不同程度的腫瘤組織壞死(壞死區(qū)域如圖中箭頭所示)，其中聯(lián)合組腫瘤壞死情況最明顯，這進一步說明了聯(lián)合治療方案顯示了最強的抗腫瘤作用。

2.3 小鼠免疫血清中抗VEGF抗體水平測定 為了考察化療藥CTX的引入能否抑制V2蛋白疫苗引起的抗-VEGF體液免疫應(yīng)答，我們采用ELISA的方法檢測了免疫小鼠血清中的抗-VEGF抗體產(chǎn)生情況。如Fig 3A所示，V2組及聯(lián)合治療組血清中的抗體水平較PBS組及CTX組明顯升高(P<0.01)，而V2與CTX聯(lián)合治療組與V2組抗體水平相當(dāng)，兩者間差異并無顯著性，這說明CTX的引入并不會對V2蛋白疫苗造成免疫抑制。

2.4 小鼠免疫血清中抗VEGF抗體的特異性測定

采用Western blot的方法確定小鼠免疫血清中所產(chǎn)生抗體的特異性。如Fig 3B所示，在第2泳道分子量為20 ku處出現(xiàn)一明顯條帶，此條帶為抗VEGF抗體所產(chǎn)生的特異性條帶，說明小鼠免疫血清中所產(chǎn)生抗體是VEGF的特異性抗體。

Fig 1 Therapeutic antitumor effect induced by V2 and CTX in subcutaneous H22 hepatocellular carcinoma-bearing mice

A: Schematic diagram of the immunization procedure; B:Invivomeasurement of tumor growth; C: Subcutaneous tumor excised from mice; D: Weight of tumor from mice.*P<0.05,**P<0.01vsCTX;#P<0.05vsV2

Fig 2 Histopathology study of tumor tissues(×200)

A：PBS；B：V2；C：CTX；D：V2+CTX

Fig 3 Detection of anti-VEGF humoral immune responses

A: The level of specific anti-VEGF antibody; B: Western blot analysis of the specificity of anti-VEGF antibody. Lane 1: Prestained protein molecular marker; Lane 2: Target protein of VEGF.**P<0.01vsCTX.

2.5 V2聯(lián)合CTX抑制小鼠H22肝癌血管生成作用 我們采用皮內(nèi)腫瘤血管模型進一步考察了聯(lián)合治療方案對腫瘤新生血管的影響。與PBS相比，3個治療組腫瘤周圍血管數(shù)都有相應(yīng)減少(Fig 4)，其中聯(lián)合治療組對腫瘤新生血管的抑制作用最為明顯，與單獨的V2及CTX組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05vsV2,P<0.01vsCTX)，這說明聯(lián)合治療方案產(chǎn)生了協(xié)同抗血管生成作用。

2.6 安全性考察 實驗過程中，小鼠的飲食情況、日常行為及毛發(fā)特征未見明顯變化，各組小鼠體質(zhì)量也未見有明顯差別。處死動物后，各組小鼠心、肝、脾、肺、腎等臟器表面均色澤鮮亮，無黏連等器質(zhì)性變化，臟器HE染色結(jié)果也顯示各組動物的臟器無明顯組織病理學(xué)變化(Fig 5)。

3 討論

目前，應(yīng)用于臨床的VEGF抑制劑主要為單克隆抗體和小分子受體抑制劑，但因其半衰期短需長期用藥、毒副作用大、造價昂貴等缺點，限制了其在臨床上的應(yīng)用。主動免疫方式的疫苗可激發(fā)機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生持續(xù)的靶向腫瘤新生血管的免疫反應(yīng)，避免了長期用藥的缺陷，同時蛋白疫苗制備工藝簡單，可規(guī)?；a(chǎn)，能夠大幅度降低患者的治療成本[6]。 研究顯示[7-10]，持續(xù)低劑量的化療藥物可增加抗血管生成藥物對腫瘤微血管的靶向性，有效降低免疫抑制，與抗血管生成藥物聯(lián)用有協(xié)同增效的作用，抗血管生成藥物也多被應(yīng)用于腫瘤綜合治療方案中。我們前期研究中，開發(fā)了一種分子佐劑優(yōu)化的重組VEGF蛋白疫苗，該疫苗在動物實驗中顯示了較好的抗腫瘤作用。在本實驗中，為進一步研究該蛋白疫苗，我們將該分子佐劑優(yōu)化的VEGF蛋白疫苗與低劑量化療藥CTX聯(lián)用，擬考察兩者聯(lián)用能否產(chǎn)生聯(lián)合增效作用。

Fig 4 Effects of V2 and CTX on tumor induced angiogenesis

A: Blood vessels around the intradermal tumor; B: Numbers of blood vessels around intradermal tumor.1: PBS; 2: V2; 3: CTX; 4. V2+CTX.**P<0.01vsCTX;#P<0.05vsV2

Fig 5 A general toxicity observation(HE staining，×200)

實驗結(jié)果顯示，在抑制腫瘤生長和血管生成方面，V2疫苗與低劑量CTX存在協(xié)同增效作用。聯(lián)合用藥組小鼠腫瘤體積、瘤重均低于單一給藥組，抑瘤率達到84.32%，明顯優(yōu)于單一給藥組的78.80%(P<0.05vsV2)和15.84%(P<0.05vsCTX)；同時，在皮內(nèi)腫瘤血管模型中，聯(lián)合組較各單藥組更好地抑制了腫瘤新生血管的形成。安全性考察實驗發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合治療方案的毒副作用較單一給藥組并沒有明顯增加,實驗小鼠的耐受性良好。本實驗的結(jié)果證實，VEGF蛋白疫苗聯(lián)合CTX治療方案有應(yīng)用于臨床以延長肝癌患者生存時間的潛力，有潛在的開發(fā)價值。

(致謝：本文主要在濱州醫(yī)學(xué)院新藥技術(shù)開發(fā)中心實驗室完成，在此對實驗室各位老師和同學(xué)的幫助表示感謝！)

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Improved antitumor efficacy by combination treatment with recombined VEGF protein vaccine and cyclophosphamide in H22 hepatocellular carcinoma bearing-mice

SI Chun-feng,LU Mei-yu, WANG Qiao-yun, ZHONG Wei-lan, ZHOU Ling, YANG Xiao-ping, XU Mao-lei
(KeyLaboratoryofTraditionalChineseMedicinePrescriptionEffectandClinicalEvaluationofStateAdministrationofTraditionalChineseMedicine,SchoolofPharmacy,BinzhouMedicalUniversity,YantaiShandong264003,China)

Aim To investigate the antitumor and antiangiogenic effects of combined low-dose cyclophosphamide(CTX)and recombined VEGF protein vaccine.Methods In this experiment, H22 hepatocellular carcinoma model was established in BALB/c mice. Mice were randomly divided into four groups: control group, CTX group(CTX), VEGF protein vaccine group(V2) and CTX plus V2 group(CTX+V2). The anti-tumor efficacy and antiangiogenic effect were investigated using a subcutaneous tumor model and an intradermal tumor model. Western blot and ELISA were further adopted to detect the specific anti-VEGF antibody.Results CTX+V2 group displayed a lower tumor volume and tumor weight than either the single therapy group in the subcutaneous tumor model(P<0.05vsV2,P<0.01vsCTX). Meanwhile, CTX+V2 was more effective for antagonizing tumor-associated angiogenesis compared with either the single therapy(P<0.05vsV2,P<0.01vsCTX). After CTX+V2 immunization, high titer of anti-VEGF antibody was detected by ELISA and verified by Western blot.Conclusion The therapy of CTX combined with V2 has significant synergistic effect against H22 hepatocellular carcinoma.

vascular endothelial growth factor; anti-angiogenesis; cyclophosphamide; protein vaccine; H22 hepatocellular carcinoma; cancer combined therapy

2017-02-10,

2017-03-11

國家自然科學(xué)基金資助項目(No 81541158)；山東省優(yōu)秀中青年科學(xué)家科研獎勵基金(No BS2014YY051)；山東省自然科學(xué)基金資助項目(No ZR2015PH002)；山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃(No 2014WS0479)；山東省高等學(xué)校科技計劃(No J15LM51)

司春楓(1989-)，男，碩士生，研究方向：腫瘤免疫治療，E-mail:scfmaple@163.com; 魯美鈺(1990-)，女，碩士生，研究方向：腫瘤免疫治療，共同第一作者，E-mail:1395028295@qq.com; 楊小平(1962-)，男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：腫瘤免疫藥理學(xué)，通訊作者，E-mail:yangxiaoping@bzmc.edu.cn； 徐茂磊(1985-)，男，博士，講師，研究方向：腫瘤免疫治療，通訊作者，E-mail:xumaolei1234@163.com

時間：2017-4-24 11:20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1120.012.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.006

A

1001-1978(2017)05-0617-05

R-332；R730.51；R735.705；R977.6；R979.1摘要：目的 探討分子佐劑修飾的VEGF融合蛋白疫苗與低劑量環(huán)磷酰胺(CTX)能否產(chǎn)生協(xié)同抗肝癌作用。方法 建立小鼠H22肝癌模型，將BALB/c小鼠隨機分為4組：生理鹽水對照組、CTX單藥組、VEGF蛋白疫苗單藥組(V2組)、V2與CTX聯(lián)合治療組(V2+CTX)。分別在H22肝癌皮下移植瘤及皮內(nèi)腫瘤模型中評價聯(lián)合治療方案抗腫瘤生長及抗血管生成的能力，并通過Western blot及ELISA方法檢測抗-VEGF抗體水平。結(jié)果 皮下移植瘤模型結(jié)果顯示V2+CTX聯(lián)合治療組的腫瘤體積、平均瘤重低于各單藥治療組(P<0.05vsV2,P<0.01vsCTX)；在皮內(nèi)腫瘤血管模型中，聯(lián)合治療對腫瘤新生血管的抑制作用最為明顯，與單獨的V2及CTX組相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05vsV2,P<0.01vsCTX)；Western blot及ELISA的結(jié)果顯示，V2+CTX聯(lián)合治療誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生了高水平的特異性抗-VEGF抗體。結(jié)論 低劑量CTX與重組VEGF融合蛋白疫苗聯(lián)合治療有協(xié)同抗肝癌作用。