張 瑜， 李金霞， 徐 璐， 劉馨宇， 王 瑩， 張雪梅

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，吉林 延吉 133002)

豬源性大腸桿菌分離鑒定及體外抑菌試驗(yàn)

張 瑜， 李金霞， 徐 璐， 劉馨宇， 王 瑩， 張雪梅*

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系，吉林 延吉 133002)

試驗(yàn)從延邊地區(qū)養(yǎng)豬場(chǎng)臨診上疑似大腸桿菌病的仔豬中無(wú)菌采集糞便和血樣52份，進(jìn)行大腸桿菌分離鑒定及致病性研究；通過(guò)紙片擴(kuò)散法測(cè)定四環(huán)素、磺胺嘧啶鈉及鏈霉素對(duì)分離株及標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌效果，通過(guò)試管二倍稀釋法及牛津杯法測(cè)定中藥蒲公英、連翹及柴胡粗提物對(duì)分離株及標(biāo)準(zhǔn)菌株的最小抑菌濃度(MIC)及抑菌效果。結(jié)果表明：共分離鑒定28株大腸桿菌，分離率54%；79%分離株可致死小鼠；大腸桿菌對(duì)四環(huán)素及磺胺嘧啶鈉敏感度較低，耐藥率分別為89%和64%，對(duì)鏈霉素敏感度較高，耐藥率為6%；蒲公英粗提物的MIC值為0.05 g/mL，連翹與柴胡粗提物的MIC值均為0.1 g/mL，3種中藥粗提物均可抑制大腸桿菌生長(zhǎng)，且蒲公英粗提物的抑菌效果最強(qiáng)。該試驗(yàn)結(jié)果表明:分離株對(duì)抗菌藥的耐藥性明顯，中藥體外抑菌效果明顯,為延邊地區(qū)仔豬腹瀉性大腸桿菌病的防治及新藥的開發(fā)提供依據(jù)。

仔豬；大腸桿菌；分離鑒定；最小抑菌濃度；抑菌效果

大腸埃希氏菌，俗稱大腸桿菌，是腸道常見細(xì)菌。大腸桿菌的O血清群通常與致病菌株不相關(guān)、不具有共同的特征毒力因子，僅某些特殊血清型具有致病性[1]。該菌可以引起不同動(dòng)物腹瀉、腸炎、甚至脫水而死，也可以引起其他器官感染[2]。在養(yǎng)豬業(yè)中，致病性大腸桿菌是引起新生仔豬黃痢、白痢、斷奶仔豬腹瀉和水腫病等的重要病原之一，其流行性廣，發(fā)病率、死亡率高，嚴(yán)重制約著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。由于畜禽養(yǎng)殖業(yè)對(duì)抗生素的過(guò)度依賴,造成動(dòng)物源大腸桿菌耐藥株不斷增多,耐藥機(jī)制日趨復(fù)雜,致使細(xì)菌耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重[3]。目前，大腸桿菌超級(jí)菌株、食品中毒、廣譜耐藥等問(wèn)題已經(jīng)成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)，監(jiān)測(cè)動(dòng)物源大腸桿菌耐藥性具有重要的公共衛(wèi)生意義[4]。

中藥在我國(guó)有上千年的歷史，被認(rèn)為是天然成分的有效來(lái)源，有非常好的利用價(jià)值和發(fā)展前景[5]。該試驗(yàn)通過(guò)對(duì)延邊地區(qū)部分養(yǎng)豬場(chǎng)腹瀉仔豬進(jìn)行大腸桿菌分離鑒定及致病性研究,抗菌藥耐藥性分析，中藥抑菌效果測(cè)定，篩選出抑菌效果較好的中藥，對(duì)延邊養(yǎng)豬地區(qū)仔豬腹瀉性大腸桿菌病的防治及中藥的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

從延邊地區(qū)部分養(yǎng)豬場(chǎng)，無(wú)菌采集1～2月齡仔豬直腸糞便及耳靜脈血共52份[6]。大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC25922 (Escherichiacoli)由延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

LB肉湯、NB肉湯、伊紅美蘭瓊脂、尿素瓊脂、西蒙氏枸櫞酸鹽瓊脂、三糖鐵瓊脂、瓊脂粉等(青島海博微生物試劑有限公司)；Kovacs試劑、蛋白胨水、磷酸鹽葡萄糖胨水、VP試劑、甲基紅試劑、乳糖、甘露醇等生化鑒定管(杭州濱和微生物試劑有限公司)。

1.1.3 藥品及制備

磺胺嘧啶鈉藥敏紙片(北京天壇藥物生物技術(shù)開發(fā)公司)，四環(huán)素、鏈霉素藥敏紙片(杭州濱和微生物試劑有限公司)；蒲公英、柴胡、連翹(延吉市海蘭江藥房)。稱取中藥干草各300 g，分別蒸餾水浸泡過(guò)夜，水煎3次，合并濾液濃縮至1 g/mL[7]。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

ICR小鼠，體重(20±2) g，購(gòu)自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 大腸桿菌分離純化

將采集樣品LB肉湯增菌 37 ℃培養(yǎng)16～18 h，取0.2 mL菌液均勻涂布于伊紅美蘭瓊脂平板，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，挑取單個(gè)帶有金屬光澤的黑色可疑菌落劃線于伊紅美藍(lán)平板，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，重復(fù)2～3次，挑取單個(gè)帶有金屬光澤的黑色可疑菌落劃線于LB平板，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，重復(fù)2～3次，挑取單個(gè)光滑圓形白色可疑菌落劃線于LB斜面37 ℃培養(yǎng)16～18 h，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 革蘭氏染色

挑取單個(gè)典型菌落于載玻片，與PBS緩沖液均勻混合，涂成薄層。涂片后室溫干燥、染色，置油鏡觀察。

1.2.3 生化鑒定

將分離株分別接種于三糖鐵、尿素及西蒙氏枸櫞酸鹽瓊脂，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察斜面顏色變化及產(chǎn)氣情況；對(duì)分離株的生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，記錄結(jié)果。

1.2.4 致死性試驗(yàn)

將比濁度達(dá)9×108CFU/mL菌液對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，0.6 mL/只，對(duì)照組注射等體積LB肉湯，接種后飼養(yǎng)72 h。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：4 h內(nèi)死亡為高毒力菌株，4～12 h為中毒力菌株，12～24 h為低毒力菌株，不致死為無(wú)毒菌株[8]。觀察并記錄結(jié)果。

1.2.5 抗菌藥藥敏試驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法，無(wú)菌條件下，取菌液0.2 mL均勻涂布于LB瓊脂平板，將四環(huán)素、磺胺嘧啶鈉及鏈霉素藥敏紙片按一定密度均勻貼于瓊脂表面，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，測(cè)量抑菌圈大小[9]。

1.2.6 中藥粗提物最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定

采用試管二倍稀釋法，每組1號(hào)試管中加各中藥粗提物1 mL與9 mL LB液體培養(yǎng)基混勻，2號(hào)試管取1號(hào)試管培養(yǎng)液5 mL與5 mL LB液體培養(yǎng)基混勻，以此類推至5號(hào)管，第6號(hào)管為生長(zhǎng)對(duì)照管，每管加0.2 mL菌液，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，測(cè)MIC值[10]。

1.2.7 中藥粗提物藥敏試驗(yàn)

采用牛津杯法，將各中藥粗提物稀釋成1、0.5、0.25、0.125、0.0 625 g/mL共5個(gè)濃度。吸取滅菌LB瓊脂培養(yǎng)基15 mL倒入平皿內(nèi)凝固備用,吸取比濁度達(dá)9×108CFU/mL的大腸桿菌菌液0.2 mL與50 mL冷卻至50 ℃的LB瓊脂均勻混合，每個(gè)平皿內(nèi)加5 mL，均勻攤布。每個(gè)平皿中均勻放置滅菌牛津杯3個(gè)，每個(gè)牛津杯加0.2 mL藥液，置37 ℃培養(yǎng)16～24 h，測(cè)量抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離純化及鑒定結(jié)果

共分離出28株可疑菌株，均符合大腸桿菌生化特性，其中,腸源26株，血源2株(表1)。

表1 大腸桿菌生化鑒定結(jié)果

2.2 革蘭氏染色結(jié)果

分離株均為革蘭氏陰性菌，菌體呈紅色短桿狀，成對(duì)或單個(gè)存在，符合大腸桿菌的形態(tài)特性(圖1)。

圖1 革蘭氏染色結(jié)果(1000×)

2.3 致死性試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，79%的分離株可致死小鼠，對(duì)小鼠有不同程度的毒力；21%分離株可致小鼠腹瀉，但毒力小，可自愈，無(wú)致死性。

表2 致死性試驗(yàn)結(jié)果

2.4 抗菌藥藥敏試驗(yàn)結(jié)果

選用四環(huán)素、磺胺嘧啶鈉及鏈霉素，通過(guò)紙片擴(kuò)散法對(duì)分離株及標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)及耐藥性分析。由表3可以看出,分離株對(duì)四環(huán)素、磺胺嘧啶鈉耐藥率分別為89%和64%，對(duì)鏈霉素敏感度較高，耐藥率為6%，判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)方法手冊(cè)(2004年版)規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)[11]。

表3 抗菌藥藥敏試驗(yàn)結(jié)果(抑菌圈直徑：mm)

注：“—”為無(wú)抑菌圈,下同。

2.5 中藥最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定結(jié)果

選用蒲公英、柴胡及連翹粗提物，通過(guò)試管二倍稀釋法測(cè)定其MIC值。由表4可知，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，蒲公英的MIC值為0.05 g/mL，連翹與柴胡的MIC值均為0.1 g/mL。

表4 中藥MIC值測(cè)定結(jié)果

注：“+”為不能抑制大腸桿菌生長(zhǎng)，“—”為抑制大腸桿菌生長(zhǎng)。

2.6 中藥藥敏試驗(yàn)結(jié)果

選用蒲公英、柴胡及連翹粗提物，通過(guò)牛津杯法對(duì)分離株及標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。由表5、6、7可知，蒲公英、連翹及柴胡對(duì)大腸桿菌均有抑制作用，各中藥的抑菌效果均表現(xiàn)出劑量依賴關(guān)系。其中,1 g/mL蒲公英粗提物的抑菌效果最強(qiáng)，32%分離株呈高度敏感，68%分離株呈中度敏感；連翹及柴胡抑菌效果次之，68%分離株對(duì)1 g/mL連翹粗提物呈中度敏感，32%呈輕度敏感；36%分離株對(duì)1 g/mL柴胡粗提物呈中度敏感，64%分離株呈輕度敏感(判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌圏直徑小于7.5 mm為耐藥；抑菌圖直徑在7.5～10 mm為輕度敏感，抑菌圏直徑在10～14 mm為中度敏感：抑菌圏直徑在15～20 mm為高度感；抑菌圏直徑大于20 mm為極度敏感)[12]。

表5 蒲公英牛津杯試驗(yàn)結(jié)果(抑菌圈直徑：mm)

續(xù)表5 蒲公英牛津杯試驗(yàn)結(jié)果(抑菌圈直徑：mm)

表6 連翹牛津杯試驗(yàn)結(jié)果(抑菌圈直徑：mm)

表7 柴胡牛津杯試驗(yàn)結(jié)果(抑菌圈直徑：mm)

3 討論與結(jié)論

大腸桿菌多為腸道正常菌群，在伊紅美蘭培養(yǎng)基上生長(zhǎng)為黑色帶有金屬光澤，表面光滑，邊緣整齊的圓形菌落。純培養(yǎng)物革蘭氏染色鏡檢，兩端鈍圓，呈單個(gè)或成對(duì)分布的短桿狀。吲哚及MR試驗(yàn)呈陽(yáng)性，VP試驗(yàn)呈陰性，可分解乳糖、甘露醇、山梨醇產(chǎn)酸產(chǎn)氣，不分解尿素，不利用枸櫞酸鹽，不產(chǎn)生硫化氫。大腸桿菌的特殊血清型具有致病性，本試驗(yàn)中52份樣品中分離出28株豬源性大腸桿菌，毒力強(qiáng)，79%具有致病性[13]。

近年來(lái)，用于防治仔豬大腸桿菌病的藥物多為抗菌藥，在使用過(guò)程中不僅殺滅了致病菌，也破壞了原有的正常菌群，增加機(jī)體對(duì)外源感染的敏感性，且長(zhǎng)期使用造成了藥物殘留及耐藥性的產(chǎn)生[14]。本試驗(yàn)分離的大腸桿菌對(duì)四環(huán)素及磺胺嘧啶鈉耐藥率分別為89%和64%，對(duì)鏈霉素敏感，耐藥率為6%，這與臨床用藥密切相關(guān)，說(shuō)明抗生素的長(zhǎng)期使用導(dǎo)致耐藥菌株的增多。因此，為了避免新耐藥菌株的產(chǎn)生，研制抗生素替代產(chǎn)品已成為必然。

中國(guó)是一個(gè)有著三千年歷史的文明古國(guó)，各民族經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期實(shí)踐創(chuàng)造了中國(guó)燦爛的文化，中藥學(xué)就是其中一部分[15]。中藥以資源豐富、價(jià)格低廉、毒副作用小、無(wú)殘留，不易產(chǎn)生耐藥性而成為研究熱點(diǎn)，用中藥來(lái)防治動(dòng)物疾病的研究越來(lái)越受到人們的重視[16]。柴胡作為傳統(tǒng)中藥，具有較好的抗菌抗病毒的作用，且隨著劑量加大抗菌抗病毒能力有一定程度的提高[17]。連翹具有廣譜抗菌作用，其中有效成分連翹酯苷具有極強(qiáng)的抗菌抗病毒活性，對(duì)多種革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌均有抑制作用[18]。蒲公英為菊科多年生草本植物,具有抗病原微生物,提高免疫功能等功效，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等均有較好的抑制作用, 有“天然抗生素”之美稱，臨床上現(xiàn)已用蒲公英制成了注射劑、片劑、糖漿、粉劑等不同劑型,廣泛應(yīng)用于臨床多種感染性炎癥[19]。本試驗(yàn)選用蒲公英、連翹及柴胡，通過(guò)試管二倍稀釋法及牛津杯法，對(duì)分離株的MIC值及體外抑菌效果進(jìn)行測(cè)定的結(jié)果表明：3種中藥對(duì)分離株均有較好的抑制作用，其中,以蒲公英的抑菌效果最強(qiáng)，這為防治延邊地區(qū)仔豬大腸桿菌病中藥的篩選及研究提供了理論依據(jù)。因中藥單味應(yīng)用效果相對(duì)較弱，為了提高中藥的抗菌效果，將進(jìn)一步研究中藥的聯(lián)合應(yīng)用。

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Isolation and identification ofEscherichiacolifrom swine and in vitro antibacterial test

ZHANG Yu, LI Jinxia, XU Lu, LIU Xinyu, WANG Ying, ZHANG Xuemei*

(AnimalMedicineDepartment,AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,YanjiJilin133002,China)

Fifty-two samples ofEscherichiacoliwere collected from Yanbian pig areas for isolation, identification and pathogenicity study. The effects of tetracycline, sulfadiazine and streptomycin onEscherichiacoliwere analyzed by Disk diffusion method. The minimum inhibitory concentration (MIC) and antimicrobial effect of crude extract of taraxacum, forsythia and bupleurum onEscherichiacoliwere determined by Two-fold dilution method and Oxford cup method. The results showed that 28 strains ofEscherichiacoliwere isolated and identified, the separation rate was 54%, 79% of isolated strains could kill mice; the sensitivity of tetracycline and sulfadiazine was lower, the resistance rates were 89% and 64%. The MIC of the crude extract of taraxacum was 0.05 g/mL, the MIC of the extract of forsythia and bupleurum were 0.1 g/mL, and the three crude extracts could inhibit the growth of Escherichia coli, and taraxacum had the strongest antibacterial effect. The results showed thatEscherichiacoliwas resistant to antibacterial, the antimicrobial effects of taraxacum, bupleurum and forsythia were obvious, which provided the basis for the prevention and control ofEscherichiacolidisease and the development of new drug in piglet diarrhea in Yanbian areas.

piglets;Escherichiacoli; isolation and identification; minimum inhibitory concentration; antibacterial effects

2017-02-02 基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31660727, 31260622 和 31060349)；吉林省科技廳重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(20160204016NY)

張瑜(1994—)，女(滿族)，吉林永吉人，在讀碩士，研究方向?yàn)楂F醫(yī)藥理學(xué)與毒理學(xué)研究。張雪梅為通信作者，E-mail：zhangxm@ybu.edu.cn

1004-7999(2017)01-0055-06

10.13478/j.cnki.jasyu.2017.01.009

S852.61

A