支亦博,章 潔,郭偉兵,陳春龍,李文君,劉清珍,劉 健,李偉彥

(1.南方醫(yī)科大學(xué)南京臨床醫(yī)學(xué)院，2.南京軍區(qū)總醫(yī)院麻醉科，江蘇 南京 210002)

前扣帶回皮層中趨化因子CX3CL1對于大鼠慢性病理性疼痛的影響

支亦博1,2,章 潔2,郭偉兵1,2,陳春龍2,李文君1,2,劉清珍2,劉 健2,李偉彥2

(1.南方醫(yī)科大學(xué)南京臨床醫(yī)學(xué)院，2.南京軍區(qū)總醫(yī)院麻醉科，江蘇 南京 210002)

目的 觀察大鼠在慢性疼痛時，前扣帶回皮層(anterior cingulate cortex，ACC)中趨化因子CX3CL1的表達對于膠質(zhì)細胞活化的影響。方法 本實驗采用大鼠左側(cè)眶下神經(jīng)結(jié)扎模型(unilateral infraorbital nerve，CCI-ION)。80只♂SD大鼠隨機分為4組(n=20),分別為假手術(shù)組、疼痛組、PBS治療對照組、CX3CL1中和抗體治療組。假手術(shù)組僅暴露大鼠左側(cè)眶下神經(jīng)，不予結(jié)扎；疼痛組暴露大鼠左側(cè)眶下神經(jīng)并結(jié)扎。這2組分別于1、3、5、7、14 d早晨9 ∶00進行行為學(xué)測試，并且于行為學(xué)測試完成之后處死大鼠，取其前扣帶回皮層，分別比較趨化因子CX3CL1和CD11b(小膠質(zhì)細胞標記物)的表達水平。PBS治療對照組是在眶下神經(jīng)結(jié)扎術(shù)后CX3CL1表達水平最高的當(dāng)天10 ∶00進行大鼠前扣帶回皮層給藥，給予PBS溶液。CX3CL1中和抗體治療組與PBS治療對照組同一天、同時間于大鼠前扣帶回皮層給予CX3CL1中和抗體。兩組于給藥后6 h進行行為學(xué)測試，并于行為學(xué)測試完畢后處死大鼠，取前扣帶回皮層組織，Western blot分別檢測其中CD11b、CX3CL1、白細胞介素1β(IL-1β)的蛋白表達水平。結(jié)果 各組大鼠術(shù)前行為學(xué)測試差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；假手術(shù)組、疼痛組術(shù)后兩組相同時間行為學(xué)測試發(fā)現(xiàn)，疼痛組大鼠左側(cè)V2區(qū)痛閾明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；兩組給藥組給藥后行為學(xué)測試發(fā)現(xiàn)給予CX3CL1中和抗體后，大鼠痛閾有明顯提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 前扣帶回皮層可能通過膠質(zhì)細胞和趨化因子參與對慢性神經(jīng)痛的調(diào)節(jié)。

慢行病理性疼痛；眶下神經(jīng)結(jié)扎；前扣帶回皮層；小膠質(zhì)細胞；趨化因子CX3CL1；CD11b

慢性病理性疼痛已經(jīng)成為近代困擾人類健康和生命質(zhì)量的一個重要的問題，其主要表現(xiàn)為痛覺過敏及痛覺超敏，其產(chǎn)生機制主要包括神經(jīng)源性炎癥反應(yīng)、外周及中樞敏化、神經(jīng)元可塑性改變等等，目前應(yīng)用傳統(tǒng)藥物難以有效控制[1]。很多研究都顯示脊髓中膠質(zhì)細胞的大量激活參與了慢性病理性疼痛的發(fā)生和發(fā)展，活化的膠質(zhì)細胞可以釋放多種神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)和細胞外信號分子以影響神經(jīng)元細胞，引起神經(jīng)元的異常放電，導(dǎo)致病理學(xué)疼痛[2,12]。Verge等[3]發(fā)現(xiàn)脊髓中神經(jīng)元細胞可以表達趨化因子CX3CL1，并且其在神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞之間的信號傳導(dǎo)起到了重要的作用[4]。以上皆是對于脊髓中膠質(zhì)細胞對于慢性疼痛的影響的研究，而對不同腦區(qū)膠質(zhì)細胞的作用知之甚少。本實驗重點研究前扣帶回皮層(anterior cingulate cortex，ACC)中膠質(zhì)細胞和CX3CL1對于慢性病理學(xué)疼痛的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 清潔級成年♂SD大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)實驗科提供。實驗所執(zhí)行的操作均符合國際疼痛研究會的準則，并且經(jīng)動物倫理委員會許可。將大鼠隨機分為4組：假手術(shù)組(sham組)、疼痛模型組(CCI-ION組)、PBS治療對照組(PBS組)、CX3CL1中和抗體治療組(anti-CX3CL1 組)，每組20只。

1.2 眶下神經(jīng)結(jié)扎模型(unilateral infraorbital nerve，CCI-ION) 大鼠腹腔注射2%的戊巴比妥鈉50 mg·kg-1。將麻醉后大鼠仰臥并固定其頭部與四肢，沿其左側(cè)第一磨牙牙齦邊緣縱向切開約1 cm的切口，分離暴露眶下神經(jīng)及周圍組織，約1.5 mm粗細。從近端仔細分離眶下神經(jīng)至遠端的眶下孔，使用兩根3.0的鉻腸線疏松結(jié)扎眶下神經(jīng)，要求視力下眶下神經(jīng)直徑略微變細，但尚不阻斷神經(jīng)外膜血液循環(huán)。2個結(jié)扎點相距2 mm。術(shù)后使用5.0縫合線縫合傷口。假手術(shù)組僅暴露眶下神經(jīng)，不結(jié)扎，術(shù)后同樣縫合傷口。

1.3 前扣帶回皮層單次給藥 大鼠腹腔注射2%的戊巴比妥鈉50 mg·kg-1，麻醉后將其固定于立體定向儀上，齒桿前上緣低于耳桿中心3.3 mm，將顱頂皮膚剃毛消毒。切開顱頂筋膜，暴露Bregma點，左側(cè)前扣帶回皮層進針點位于Bregma點前2.6 mm，向左旁開0.6 mm，進針深度為1.6 mm。使用5 μL的微量注射器給藥，10 min緩慢將藥劑注入ACC，并且于給藥完畢5 min后退針。給藥后，使用酒精消毒傷口，石蠟封閉傷口，最后縫合傷口處皮膚。

1.4 給藥方案 anti-CX3CL1組于CCI-ION術(shù)后d 5使用5 μL微量注射器于前扣帶回皮層單次給予CX3CL1中和抗體(50 mmol; R&D Systems)。CX3CL1中和抗體是一種單克隆抗體，它可以特異性地與ACC區(qū)中CX3CL1相結(jié)合，減少CX3CL1與小膠質(zhì)細胞的接觸，進而減弱CX3CL1對小膠質(zhì)細胞的作用。中和抗體未使用時被保存于-80 ℃冰箱中，使用時，將抗體溶于0.9%的無菌生理鹽水，通過實驗給藥劑量測試，發(fā)現(xiàn)每只大鼠給予0.1 pmol的中和抗體，即可產(chǎn)生理想的抑制作用，所以每只大鼠使用0.1 pmol的中和抗體單次給藥。PBS組給予相同劑量的PBS溶液作為對照。本實驗給藥劑量參考文獻[5]。

1.5 行為學(xué)測定 Sham組與CCI-ION組分別于CCI-ION術(shù)后1、3、5、7、14 d，固定于早9 ∶00，將大鼠放置于安靜室內(nèi)，靜置30 min，待其安靜后，選擇不同折力(2.0、4.0、6.0、8.0、15、26、60 g)Von Fery纖維絲(Stoleing公司，美國)分別對大鼠左側(cè)眶下V2區(qū)(即觸須部皮膚及其周邊長毛的部位)進行刺激，每次刺激持續(xù)3～5 s，若其出現(xiàn):① 快速的后退動作，倦縮身子向籠壁靠攏，或?qū)㈩^面部藏于身下，躲避刺激物；② 攻擊行為：快速抓咬刺激物;③ 非對稱性的面部搔抓：至少連續(xù)3次搔抓面部刺激區(qū)域的動作，通常合并后退動作。出現(xiàn)以上3種行為中的1種，即可視為陽性反應(yīng)。anti-CX3CL1組及PBS組分別于給藥后6 h使用Von Fery測痛儀測定術(shù)后大鼠左側(cè)V2區(qū)痛閾，方法同上。

1.6 標本采集 Sham組與CCI-ION組大鼠于1、3、5、7、14 d行為學(xué)測試完后，腹腔注射2%的戊巴比妥鈉80 mg·kg-1處死，取大鼠ACC區(qū)組織。用于Western blot檢測的標本用300～400 mL生理鹽水快速沖洗血液，之后取出前扣帶回皮層腦組織快速放入液氮中保存；用于免疫熒光檢測的標本則再用400～500 mL的4%多聚甲醛先快后慢地灌注，取出ACC區(qū)腦組織，將其放入4%的多聚甲醛中后固定3 h，隨后轉(zhuǎn)入30%蔗糖中脫水2 d。anti-CX3CL1組及PBS組分別于給藥6 h后行為學(xué)測試，測試完以后處死，取ACC區(qū)腦組織。用于Western blot檢測的標本和用于免疫熒光檢測的標本處理方法同上。

1.7 Western blot 用含蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和PMSF的RIPA裂解液將前扣帶回皮層組織進行勻漿。蛋白定量煮樣后，配制SDS-PAGE凝膠，每孔上樣量50 μg(10 μL)，電泳，轉(zhuǎn)膜，用質(zhì)量分數(shù)為5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h，加一抗:兔抗大鼠CX3XL1(1 ∶1 000，Abcam)、兔抗大鼠CD11b(1 ∶800，Abcam)或者兔抗大鼠IL-1β(1 ∶400, R&D)，4℃孵育過夜。d 2，TBST洗5 min×6次，羊抗兔二抗(1 ∶1 000，Cell Signaling Technology)室溫孵育1 h，TBST洗5 min×6次，暗室內(nèi)加顯色底物，顯色曝光，掃描。內(nèi)參為β-actin(1 ∶1 000，Cell Signaling Technology)。掃描之后蛋白條帶用Image J軟件分析，以目的條帶灰度值與內(nèi)參蛋白的比值反映目的蛋白表達的相對水平，進行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠行為學(xué)變化 5組大鼠術(shù)前行為學(xué)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。CCI-ION組大鼠與sham組比較，d 1兩組大鼠痛閾都降低，但從d 3開始，可見CCI-ION組較sham組大鼠有明顯痛閾降低(P<0.05)，見Fig 1；anti-CX3CL1組與PBS組相比，痛閾明顯提高(P<0.05)，同時與sham組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見Fig 2。

Fig 1 Changes of EF50/g in all rats

*P<0.05vssham group

Fig 2 Changes of EF50/g in all rats

*P<0.05vsPBS group

2.2 大鼠前扣帶回皮層趨化因子CX3CL1與CD11b表達變化 CCI-ION術(shù)后d 5，與sham組相比，ACC中趨化因子CX3CL1蛋白的含量明顯提高(P<0.05)，見Fig 3；給予中和抗體以后，可見anti-CX3CL1組CD11b及IL-1β較PBS組有明顯降低(P<0.05)，見Fig 4。

Fig 3 Expression of CX3CL1 in ACC

On the d 5,compared with sham group,the expression of CX3CL1 in the ACC of rats was significantly increased in CCI-ION group.*P<0.05vssham group

2.3 大鼠前扣帶回皮層小膠質(zhì)細胞免疫熒光變化 免疫熒光結(jié)果顯示，sham組ACC中活化的小膠質(zhì)細胞CD11b表達量較少；與sham組相比，CCI-ION組活化的小膠質(zhì)細胞明顯增加，CD11b表達量明顯較多；給予CX3CL1中和抗體以后，anti-CX3CL1組ACC中CD11b表達量明顯較PBS組減少，見Fig 5。

Fig 4 Expression of CX3CL1 and IL-1β in ACC

Compared with the sham group,the expression of CX3CL1 and IL-1β was significantly increased in CCI-ION group. Also both of them were significantly decreased in anti-CX3CL1 group after given antibody.*P<0.05vssham group;#P<0.05vsCCI-ION group

Fig 5 The different expression of CD11b in ACC of rats

A:Sham;B:CCI-ION;C:anti-CX3CL1;D:PBS.Compared with sham group,the immunoreactivity of CD11b in ACC of rats was markedly increased in CCI-ION group and PBS group,while compared with CCI-ION group,the immunoreactivity was markedly decreased in anti-CX3CL1 group

3 討論

近年來，研究發(fā)現(xiàn)趨化因子在膠質(zhì)細胞的活化及神經(jīng)病理性疼痛中發(fā)揮著重要作用。趨化因子CX3CL1是一種低分子量的蛋白，它可以刺激細胞分泌炎性介質(zhì)，促進炎癥反應(yīng)同時還可以調(diào)控細胞的遷徙。Milior等[10]發(fā)現(xiàn)在慢性疼痛的大鼠模型中，脊髓背角神經(jīng)細胞可以釋放CX3CL1直接調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的活性，促進其活化；激活的小膠質(zhì)細胞可以激活p-p38 MAPK 活化[13]，同時可以進一步釋放其他炎性因子，如IL-1β、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、谷氨酸鹽等刺激神經(jīng)元細胞，導(dǎo)致痛覺高敏[6]；而CX3CR1基因敲除大鼠的小膠質(zhì)細胞釋放的前炎性細胞因子蛋白量都減少，同時病理性疼痛也輕很多[7]。這些都說明在脊髓水平，慢性病理性刺激可以促使神經(jīng)元細胞釋放CX3CL1，激活小膠質(zhì)細胞，進而導(dǎo)致痛覺高敏。

本實驗是為了觀察大鼠ACC中趨化因子CX3CL1對于神經(jīng)病理性疼痛的影響。我們采用眶下神經(jīng)結(jié)扎模型，相對于其他神經(jīng)痛模型，本模型傷口愈合時間短，炎癥反應(yīng)少，同時不影響大鼠的活動能力，增加了大鼠的存活率，也減少了大鼠因造模的巨大創(chuàng)傷而引起的個體之間的誤差，同時提高了行為學(xué)測試的準確度。

我們從以上行為學(xué)測試結(jié)果可以看出，sham組和CCI-ION組相比較，經(jīng)過前2 d的急性疼痛期，從d 3開始，CCI-ION組大鼠痛閾明顯降低，并且呈持續(xù)狀態(tài)，直至d 5痛閾達到最低，此后慢慢恢復(fù)，但是d 14閾值仍然低于sham組。這個結(jié)果與Western blot結(jié)果相對應(yīng)，Western blot顯示，術(shù)后d 3，大鼠ACC中CX3CL1蛋白表達量明顯增加，d 5達到高峰，隨后慢慢減少。這些結(jié)果說明在ACC中，CX3CL1的增加可能參與了慢性病理性疼痛的過程。

為了明確ACC中CX3CL1和小膠質(zhì)細胞活化之間的關(guān)系和它是否能夠影響慢性病理性疼痛的產(chǎn)生和發(fā)展，本實驗追加采用了2組給藥組，一組給予CX3CL1中和抗體，用于拮抗CX3CL1的作用；另一組給予PBS溶液作為對照。2組溶液均在CX3CL1表達量最高的當(dāng)天給予，最大程度地抑制CX3CL1的表達，給予藥物后6 h進行行為學(xué)測試。結(jié)果顯示，PBS組大鼠給藥后痛閾與給藥以前相比變化不大，而anti-CX3CL1組大鼠痛閾有較大提升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明CX3CL1的增多可以增加大鼠的痛覺高敏。

我們已知正常的神經(jīng)細胞也可以表達CX3CL1，而它的受體CX3CR1正表達于小膠質(zhì)細胞膜上[8]，CX3CL1的大量表達會引起小膠質(zhì)細胞的活化。Sheridan等[9]也發(fā)現(xiàn)CX3CL1是神經(jīng)元細胞調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的一個非常重要的途徑，敲除CX3CR1基因后，神經(jīng)細胞便不能再調(diào)控小膠質(zhì)細胞的形態(tài)[10]，進一步也不能影響小膠質(zhì)細胞炎性介質(zhì)的釋放。因此，我們猜測ACC區(qū)CX3CL1參與慢性病理性疼痛的機制也與小膠質(zhì)細胞相關(guān)，所以在給予中和抗體后，我們對ACC區(qū)CD11b進行免疫熒光標記，CD11b通常被認為是活化的小膠質(zhì)細胞的標志[6]。免疫熒光結(jié)果顯示，給予中和抗體以后，活化的小膠質(zhì)細胞較給藥前有明顯減少；PBS組變化不大。說明在ACC區(qū)，CX3CL1增多確實會激活小膠質(zhì)細胞。

上文中提到小膠質(zhì)細胞可以釋放大量炎性介質(zhì)，其中炎性介質(zhì)IL-1β的大量釋放可以刺激前列腺素E2(PGE2)的表達，增強中樞谷氨酸鹽的轉(zhuǎn)運和神經(jīng)突觸的攝取[11]，這些物質(zhì)都可以增加痛覺高敏。因此，我們也對給藥后大鼠ACC區(qū)IL-1β的蛋白表達量進行測試。Western blot結(jié)果顯示，使用中和抗體后6 h，CX3CL1蛋白表達量較之前有明顯降低，同時CD11b蛋白表達量也降低，IL-1β蛋白表達量也較PBS區(qū)降低。以上實驗結(jié)果都說明抑制CX3CL1蛋白的表達，可以減少小膠質(zhì)細胞的活化，減少小膠質(zhì)細胞釋放炎性介質(zhì)IL-1β，同時減弱大鼠的慢性病理性疼痛。

綜上所述，疏松結(jié)扎大鼠眶下神經(jīng)可以引起大鼠ACC區(qū)CX3CL1蛋白表達增加，同時促進ACC區(qū)小膠質(zhì)細胞的活化，進一步釋放炎性介質(zhì)，從而引起神經(jīng)病理性疼痛。使用拮抗劑阻斷CX3CL1的表達，減弱小膠質(zhì)細胞活化，有望成為臨床治療慢性病理性疼痛的新的方式。

(致謝:本實驗在南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科麻醉科實驗室完成，在此衷心感謝各位老師和同學(xué)的幫助!)

[1] Maruo T, Nakae A, Maeda L, et al. Validity, reliability, and assessment sensitivity of the Japanese version of the short-form McGill pain questionnaire 2 in Japanese patients with neuropathic and non-neuropathic Pain[J].PainMed, 2014, 15(11):1930-7.

[2] de Jong E K, Dijkstra I M, Hensens M, et al. Vesicle-mediated transport and release of CCL21 in endangered neurons: a possible explanation for microglia activation remote from a primary lesion[J].JNeurosci, 2005, 25(33):7548-57.

[3] Verge G M, Milligan E D, Maier S F, et al. Fractalkine(CX3CL1) and fractalkine receptor(CX3CR1) distribution in spinal cord and dorsal root ganglia under basal and neuropathic pain conditions[J].EurJNeurosci, 2004, 20(5):1150-60.

[4] Milligan E D, Sloane E M, Watkins L R. Glia in pathological pain: a role for fractalkine[J].JNeuroimmunol, 2008, 198(1-2):113-20.

[5] Wei F, Guo W, Zou S, et al. Supraspinal glial-neuronal interactions contribute to descending pain facilitation[J].JNeurosci, 2008, 28(42):10482-95.

[6] Chang E Y, Chen X, Sandhu A, et al. Spinal 5-HT3 receptors facilitate behavioural hypersensitivity induced by elevated calcium channel alpha-2-delta-1 protein[J].EurJPain, 2013,17(4): 505-13.

[7] Hinwood M, Tynan R J, Charnley J L, et al. Chronic stress induced remodeling of the prefrontal cortex: structural re-organization of microglia and the inhibitory effect of minocycline[J].CerebCortex, 2013, 23(8):1784-97.

[8] Limatola C, Ransohoff R M. Modulating neurotoxicity through CX3CL1/CX3CR1 signaling[J].FrontCellNeurosci, 2014, 8:229.

[9] Sheridan G K, Murphy K J. Neuron-glia crosstalk in health and disease: fractalkine and CX3CR1 take centre stage[J].OpenBiol, 2013, 3(12):130181.

[10]Milior G, Lecours C, Samson L, et al. Fractalkine receptor deficiency impairs microglial and neuronal responsiveness to chronic stress[J].BrainBehavImmun, 2015, 55:114-25.

[11]Yang S, Liu Z W, Wen L, et al. Interleukin-1beta enhances NMDA receptor-mediated current but inhibits excitatory synaptic transmission[J].BrainRes, 2005, 1034(1-2):172-9.

[12]Belsky J, Pluess M. Beyond diathesis stress: differential susceptibility to environmental influences[J].PsycholBull, 2009, 135(6):885-908.

[13]王 芬, 劉清珍, 劉 健,等. 脊髓脂質(zhì)運載蛋白-2對大鼠嗎啡耐受形成的影響[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2015,31(4):565-9.

[13]Wang F, Liu Q Z, Liu J, et al. Effect of spinal cord lipocalin-2 on development of morphine tolerance in normal rats[J].ChinPharmacolBull, 2015,31(4):565-9.

Effects of chemokine on chronic neuropathic pain in anterior cingulate cortex

ZHI Yi-bo1,2,ZHANG Jie2, GUO Wei-bing1,2,CHEN Chun-long2, LI Wen-jun1,2, LIU Qing-zhen2, LIU Jian2, LI Wei-yan2
(1.NanjingClinicalCollegeofSouthernMedicalUniversity,2.DeptofAnesthesiology,JinlingHospital,Nanjing210002,China)

Aim To investigate the effects of chemokine in the anterior cingulate cortex(ACC) of rats on the chronic neuropathic pain.Methods A model of trigeminal neuropathic pain was made by chronic constriction injury to the unilateral infraorbital nerve(CCI-ION). Eighty male Sprague-Dawley rats were randomly assigned into 4 groups(n=20): the sham group, the control group, the PBS treatment group and the anti-CX3CL1 treatment group. The unilateral infraorbital nerve was just exposed in the sham group; in the control group, the unilateral infraorbital nerve was exposed and ligated. The behavioral test was measured at 9 ∶00 am on day 1, 3 ,5, 7, 14 after surgery separately. These rats were executed after behavioral tests, then tissues of ACC were removed to compare the protein expression levels of CX3CL1 and CD11b in two groups. The PBS solution and the CX3CL1 neutralizing antibody were injected into the ACC separately at 10 ∶00 am on the day with the highest level of CX3CL1 protein expression in the PBS treatment group and the anti-CX3CL1 treatment group. The behavioral test was measured 6 h later after the injection, and the tissue of ACC was removed to measure the protein expression levels of CX3CL1, CD11b and IL-1β of the two groups.Results At baseline, there was no significant difference in the feeling threshold among the four groups(P<0.05).Compared with the sham group, there was a significant reduction in the feeling threshold in the ipsilateral ION territory from 3 d to 14 d after CCI-ION in the control group(P<0.05). Rats given antibody in the anti-CX3CL1 treatment group showed an evident increase of the feeling threshold compared with the PBS group(P<0.05).Conclusion The ACC may take part in the chronic neuropathic pain via associating with the activated microglial cell and high-level of CX3CL1 expression.

chronic neuropathic pain; CCI-ION;ACC; microglial cell; CX3CL1; CD11b

2017-02-20,

2017-03-15

江蘇省自然科學(xué)基金資助項目(No BK20131328)

支亦博(1991-)，女，碩士生，研究方向：趨化因子與慢性病理性疼痛，E-mail：375719649@qq.com; 李偉彥(1965-)，男，博士，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，研究方向：麻醉與鎮(zhèn)痛的基礎(chǔ)與臨床，通訊作者，E-mail：weiyanlee@sina.cn

時間：2017-4-24 11:20

http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170424.1120.014.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.05.007

A

1001-1978(2017)05-0622-05

R-332；R322.81；R441.1；R741.02