趙美榮+李永春+劉輝+秦海強

摘要：以5個抗旱性不同的小麥品種為試驗材料，分析了干旱脅迫下小麥擴展蛋白活性與其抗旱性之間的相關性，同時檢測了6個不同的擴展蛋白基因在干旱脅迫下的表達情況。結果表明，擴展蛋白活性與小麥抗旱性之間的相關性達98.7%，且基因TaEXPA3的表達受干旱脅迫調節(jié)，與小麥抗旱性密切相關。

關鍵詞：小麥；擴展蛋白；活性；基因表達；抗旱性

中圖分類號：S512.01 文獻標志碼：A 文章編號：1002—1302（2016）01—0108—03

作為細胞壁蛋白，擴展蛋白（expansins）是一種細胞壁松弛酶，調節(jié)細胞壁的伸展性，是調節(jié)“酸生長”的關鍵因子。序列分析表明，擴展蛋白有一個龐大的基因家族，主要可分為expansin A（EXPA）、expansin B（EXPB）、expansin-like A（EXLA）和expansin-like B（EXLB）4個亞家族，其中EXPA、EXPB亞型是植物中存在的主要擴展蛋白。不同家族成員行使不同的功能，包括種子的萌發(fā)、根毛的起始和延長、莖和葉的生長、果實成熟、器官脫落、氣孔運動等，幾乎參與調節(jié)植物生長發(fā)育的整個過程。

隨著研究的不斷深入，擴展蛋白的抗逆性功能被逐漸發(fā)掘，成為當前研究的熱點之一。研究發(fā)現(xiàn)，擴展蛋白在植物抵御干旱逆境方面起著非常重要的作用。干旱條件下，水稻通過根尖細胞壁伸展維持根的繼續(xù)生長，而這種細胞壁的伸展主要是由擴展蛋白引起的。Jones等研究發(fā)現(xiàn)，復蘇植物C.plantagineum葉片細胞壁在干旱條件下擴展能力明顯增強，其擴展蛋白的活性也相應地提高。徐筱等分析了不同翦股穎草坪草品種在干旱環(huán)境下AsEXP1基因的表達，發(fā)現(xiàn)AsEXP1的表達與草坪草品種的抗旱性呈顯著正相關關系。

作為世界性糧食作物，小麥的生長和產量常常受到干旱逆境的影響，其擴展蛋白也越來越受到關注。目前研究已知，小麥擴展蛋白是一個多基因家族，在小麥生長和發(fā)育過程中起著重要的作用。已有研究表明，在水分脅迫下，小麥胚芽鞘擴展蛋白基因表達和細胞壁擴展活性增強，過量表達小麥擴展蛋白基因的煙草抗旱性提高。為進一步了解擴展蛋白與小麥抗旱性的關系，本研究分析了5個不同抗旱性的小麥品種擴展蛋白活性、基因表達特性與其抗旱性的相關性，以探討擴展蛋白抵御干旱脅迫的能力。

1材料與方法

1.1材料與處理

1.1.1植物材料 本研究采用5種不同抗旱性的小麥（Triticum aestivum L.）品種，抗旱性強的小麥有昌樂5號、HF9703；中度抗旱的小麥有魯麥21；干旱敏感型小麥有濟南13、921842。取萌發(fā)期胚芽鞘、幼苗期葉片進行試驗。

擴展蛋白活性檢測材料為黃瓜（中農8號），取下胚軸用于試驗。

1.1.2材料培養(yǎng) 小麥胚芽鞘的培養(yǎng)：小麥種子經消毒（0.1%HgCl₂浸泡5 min，流水沖洗6 h）和催芽處理后，挑選30粒均勻一致的小麥種子，放置在鋪有雙層濾紙的培養(yǎng)皿中暗培養(yǎng)24 h；然后加25%PEG-6 000（-1.13MPa）模擬干旱處理（對照為正常水培），24 h后測量胚芽鞘長度。

小麥幼苗培養(yǎng)：挑選均勻一致的小麥種子，經消毒后，放在被水潤濕的濾紙上發(fā)芽24 h，然后將發(fā)芽的種子有序地放進盛有石英砂的塑料盆（高8 cm，直徑10 cm）中，在溫度為（25±1）℃、光/暗周期為14 h/lO h條件下進行沙培，每天澆灌Hoagland營養(yǎng)液。當培養(yǎng)至小麥3葉1心時進行干旱脅迫處理，用25%PEG-6000模擬干旱脅迫處理，以正常營養(yǎng)液作為對照（CK）。3 d后，剪取其葉片用于試驗測定。

黃瓜下胚軸培養(yǎng)：黃瓜種子經浸種和催芽（27℃、1 d）后，栽入濕蛭石中，在27℃下暗培養(yǎng)5 d，剪取子葉下約3 cm長的下胚軸，用于試驗測定。

1.1.3酶及生化試劑 RNA提取試劑盒、Taq酶、反轉錄試劑盒等均為寶生物工程（大連）有限公司產品。

1.1.4 PCR引物 PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列來源于文獻[10]，具體引物序列如下：

1.2試驗萬法

1.2.1小麥葉片細胞壁擴展蛋白的提取擴展蛋白提取參照McQueen-Mason等的方法進行。隨機采取100 g小麥幼苗葉片，經勻漿、提取、離心、沉淀、回溶等步驟，獲得擴展蛋白粗提液，-80℃保存、備用。

1.2.2擴展蛋白活性測定采用體外重組法進行擴展蛋白活性測定。以-20℃下冰凍保存的黃瓜下胚軸為底物，檢測熱失活的下胚軸在擴展蛋白提取液中的伸展活性，以此來表示擴展蛋白活性。儀器采用植物組織伸展測定儀，參考高強的方法，自行組裝。

1.2.3 RT-MR檢測擴展蛋白基因的表達 利用RNA提取試劑盒提取總RNA，然后進行反轉錄，得到cDNA。再按下列程序進行PCR反應：94℃1 min，55～65℃50 s（不同的引物退火溫度不同），72℃1 min，30個循環(huán)。擴增所用引物見“1.1.4”節(jié)，所用內參為Tubulin，引物為Tubulinl、Tubulin2。在相同的條件下進行以上PCR擴增，擴增產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳分析，用Lab Assistant TM Gel 3000 Series凝膠成像分析儀檢測條帶亮度，對反轉錄產物進行RT-PCR半定量分析。

1.2.4統(tǒng)計分析 所有試驗測定均為3次或3次以上重復，試驗結果的表示形式均為3次或3次以上重復試驗的“平均值±標準差”。采用DPS軟件（浙江大學）進行統(tǒng)計分析。根據(jù)所測定的試驗項目選用多因素或雙因素進行方差分析。采用Duncans新復極差法進行多重比較。

2結果與分析

2.1小麥品種的抗旱性鑒定

研究表明，低水勢下胚芽鞘的長度可以作為小麥抗旱性鑒定的一個生理指標，成為小麥抗旱性鑒定的一個快速有效的方法，干旱條件下胚芽鞘長的小麥品種抗旱性強。因此，本研究利用胚芽鞘法對5個小麥品種——抗旱性強的昌樂5號、HF9703，中等抗旱的魯麥21以及不抗旱的濟南13、921842的抗旱性進行鑒定。結果發(fā)現(xiàn)，5個小麥品種的胚芽鞘長度依次為昌樂5號>HF9703>魯麥21>濟南13>921842（表1），這與生產上公認的品種抗旱性相一致。

2.2干旱脅迫下不同抗旱性小麥品種擴展蛋白活性

擴展蛋白作為一種細胞壁蛋白，在細胞伸長生長方面起著重要的作用，其促進細胞壁伸展的能力常用來表示擴展蛋白活性大小。研究表明，在干旱脅迫下，擴展蛋白活性增強，有利于提高植物的抗旱性。擴展蛋白活性檢測有2種不同的方法，一種是直接檢測活體植物細胞壁的酸伸展性，來表示植物本身內源擴展蛋白活性；另一種是通過重組法檢測提取的擴展蛋白活性。本研究采用重組法，利用黃瓜下胚軸為媒介，檢測了抗旱性不同的小麥幼苗擴展蛋白活性。結果如圖1所示，在正常水分條件下，抗旱性不同的小麥擴展蛋白活性不同，抗旱性強的昌樂5號、HF9703的擴展蛋白活性顯著高于干旱敏感性的濟南13、921842，昌樂5號擴展蛋白活性幾乎是921842的1.5倍；中等抗旱的魯麥21的擴展蛋白活性介于中間水平。在水分脅迫下，5個小麥品種擴展蛋白活性均明顯增強，尤其是昌樂5號、HF9703，其活性分別增加了33.0%、30.5%。

為了進一步明確擴展蛋白活性與小麥抗旱性的相關性，本研究分析了兩者之間的相關系數(shù)，結果發(fā)現(xiàn)，擴展蛋白活性與小麥胚芽鞘長度之間的相關系數(shù)達98.7%，其相關性極顯著。這些結果表明，擴展蛋白活性與小麥對水分脅迫的響應密切相關，且與小麥的抗旱性有一定關系。

2.3不同抗旱性小麥擴展蛋白基因表達對干旱脅迫的響應

自擴展蛋白被發(fā)現(xiàn)以來，已有大量關于擴展蛋白基因表達及功能研究的報道，小麥擴展蛋白也備受關注。Lin等已經從小麥中克隆了18個擴展蛋白基因，包括9個EXPA、9個EXPB基因。本研究從其中選擇了6個擴展蛋白基因，包括3個EXPA基因TaEXPA1、TaEXPA2、TaEXPA3，3個EXPB家族擴展蛋白基因TaEXPB1、TaEXPB7、TaEXPB9，通過RT-PCR分析，檢測了這些擴展蛋白基因在小麥幼苗葉片中的表達情況以及對干旱脅迫的響應。結果發(fā)現(xiàn)，6個基因在小麥幼苗葉片中均有不同程度的表達，這與Lin等的結果一致，但表達特性不盡相同（圖2）。在正常水分條件下，TaEX-PA1、TaEXPA2、TaEXPB1、TaEXPB7的表達在不同小麥品種中沒有明顯的差異；TaEXPA3的表達具有明顯的品種效應，即在抗旱性強的品種昌樂5號、HF9703中表達量較高，而在干旱敏感性的濟南13、921842中的表達較弱；而TaEXPB9的表達與小麥品種的抗旱性沒有明顯的規(guī)律性。在受到水分脅迫處理后，擴展蛋白基因的表達受到不同程度的影響，TaEXPA1、TaEXPB1的表達比正常水分條件下的增加，但在品種間沒有差異；TaEXP42的表達在昌樂5號、HF9703中的表達高于正常水分條件，但在魯麥21、濟南13、921M2中的表達與對照相比沒有明顯的差別；TaEXPB7的表達與對照相比差異不明顯，且無品種問差異；TaEXPB9的表達仍然沒有明顯的規(guī)律性；與品種抗旱性有一定關系的TaEXPA3的表達在干旱脅迫下明顯增加，而且不同品種增加的程度不同，這與小麥抗旱性呈一定的正相關關系。結果表明，小麥中不同的擴展蛋白基因可能行使不同的功能，因此其表達特性也有所不同。但確實有些基因，如TaEXPA3的表達可能與小麥的抗旱性有一定關系。

3結論與討論

擴展蛋白在植物生長過程中起著重要的調節(jié)作用，而且與植物抗旱性密切相關。因此，本研究以抗旱性不同的小麥品種為材料，研究其擴展蛋白活性、基因表達特性在不同品種問的差異以及干旱脅迫后的變化，分析了擴展蛋白與小麥抗旱性之間的關系。

不同抗旱性小麥品種擴展蛋白活性不同，具體表現(xiàn)為：昌樂5號>HF9703>魯麥21>濟南13>921842，與其抗旱性強弱相一致。而且在干旱脅迫條件下，擴展蛋白活性明顯增強，增強程度也因品種抗旱性不同而不同，其活性與品種抗旱性之間的相關系數(shù)達98.7%?；虮磉_分析結果表明，小麥擴展蛋白基因是一個多基因家族，不同成員表達特性不同，可能行使不同的功能?；騎aEXPA3的表達在干旱脅迫下上調，且與品種抗旱性相關，表明干旱脅迫誘導的擴展蛋白活性的提高與擴展蛋白表達上調有關，這與先前報道的其他植物擴展蛋白相一致。玉米擴展蛋白在水分脅迫下根維持生長中起著重要作用，Sabirzhanova等分析發(fā)現(xiàn)，干旱條件下玉米葉片中擴展蛋白基因轉錄水平提高；翦股穎擴展蛋白基因AsEXP1在干旱條件下的表達與品種的抗旱性呈顯著正相關。這些結果表明，干旱脅迫通過誘導擴展蛋白基因表達上調，提高擴展蛋白活性，這對于維持干旱條件下細胞的伸長生長、提高植物抗旱性是有利的。

總之，擴展蛋白作為一種細胞壁蛋白，它在植物抗逆性方面的作用越來越受到關注，其作用機理還有待于進一步研究。