李金蓉, 廉美蘭, 于 垚， 劉冠甫， 蔣曉龍， 樸炫春

(延邊大學農學院，吉林 延吉 133002)

光照強度對狼爪瓦松愈傷組織有效物質積累的影響

李金蓉, 廉美蘭, 于 垚， 劉冠甫， 蔣曉龍， 樸炫春*

(延邊大學農學院，吉林 延吉 133002)

以狼爪瓦松種子誘導的愈傷組織為材料，研究了光照強度對愈傷組織生物量及黃酮積累的影響。結果表明:光照強度為15～30 (mol·cm-2·s-1)時，有利于狼爪瓦松愈傷組織鮮重和干重的增加；對于狼爪瓦松中酚的積累，光照強度為15 (mol·cm-2·s-1)時，其含量(17.4 mg/g DW)及生產量(68.53 mg/L)最高。而當光照強度達到30 (mol·cm-2·s-1)時，可得到最高的多糖含量(125.8 mg/g DW)和生產量(615.05 mg/L)。對于黃酮類物質，光照強度為15 (mol·cm-2·s-1)時，最有利于山奈酚-3-O-蕓香糖苷的積累，而槲皮素、山奈素、表兒茶素沒食子酸酯和異槲皮苷的積累在光照強度為30 (mol·cm-2·s-1)時最佳；總黃酮的含量(3 816.6 mg/g DW)和生產量(18 654.0 mg/L)在光照強度30 (mol·cm-2·s-1)時達到最大值。因此，光照強度是狼爪瓦松愈傷組織有效物質積累和生物量增加的影響因素之一，在愈傷組織培養(yǎng)時將光照強度調節(jié)為30 (mol·cm-2·s-1)較為適宜。

光照強度；愈傷組織；多糖；酚；黃酮

狼爪瓦松(Orostachyscartilagineus)為景天科瓦松屬2年生草本藥用植物[1-4]。多生于山坡巖石上，主要產于山東、內蒙古、遼寧、吉林和黑龍江等地區(qū)。狼爪瓦松全株可藥用，具有抗病毒、抗菌[5-7]等作用，其化學成分十分復雜，主要成分有黃酮類、糖類、多酚等。

黃酮類物質是植物的重要次生代謝產物，是具有開發(fā)前景的天然抗氧化劑，能有效地減少和清除自由基，具有延緩人體衰老、防治疾病的作用[8]。隨著食品工業(yè)的發(fā)展與消費觀念的改變，具有天然活性成分的保健食品成為現代人追逐的目標，其中黃酮類化合物以純天然、高活性、見效快、作用廣泛等特點受到人們的關注[9]。目前，因過度采摘，狼爪瓦松野生資源逐漸減少，且人工栽培體系尚不完善，因此，其資源利用和開發(fā)受到限制[10]。

利用植物細胞培養(yǎng)工程手段，通過培養(yǎng)細胞、組織和器官的方式生產有效代謝產物逐漸引起人們的關注，這種方式可做為獲取原材料的另一途徑[11]。生物反器不受季節(jié)性或區(qū)域性的限制，為植物生長和代謝提供完整的理化指標，為植物提供最佳的生長環(huán)境。具主要應用于代謝產物生產、生物轉化、快速繁殖和人工種子等方面。它可實現大量生產植物細胞、組織和器官的目的[12]。影響生物反應器培養(yǎng)的因素有很多，其中光照條件是重要因素之一。不同植物種類、外植體在不同光照強度下的合成代謝物水平不同[13]，為了高效培養(yǎng)目的產物，確定適宜光照強度是培養(yǎng)過程中的一個重要環(huán)節(jié)。因此，該試驗研究了光照強度對生物反應器培養(yǎng)的狼爪瓦松愈傷組織生長和多糖、酚及黃酮(槲皮素、山奈素、表兒茶素沒食子酸酯、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷)積累的影響，旨在篩選愈傷組織培養(yǎng)的適宜光照強度，為狼爪瓦松產品生產提供一種新的原材料打下理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

狼爪瓦松種子采于吉林省龍井市延邊農業(yè)科學院植物園。將種子無菌播種在1/2 MS+7.8 g/L瓊脂的培養(yǎng)基(pH值5.8)。待無菌播種的試管苗葉片長出后，將葉片邊緣切除之后接種到MS+3.5 mg/L BA+0.1 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+7.8 g 瓊脂培養(yǎng)基(pH值5.8)中誘導愈傷組織。約30 d后，將誘導出的愈傷組織在MS+3.5 mg/L BA+0.1 NAA +30 g 蔗糖+7.8 g 瓊脂培養(yǎng)基(pH值5.8)培養(yǎng)中進行增殖培養(yǎng)，在溫度(25±2) ℃，光照強度30 (mol·cm-2·s-1)，每天光照6 h的條件下培養(yǎng)。每隔20 d繼代1次。

1.2 試驗方法

將繼代培養(yǎng)20 d的新鮮愈傷組織切成0.5 cm×0.5 cm 左右，稱取約20 g(鮮物重)并接種于3 L球型氣升式反應器中，每個反應器中加入2 L培養(yǎng)基(MS+3.5 mg/L BA+0.1 NAA+30 g 蔗糖，pH值5.8)。每個反應器的通氣量設為100 mL/min，培養(yǎng)溫度為(25±2) ℃。為探明光照強度的影響，將反應器分別置于每天光照16 h的15，30，45 (mol·cm-2·s-1)光照強度下和黑暗條件下。培養(yǎng)25 d后收獲，測定愈傷組織生物量(鮮重和干重)、總多糖和酚及5種黃酮(槲皮素、山奈素、表兒茶素沒食子酸酯、異槲皮苷、山奈酚-3-O-蕓香糖苷)的含量，并計算生產量。物質生產量/(mg/L)=含量/(mg/g DW)×愈傷組織干重/(g/L)

1.3 測定方法

1.3.1 生物量的測定

第三冊AWL覆蓋率為3.67%，偏向于通用英語。由圖3可知，第三冊各文本AWL覆蓋率在范圍1.2%-7.66%之間波動，每單元兩篇文章AWL覆蓋率相差較大，銜接較差。

將收獲的愈傷組織置于篩網內，用自來水沖洗干凈，裝入干凈的布袋中，利用脫水機(1 000 r/min，SS751-1 000，泰州市通洋洗滌機械制造有限公司，中國)脫水5 min, 稱取其鮮物重。然后將所有的愈傷組織放于45 ℃的烘干箱(YAD1205，杭州市利迪試驗儀器有限公司，中國)中，烘干48 h后取出稱其干物重。

1.3.2 多糖的測定

改良Lemmon等[14]的方法提取多糖。精密稱取愈傷組織粉末0.1 g，用90%乙醇浸泡2次，每次6 h，待揮干乙醇后，加入50 mL的蒸餾水，45 ℃條件下超聲提取30 min。濾紙過濾后，收集提取液，濾渣再次加入50 mL的蒸餾水，重復超聲提取3次。將所有提取液合并，在5 000 r/min條件下，離心15 min，并取上清液。隨后濃縮干燥上清液，再用Sevage試劑除蛋白3次。加入適量的95%的乙醇，靜止12 h以利于多糖的沉淀。隨后抽濾，濾渣分別用無水乙醇、丙酮和乙醚清洗3次后放在45 ℃烘干箱中烘干，得到多糖。用蒸餾水定容至1 mL后，添加1 mL 5%的苯酚和5 mL濃硫酸，靜置30 min后，利用分光光度計(UV110，上海天美科學儀器有限公司)于波長490 nm處，測定其OD值。

1.3.3 酚含量的測定

改良Hossain等[15]方法，測定酚的含量。精密稱取干樣品0.1 g，分別置于50 mL的三角瓶中，加入20 mL 80%的甲醇溶液后在80 ℃水浴1 h，冷卻后，在4 ℃條件下離心15 min (5 000 r/min)。取上清液定容到25 mL，從中吸取1 mL稀釋至一定體積，在760 nm處測其OD值。

1.3.4 黃酮類物質的測定

取1 g愈傷組織粉末，置于250 mL蒸餾燒瓶中，并加入50 mL含5%鹽酸的80%甲醇溶液，80 ℃回流提取1 h。濾液在60 ℃下減壓濃縮至1 mL左右液體，加入雙重蒸餾水定容到25 mL。并用25 mL乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，用15 mL蒸餾水清洗分液漏斗后，將清洗液與乙酸乙酯提取液合并，60 ℃下減壓揮干，甲醇定容至5 mL后，用0.45 μm有機濾器過濾，既得待測樣品。利用C18色譜柱(250×4.6 mm，5 μm，Theromo scientific，美國)的高效液相色譜(LC-15C，津島公司，日本)測定5種單體黃酮類化合物(圖1)含量。高效液相色譜法( HPLC) 于 1960年后期開始應用，是色譜法的一個重要分支，據估計，自然界70%以上的化合物均可用這種方法分析[16]。其中，槲皮素(Qc)和山萘素(Ke)(標準品購自成都曼斯特生物科技有限公司)在366 nm波長下檢測(圖2A和圖2B)，進樣量為10 μL，流動相為甲醇與0.1%磷酸水溶液，流速為0.8 mL/min，柱溫30 ℃。表兒茶素沒食子酸酯(Ecg)、異槲皮苷及(Qc-3-glc)山奈酚-3-O-蕓香糖苷(Kp-3-rut)(標準品均購自成都曼斯特生物科技有限公司)在280 nm波長下檢測(圖2C和圖2D)，其他色譜條件同上。黃酮總含量和生產量為5種單體黃酮之和。

圖1 狼爪瓦松愈傷組織中5種單體黃酮類化合物結構式

1，Qc; 2, Ke; peak 3, Ecg; peak 4, Qc-3-glc; peak 5, Kp-3-rut

2 結果與分析

通過對狼爪瓦松愈傷組織鮮重和干重的測定，發(fā)現光照條件對愈傷組織生物量有較大影響。與黑暗條件相比，光照有利于狼爪瓦松愈傷組織生物量積累，光照強度從15 (mol·cm-2·s-1)增大到30 (mol·cm-2·s-1)時，干物重和鮮物重顯著增大，光照強度為30 (mol·cm-2·s-1)時鮮物重(154.2 g/L)和干物重(4.9 g/L)達最大值；但光照強度繼續(xù)增大至45 (mol·cm-2·s-1)時，鮮物重和干物重則呈下降趨勢(表1)。

光照條件對愈傷組織中有效物質積累也有明顯的作用。與光照條件對生物量積累的影響相似，與暗培養(yǎng)比較，在光照條件下多糖和酚積累明顯增加。隨光照強度不斷增大，多糖含量和生產量也隨之增大，當光照強度達到30 (mol·cm-2·s-1)時，多糖含量和生產量達最大值，分別為125.8 (mg/g DW)和615.0 mg/L，隨后光照強度繼續(xù)增大多糖含量和生產量下降(圖3，圖中字母表示在0.05水平上差異顯著)。愈傷組織中酚積累與多糖有些差異，在15 (mol·cm-2·s-1)光照強度時最高，含量為17.4 mg/g DW，生產量達到74.6 mg/L。

表1 光照強度對反應器培養(yǎng)狼爪瓦松愈傷組織生物量積累的影響

注：字母表示在0.05水平上差異顯著。

圖3 光照強度對反應器培養(yǎng)狼爪瓦松愈傷組織有效物質積累的影響

2.2 光照強度對反應器培養(yǎng)狼爪瓦松愈傷組織黃酮積累的影響

由圖4可知，狼爪瓦松愈傷組織中5種單體黃酮的積累在光照條件下明顯高于黑暗條件，不同單體黃酮對最適光照強度的要求有差異。對于Qc和Qc-3-glc，在光照強度為15～30 (mol·cm-2·s-1)時，達到最大值，分別為271.3和280.5 (μg/g DW)。Ke和Ecg的含量隨光照強度的增強而增加，在光照強度為30 (mol·cm-2·s-1)時，達到最大值,分別為699.2和761.6 (μg/g DW)；光照強度增加至45 (mol·cm-2·s-1)時，Ke和Ecg含量下降。單體黃酮Kp-3-rup含量在光照強度為15 (mol·cm-2·s-1)時達最大,為2 031.3 (mg/g DW)，光照強度繼續(xù)增大時則下降。5種黃酮單體生產量變化趨勢相似，在光照強度達30 (mol·cm-2·s-1)時均達到最大值。

總黃酮含量和生產量在光照處理時高于黑暗處理。光照強度為15～30 (mol·cm-2·s-1)時，狼爪瓦松中總黃酮含量最大，達3.8 (mg/g DW)；而總黃酮生產量在光照強度為30 (mol·cm-2·s-1)時，達最大，為18.7 mg/L，光照強度繼續(xù)增加，總黃酮含量與生產量均下降(圖5,圖中字母表示在0.05水平上差異顯著)。

圖4 光照強度對反應器培養(yǎng)狼爪瓦松愈傷組織5種單體黃酮類物質積累的影響

圖5 光照強度對反應器培養(yǎng)狼爪瓦松愈傷組織單體黃酮類物質總量的影響

3 討論與結論

光照條件以及適當光照強度影響代謝物在植物組織中的含量和分布。王華田等[17]報道，光照強度為42%自然光強時，銀杏葉黃酮含量最高，高于或低于這一光強時含量均降低。Agati Giovanni等[18]采用微量熒光標記法和熒光微縮圖像技術對闊葉歐洲女貞(PhillyrealatifoliaL.)的葉片進行研究，發(fā)現完全暴露在光下的葉片從表皮區(qū)到內層海綿組織都有黃酮類成分的積累，而給予15%遮陰條件的葉片只在表皮區(qū)有此成分的積累。我國學者研究發(fā)現適當延長光照時間也可以增加黃酮類物質的含量。李衛(wèi)東等[19]報道大豆出苗期間大豆異黃酮含量隨日照時數增加而增加。汪海峰等[20]對不同海拔地區(qū)的銀杏葉黃酮昔含量進行調查時發(fā)現，高海拔地區(qū)較長的日照時間是促進銀杏葉黃酮積累的一個重要因素。

植物組織培養(yǎng)中，光照對愈傷組織的培養(yǎng)也有顯著的影響。光照條件下，蕎麥愈傷組織由于光合作用產生葉綠素而呈綠色，且合成較多的黃酮，這可能與光照條件下的細胞中葉綠體的分化有關[21]。研究表明，細胞中有葉綠體分化時，黃酮含量明顯提高[22]。另外，劉蓉等[23]研究表明，光照強度是影響葡萄愈傷組織誘導和繼代培養(yǎng)的重要外界環(huán)境因子，較高的光照強度會導致愈傷組織誘導率下降及褐化率增加，而光照強度較低會影響愈傷組織生長。該試驗結果發(fā)現,光照強度對狼爪瓦松愈傷組織生物量及有效物質積累有很大影響，當光照強度為30 (mol·cm-2·s-1)時，愈傷組織中多糖、酚和黃酮含量及生產量最多，但光照強度低于或高于30 (mol·cm-2·s-1)時，不利于有效物質積累。因此，適宜的光照強度可提高狼爪瓦松愈傷組織生物量和有效物質積累，30 (mol·cm-2·s-1)是培養(yǎng)的最佳光照強度。

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The effects of light intensity on callus biomass and effective compound accumulation ofOrostachyscartilagineaV. N. Boriss

LI Jinrong， LIAN Meilan， YU Yao， LIU Guanfu， JIANG Xiaolong， PIAO Xuanchun*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

In this study, the calluses induced fromO.cartilagineusseeds were used as the experimental material to investigate the effects of light intensity on callus biomass and effective compound accumulation. The results showed that the light intensity from 15 to 30mol·cm-2·s-1was beneficial to callus biomass accumulation, the fresh and dry weight reached the maximum level. For effective compound accumulation, the highest total phenolic content (17.4 mg/g DW) and productivity (68.53 mg/L) were found under 15mol·cm-2·s-1of light intensity, but the maximum polysaccharide content (125.8 mg/g DW) and productivity (615.05 mg/L) were obtained under 30mol·cm-2·s-1of light intensity. In addition, light intensity also affected flavonoid accumulation, 15mol·cm-2·s-1of light intensity was the most favorable for kaempferol-3-O-rutinoside accumulation, but the quercetin, kaempferol, epicatechin gallate, and isoquercitrin enhanced under 30mol·cm-2·s-1of light intensity. The total flavonoid content (3 816.6 mg/g DW) and productivity (18 654.0 mg/L) also reached the maximum under 30mol·cm-2·s-1light intensity. Therefore, the light intensity is one of important factors inO.cartilaginouscallus culture for production of effective compounds and 30mol·cm-2·s-1is the suitable light intensity.

light intensity; callus;polysaccharides;phenol;flavonoid

2017-03-06 基金項目：國家自然科學基金委項目(31260182)

李金蓉(1993—)，女，吉林長春人，在讀碩士，研究方向為植物組織培養(yǎng)及生物反應器的應用。樸炫春為通信作者，E-mail:mllian@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)01-0035-07

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.01.006

S567.239

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