陳少鋒 趙湘培 余勝民

(廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530001)

壯藥排錢草總生物堿對大鼠肝星狀細胞膠原和細胞因子生成的影響△

陳少鋒 趙湘培 余勝民

(廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530001)

目的：研究排錢草總生物堿對大鼠肝星狀細胞(HSC-T6)相關(guān)膠原和細胞因子的分泌影響。方法：體外培養(yǎng)HSC-T6細胞，將排錢草總生物堿(終濃度為500、250、125、62.5、31.25、15.625μg/mL)作用于細胞48h后，以MTT法檢測細胞存活率，求出半數(shù)抑制濃度(IC50)，根據(jù)IC50選取無細胞度濃度進一步研究；收集細胞上清液，用ELISA法分別檢測Ⅰ型膠原(COL-Ⅰ)、Ⅲ型膠原(COL-Ⅲ)、Ⅳ型膠原(COL-Ⅳ)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β1)、血小板衍生因子(PDGF)的含量。結(jié)果：排錢草總生物堿能明顯抑制HSC-T6細胞的增殖，其抑制作用與藥物終濃度呈量效關(guān)系，求得IC50為337μg/mL；并顯著降低HSC-T6 細胞生成的COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1，PDGF含量，與空白對照組比較，P<0.05或P<0.01。結(jié)論： 排錢草總生物堿對HSC-T6細胞增殖有顯著抑制作用，并能降低COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1、PDGF的含量。

排錢草總生物堿；HSC-T6；細胞因子

排錢草是廣西、廣東等地廣泛應(yīng)用的民間藥材，是豆科植物排錢草Phyllodium pulchellum(L.)Desv.的干燥根。由于其具有清熱利濕、活血祛瘀、軟堅散結(jié)、除濕消腫等功效，因此常用于治療肝炎、子宮脫垂、肝脾腫大、風(fēng)濕痹痛、月經(jīng)不調(diào)等癥[1]。在針對肝纖維化的治療中，前期已有藥理研究證實排錢草有顯著活性[2-6]，但均未對其抗纖維化機制深入研究，因此，本實驗通過從細胞分子學(xué)水平研究排錢草總生物堿對大鼠肝星狀細胞膠原合成及細胞因子的分泌的影響，為進一步研究其抗肝纖維化作用機制提供前期理論依據(jù)，對開發(fā)排錢草這一民族藥資源具有重要意義。

1 材料

1.1 藥物：排錢草，采自廣西恭城瑤族自治縣，經(jīng)作者本人鑒定為豆科植物排錢草Phyllodium pulchellum(L.)Desv.的干燥根。

排錢草總生物堿：取排錢草粗粉加70%乙醇回流提取3次，每次1.5h，醇提液過濾，濾液回收乙醇至稠膏狀，加1%鹽酸溶解，過濾，濾液用三氯甲烷萃取，三氯甲烷液棄去，酸水液用氨水調(diào)PH9后用三氯甲烷萃取，三氯甲烷液回收三氯甲烷至稠膏狀，得總生物堿，以蒸餾水配成實驗所需濃度。

1.2 試劑：DMEM培養(yǎng)基(HyClone公司,批號：AAM210569)；胎牛血清(HyClone,批號：NVJ0313)；胰蛋白酶(Solarbio,批號：201611)；雙抗(gibco公司,批號：15140-122)；四氮唑藍MTT(Solarbio,批號：410C05)；COL-ⅠELISA Kit(Bio-Swamp公司,批號：201611)、COL-Ⅲ ELISA Kit(Bio-Swamp公司,批號：201611)、COL-Ⅳ ELISA Kit(Bio-Swamp公司,批號：201611)、TGF-β1 ELISA Kit(Bio-Swamp公司,批號：201611)、PDGF ELISA Kit(Bio-Swamp公司,批號：201611)。

1.3 儀器：倒置顯微鏡(LEICA DMIRB)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國Thermo)；超凈工作臺(荷蘭ClearAir公司)；離心機(德國Biofuge Stoctos 公司)；連續(xù)波長酶標儀(上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司，ST360)1.4細胞：HSC-T6細胞株由廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室提供。

2 方法[7]

2.1 排錢草總生物堿對HSC-T6細胞增殖的影響：取對數(shù)生長期的 HSC-T6 細胞，用0.25% 胰酶消化，離心收集細胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將細胞濃度調(diào)成3×104個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板板中，每孔100ul。細胞設(shè)空白對照組、6個不同濃度排錢草總生物堿組(終濃度為1000、500、250、125、62.5、31.25、μg/mL)，每組4個復(fù)孔。細胞接種后，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24h后，各組加入對應(yīng)的藥物濃度，空白對照組只加含DMEM 完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，按照MTT法，于570nm波長處測每A值。測得的各復(fù)孔A值取平均值，計算細胞生長抑制率，根據(jù)抑制率求出IC50,根君IC50選取3個無細胞毒作用濃度進行后續(xù)實驗。 抑制率=(1-藥物A/對照A)×100%

2.2 排錢草總生物堿對HSC-T6 生成的COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、COL-Ⅳ、TGF-β1、PDGF含量的影響： 取對數(shù)生長期的 HSC-T6 細胞，用0.25% 胰酶消化，離心收集細胞，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液將細胞濃度調(diào)成3×104個/mL，接種于96孔培養(yǎng)板板中，每孔100ul。細胞設(shè)空白對照組、陽性對照組(秋水仙堿,終濃度為1μg/mL)、及3個不同濃度排錢草總生物堿組(終濃度為150、75、37.5μg/mL)，每組 4 個復(fù)孔，細胞接種后于在 37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后，藥物組加入對應(yīng)的藥物濃度，空白對照組只加含DMEM 完全培養(yǎng)液，體積均為100ul，繼續(xù)培養(yǎng)48h后，收集細胞上清液3000 r·min 離心10 min，取上清液，按ELISA 試劑盒操作說明書檢測COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、COL-Ⅳ、TGF-β1、PDGF含量。

2.3 統(tǒng)計學(xué)方法： 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量數(shù)據(jù)以()表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 排錢草總生物堿對HSC-T6細胞增殖的影響：由表1提示，排錢草總生物堿16.625～500μg/mL濃度范圍內(nèi)，對HSC-T6細胞增殖有明顯抑制作用，且呈劑量關(guān)系，求出排錢草總生物堿對HSC-T6細胞半數(shù)抑制濃度IC50為337μg/mL。

表1 排錢草總生物堿對HSC-T6細胞增殖的影響

注：與正常對照組比較，*P<0.05；**P<0.01；

3.2 排錢草總生物堿對對HSC-T6 生成的COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、COL-Ⅳ、TGF-β1、PDGF含量的影響：由表2提示，排錢草總生物堿在終濃度為75μg/mL時，能抑制HSC-T6 細胞生成COL-Ⅲ含量，與空白組照比較，有顯著差異(P<0.01)；當排錢草總生物堿在終濃度為150μg/mL時，能抑制HSC-T6細胞生成COL-Ⅰ、COL-Ⅲ膠原和TGF-β1、PDGF細胞因子的含量，與空白組照比較，有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。

表2 排錢草總生物堿對COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、COL-Ⅳ、TGF-β1、PDGF含量的影響

注：與空白對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

4 討論

大多數(shù)慢性肝病共有的病理特征是肝纖維化，它也是慢性肝炎、肝硬化進一步發(fā)展并惡化的一個重要環(huán)節(jié)。有資料表明，肝纖維化患者中，會有20%～40%最終會發(fā)展成為肝硬化甚至肝癌。廣西是肝病的高發(fā)綠地區(qū)，有效地抑制肝纖維化的發(fā)生以及發(fā)展，對防治肝硬化甚至肝癌就具有及其重要的意義。肝纖維化的發(fā)生與肝細胞外間質(zhì)ECM成份的合成與降解、細胞因子的調(diào)節(jié)及許多細胞(主要以貯脂細胞)的參與有關(guān)。膠原蛋白作為組成 ECM 的主要成份，在肝纖維化的形成中具有重要意義。目前已發(fā)現(xiàn)27種膠原分子[8]，其中以COL-I、COL-Ⅲ、COL-Ⅳ為主，是肝纖維形成的重要標志。Ⅳ型膠原主要由肝竇內(nèi)皮細胞產(chǎn)生，是基膜的主要膠原成分，在肝纖維化早期階段產(chǎn)生，并啟動參與肝纖維化的各種因子，繼而導(dǎo)致Ⅰ、Ⅲ型膠原沉積。在肝纖維化早期以COL-Ⅲ為主，而到肝纖維化后期則主要是COL-I為主。因此抑制膠原的異常合成、促進沉積膠原的降解，在預(yù)防與治療肝纖維化中起著十分重要的作用[9-10]。 已有研究表明了HSC激活的調(diào)節(jié)的過程有多種因子參與，但TGF-β和PDGF是分別引起肝纖維化和細胞增生的關(guān)鍵，是最重要的細胞因子[11-12]。當 HSC 活化時，它失去類維生素A，并開始表達新的受體，主要為PDGF 受體和TGF-β受體?；罨?HSC 通過自分泌和旁分泌 PDGF、TGF-β，促進 HSC 增殖，合成大量 ECM 并在肝內(nèi)沉積，產(chǎn)生纖維化瘢痕，導(dǎo)致肝纖維化[13-14]。因此，通過抑制TGF-β和 PDGF誘導(dǎo)的 HSC 細胞增殖能有效的減少甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化。通過本實驗研究發(fā)現(xiàn)，排錢草總生物堿對T6細胞的增殖有明顯的抑制作用，并能顯著降低T6細胞分泌的 COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、膠原含量，及細胞因子TGF-β1、PDGF含量，與空白對照組比較有顯著性差異，說明在排錢草總生物堿抗肝纖維的作用機制與膠原蛋白與細胞因子合成有關(guān)，其具體機制可進一步研究。

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2017年1月24日收稿

Effect of Desmodium pulchellum(L.) benth Total Alkaloids on HSC-T6 Cell Proliferation and Content of Collage and Cytokine

CHEN Shao-feng ZHAO Xiang-pei YU Shen-min

National pharmaceutical research institute ,Guangxi zhuang autonomous region, Nanning 530001

Objective：To study the effect of total alkaloids of Desmodium pulchellum on the HSC-T6 proliferation and the content of collage andcytokine Method：Culture HSC-T6 cells in vitro,taking the total alkaloids of Desmodium pulchellum (final concentration were 500,250,125,62.5,31.25,15.625 μg/mL)act on the cell of HSC-T6 cell，adopting MTT colorimetric assay for cellsurvival rate after 48 hours and count IC50；The culture supernatant fluid was collected, the contents of COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、COL-Ⅳ、TGF-β1、PDGF were measured by ELISA.Result: The total alkaloids of Desmodium pulchellum could inhibit HSC-T6 cell proliferation,and with the increase in drug concentration,the effect of inhibiting the more significant.The IC50was 337ug/mL；can significantly decrease the level of the contents of COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1、PDGF，P<0.05或P<0.01.Conclusion: The total alkaloids of Desmodium pulchellum inhibited the proliferation of HSC-T6 cell and decrease the level of the contents of COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1、PDGF.

total alkaloids of Desmodium pulchellum ;HSC-T6;cytokines

1.廣西自然科學(xué)基金項目：(No.2014GXNSFAA118258)2.廣西科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計劃課題(No.桂科能14123006-6)

陳少鋒(1970-)，男(漢族)，廣西博白人，廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)藥研究院副主任藥師，學(xué)士學(xué)位，主要從事中藥，民族藥藥理研究工作。

R291.8

A

1006-6810(2017)03-0049-03