汪晶，潘永明，徐孝平，蔡月琴，陳方明，蔡兆偉，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，杭州310053)

研究報(bào)告

高脂誘導(dǎo)五指山小型豬動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立及Lp-PLA2的表達(dá)調(diào)控

汪晶，潘永明，徐孝平，蔡月琴，陳方明，蔡兆偉，陳民利*

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，杭州310053)

目的 高脂誘導(dǎo)建立五指山小型豬動(dòng)脈粥樣硬化(AS)模型，觀察脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Lp-PLA2)在AS模型血漿和斑塊中的表達(dá)變化。方法 將10只五指山小型豬隨機(jī)分為正常對(duì)照(Ctr)組4只飼喂普通飼料、AS模型(AS model)組6只飼喂高脂飼料，連續(xù)造模24周。造模24周時(shí)，空腹取前腔靜脈血測(cè)定總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)、甘油三酯(TG)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、Lp-PLA2活性和成分的變化，并取主動(dòng)脈進(jìn)行油紅O染色以及取腹主動(dòng)脈血管行HE染色和IL-6免疫組化染色，觀察血管脂質(zhì)沉積和斑塊病理以及IL-6蛋白表達(dá)變化。采用RT-PCR和Western Blot法觀察腹主動(dòng)脈組織中Lp-PLA2mRNA和蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 與正常對(duì)照組比，AS模型組體重、體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、TC、LDL-C、HDL-C、CRP、Lp-PLA2活性和成分均顯著升高(P<0.05，P<0.01)，同時(shí)主動(dòng)脈脂質(zhì)沉積明顯(P<0.01)和AS斑塊形成，腹主動(dòng)脈組織中Lp-PLA2mRNA和蛋白表達(dá)以及IL-6蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。結(jié)論 長(zhǎng)期高脂飲食24周能誘發(fā)五指山小型豬AS，且Lp-PLA2在參與血管炎癥和AS斑塊形成中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

五指山小型豬；動(dòng)脈粥樣硬化；脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2；炎癥

脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp-PLA2)是一種循環(huán)作用于動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病具有活性的酶，能準(zhǔn)確反映血管內(nèi)的炎癥，已成為動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)發(fā)展進(jìn)程的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)指標(biāo)[1]，并發(fā)現(xiàn)循環(huán)中Lp-PLA2會(huì)增強(qiáng)血管炎癥及AS[2]；并在AS豬模型中發(fā)現(xiàn)抑制Lp-PLA2能降低冠狀動(dòng)脈的壞死核心區(qū)域和不穩(wěn)定斑塊病變的發(fā)展[3]，同時(shí)在糖尿病/高脂血癥豬模型中也發(fā)現(xiàn)在冠狀動(dòng)脈的炎癥基因和通路中Lp-PLA2因子的作用更為重要[4]，這些結(jié)果也反映了豬可能是研究Lp-PLA2與AS關(guān)系重要的模型動(dòng)物。然而Lp-PLA2的表達(dá)與斑塊穩(wěn)定性、炎癥、氧化應(yīng)激及臨床表現(xiàn)的關(guān)系均還有待于進(jìn)一步闡述。

我國(guó)具有豐富的小型豬資源，如巴馬小型豬、五指山小型豬、貴州香豬等，但這些小型豬在心血管疾病中的生理應(yīng)用特點(diǎn)還尚不明確。近來(lái)有報(bào)道五指山小型豬對(duì)冠脈內(nèi)皮損傷術(shù)耐受力較差，極易出現(xiàn)室顫[5]；并用高膽固醇飲食誘導(dǎo)4～8個(gè)月時(shí)能出現(xiàn)早期的動(dòng)脈病變；提示五指山小型豬可能對(duì)血管損傷和高脂飲食誘導(dǎo)的血管病變存在易感性[6]。為此，本研究采用高脂飲食誘導(dǎo)建立五指山小型豬AS模型，觀察Lp-PLA2在五指山小型豬AS模型血漿和斑塊中的表達(dá)變化，為五指山小型豬在心血管疾病中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)五指山小型豬(WZSP)雄性10只，4月齡，體重為10～12 kg，由海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供【SCXK(瓊)2014-0006】；飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心小型豬實(shí)驗(yàn)室【SYXK(浙)2013-0164】，環(huán)境溫度：(22±1)℃，相對(duì)濕度：40%～65%，自由飲水，12 h/12 h明暗交替。

1.2 儀器與試劑

日立7020型全自動(dòng)生化儀(日本日立公司)、Iq5 PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、Odyssey紅外熒光掃描儀(美國(guó)Odyssey公司)、RM2245型石蠟切片機(jī)(美國(guó)徠卡公司)、80I相差顯微鏡(日本Nikon公司)。總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、甘油三酯(TG)試劑盒購(gòu)自上海申能德賽診斷技術(shù)有限公司；豬C反應(yīng)蛋白(CRP)、Lp-PLA2活性和成分試劑盒均購(gòu)自杭州誠(chéng)維生物科技有限公司；Lp-PLA2抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)公司；IL-6抗體購(gòu)自北京中杉金橋公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT reagent Kit)、熒光定量試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTMII)、RNA Extraction kit(總RNA提取試劑盒)，購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.3 五指山小型豬AS模型的建立

五指山小型豬適應(yīng)性飼養(yǎng)后，空腹行前腔靜脈穿刺取肝素抗凝血，經(jīng)測(cè)定肝腎功能、血脂和血常規(guī)等各項(xiàng)指標(biāo)無(wú)異常后入選。將WZSP隨機(jī)分成正常對(duì)照(Ctr)組4只飼喂基礎(chǔ)飼料和AS模型(AS model)組6只飼喂高脂飼料(高脂飼料配方：1.5%膽固醇、15%油脂、10%蛋黃粉、73.5%基礎(chǔ)飼料)，每天按2.5%體重分兩次等量飼喂，連續(xù)24周。

1.4 指標(biāo)觀察

1.4.1 血脂代謝、CRP、Lp-PLA2活性和成分測(cè)定

造模24周時(shí)，空腹取前腔靜脈肝素抗凝血，分離血漿，在7020-全自動(dòng)生化分析儀上測(cè)定血漿中TC、LDL-C、HDL-C和TG水平的變化；同時(shí)采用ELISA法測(cè)定血漿CRP、Lp-PLA2活性和成分變化。

1.4.2 RT-PCR法檢測(cè)腹主動(dòng)脈組織中Lp-PLA2mRNA的表達(dá)

取各組腹主動(dòng)脈組織，用TRIzol試劑盒提取總mRNA及逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。選取GAPDH為內(nèi)參照基因，以Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)豬Lp-PLA2mRNA引物(表1)，采用RT-PCR擴(kuò)增按照試劑盒(RNA PCR kit,TaKaRa)方法，根據(jù)Ct值，通過(guò)2-△△CT法計(jì)算各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers used in the real-time RT-PCR assay

1.4.3 Western blot法檢測(cè)腹主動(dòng)脈組織中Lp-PLA2蛋白的表達(dá)

取腹主動(dòng)脈組織100 mg，用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。定量后取各樣本50 μg用5%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠電泳，電泳結(jié)束后將膠轉(zhuǎn)至PVDF膜，麗春紅染色觀察轉(zhuǎn)移效果，確定蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)位置。5%脫脂奶粉+TBST封閉液封閉2 h；加入一抗(Lp-PLA2，1∶150稀釋)4℃過(guò)夜。洗膜后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗三次，結(jié)果用Odyssey紅外熒光掃描儀上進(jìn)行掃描，用Image J軟件計(jì)算各條帶的灰度值，并以GAPDH作為內(nèi)參進(jìn)行對(duì)照，以二者的比值代表Lp-PLA2蛋白的表達(dá)。

1.4.4 主動(dòng)脈脂質(zhì)沉積和血管病理組織學(xué)觀察

造模24周后，小型豬經(jīng)耳緣靜脈注射3%戊巴比妥鈉溶液(30 mg/kg)麻醉和開(kāi)胸術(shù)行安樂(lè)死；測(cè)量體長(zhǎng)(從鼻正中部到尾根部的距離)，計(jì)算體質(zhì)量BMI指數(shù)(體重/體長(zhǎng)2)。取主動(dòng)脈弓至腹主動(dòng)脈髂部的主動(dòng)脈經(jīng)24 h甲醛固定后，油紅O染色15 min，沖洗并拍照，用Image J軟件分析脂質(zhì)沉積。同時(shí)，取腹主動(dòng)脈血管，行常規(guī)脫水、石蠟包埋后切成4 μm的薄片，行蘇木素伊紅(HE)染色，觀察血管組織病變情況。

1.4.5 免疫組化法觀察腹主動(dòng)脈組織IL-6蛋白表達(dá)

取腹主動(dòng)脈組織用冰凍切片切成7 μm的薄片，用3%過(guò)氧化氫溶液封閉10 min，消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，然后加入多抗稀釋液(抗IL-6)4℃過(guò)夜孵育，PBS沖洗后滴加二抗孵育1 h。然后DAB顯色，自動(dòng)染色程序，復(fù)染，透明后封片。用倒置顯微鏡拍攝4張×400倍數(shù)的隨機(jī)照片，并用NIS-Element S.F.2.30軟件記錄，所獲取的照片用IPP 6.0軟件分析其陽(yáng)性表達(dá)光密度(IOD)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 表型特征的變化

與正常對(duì)照組比，高脂誘導(dǎo)后五指山小型豬體重、BMI指數(shù)均明顯升高(P<0.01)，血漿TC、LDL-C和HDL-C水平均顯著升高(P<0.05,P<0.01)(表2)；油紅O染色顯示AS模型組主動(dòng)脈弓至腹主動(dòng)脈髂部的血管脂質(zhì)沉積明顯增加(P<0.01)；HE染色亦顯示，正常對(duì)照組血管內(nèi)皮細(xì)胞完整，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)膜下未見(jiàn)泡沫細(xì)胞；AS模型組內(nèi)膜增厚，平滑肌增生排列紊亂，內(nèi)膜下可見(jiàn)泡沫細(xì)胞及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1)。

表2 高脂誘導(dǎo)五指山小型豬AS模型的表型特征Tab.2 Phenotypic characteristics of the WZSP minipig AS models fed with high fat/cholesterol atherogenic diet

注：與正常對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。

Note. Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01.

2.2 血漿CRP水平和Lp-PLA2活性和成分的變化

與正常對(duì)照組比，AS模型組血漿CRP水平明顯升高(P<0.01)，同時(shí)血漿Lp-PLA2活性和成分均顯著升高(P<0.05，P<0.01)；相關(guān)分析顯示，血漿Lp-PLA2活性與CRP、LDL-C均明顯相關(guān)(P<0.01)(圖2)。

注：油紅O染色分析主動(dòng)脈脂質(zhì)沉積(A)和油紅O染色面積百分率(B)，腹主動(dòng)脈組織HE病理形態(tài)(C，左圖×25，右圖×100)；與Ctr組比，** P<0.01。圖1 高脂誘導(dǎo)后五指山小型豬的血管脂質(zhì)沉積和病理形態(tài)學(xué)變化Note. Aortic lipid analysis using oil red O staining (A) and percent of oil red O stained area (B) and H&E-stained abdominal aorta (C, Left is ×25,and right is ×100). Compared with the control group, **P<0.01.Fig.1 Lipid deposition and pathological changes of blood vessels in the WZSP minipigs fed with high fat/cholesterol atherogenic diet

注：血漿CRP水平(A)，Lp-PLA2活性(B)及其與CRP的相關(guān)性(C)，Lp-PLA2成分(D)，Lp-PLA2活性與LDL-C的相關(guān)性(E)；與正常對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01。圖2 高脂誘導(dǎo)后五指山小型豬血漿CRP水平和Lp-PLA2活性和成分的變化Note. Plasma CRP levels (A), Lp-PLA2 activity (B) and its association with CRP (C), Lp-PLA2 composition (D), and Lp-PLA2 activity correlated with LDL-C (E); Compared with the control group,*P<0.05,**P<0.01.Fig.2 Changes of plasma CRP level, Lp-PLA2 activity and composition in the pigs induced by high fat/cholesterol atherogenic diet

2.3 腹主動(dòng)脈組織中Lp-PLA2mRNA和蛋白的表達(dá)

與正常對(duì)照組比，AS模型組腹主動(dòng)脈組織中Lp-PLA2mRNA和蛋白的表達(dá)均顯著升高(P<0.05)(圖3)。

2.4 腹主動(dòng)脈組織中IL-6蛋白的表達(dá)

與正常對(duì)照組比，AS模型組血管內(nèi)膜IL-6蛋白陽(yáng)性表達(dá)明顯增強(qiáng)；并且AS模型組IOD值顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)；相關(guān)分析顯示，IL-6蛋白與CRP和Lp-PLA2活性均明顯相關(guān)(P<0.05,P<0.01)(圖4)。

注：腹主動(dòng)脈組織中Lp-PLA2 mRNA表達(dá)(A)和蛋白表達(dá)(B)；與正常對(duì)照組相比，*P<0.05。圖3 高脂誘導(dǎo)后五指山小型豬腹主動(dòng)脈組織中Lp-PLA2mRNA和蛋白的表達(dá)Note.The expression of Lp-PLA2 mRNA (A) and protein (B) in abdominal aorta.Compared with the control group,*P<0.05.Fig.3 Expression of Lp-PLA2 mRNA and protein in the abdominal aortic tissue of WZSP Pigs induced by high fat/cholesterol atherogenic diet

注：免疫組化腹主動(dòng)脈組織IL-6蛋白表達(dá)(A，左圖為正常對(duì)照組，右圖為AS模型組，×200)和定量分析IOD值(B)；IL-6蛋白與CRP(C)和Lp-PLA2活性的相關(guān)性；與正常對(duì)照組相比，*P<0.05。圖4 高脂誘導(dǎo)后五指山小型豬腹主動(dòng)脈組織IL-6蛋白的表達(dá)Note.A. Aortic tissues, normal (left) and AS models (right). ×200. B. Quantitative analysis of IOD values. C. Correlation of IL-6 protein with CRP. D. Lp-PLA2 activity. Compared with the control group, *P<0.05.Fig.4 Expression of IL-6 protein in the abdominal aortic tissue of WZSP minipigs induced by high fat/cholesterol diet

3 討論

盡管適合研究AS疾病的模型動(dòng)物較多，但部分動(dòng)物的生理特點(diǎn)與人類(lèi)存在較大的差異，如大鼠有自發(fā)性抗AS形成和無(wú)膽囊的特點(diǎn)，對(duì)外源性膽固醇吸收率低，相對(duì)難以形成模型；兔無(wú)脂質(zhì)沉積斑塊，與人類(lèi)AS病變有一定差異；故除靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物外，豬可能是最接近人類(lèi)的模式動(dòng)物之一，其循環(huán)系統(tǒng)、脂蛋白代謝等生理結(jié)構(gòu)方面與人類(lèi)有許多共同之處，并且其斑塊與人類(lèi)成熟斑塊具有高度相似性，同時(shí)豬過(guò)度緊張或興奮等刺激會(huì)突發(fā)動(dòng)脈硬化性心血管疾病，而且用高脂飲食誘導(dǎo)方法簡(jiǎn)單易行，符合人類(lèi)AS漸進(jìn)性慢性發(fā)展的特點(diǎn)。因此，本研究采用的五指山小型豬具有體重較小，便于實(shí)驗(yàn)操作和飼養(yǎng)，已被廣泛用于心血管疾病研究[5,6]。

膳食因素是導(dǎo)致肥胖、高脂血癥、AS重要的危險(xiǎn)因素。在AS早期，各種危險(xiǎn)因素的刺激使LDL滲透進(jìn)入血管內(nèi)膜，刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生并釋放炎癥因子，上調(diào)黏附分子和趨化因子的表達(dá)，故血脂代謝和炎癥反應(yīng)在AS泡沫細(xì)胞形成過(guò)程中起著很重要的作用。LDL-C的升高也是AS的危險(xiǎn)因素之一[7]，在本研究也發(fā)現(xiàn)高脂誘導(dǎo)后五指山小型豬體重和體質(zhì)量BMI指數(shù)均明顯增加，LDL-C水平明顯升高，同時(shí)伴有TG升高的趨勢(shì)，表明高脂誘導(dǎo)能促發(fā)機(jī)體肥胖和血脂紊亂異常，而這些均是AS及其心血管疾病發(fā)生的重要獨(dú)立危險(xiǎn)因子[8]；另外，組織病理學(xué)發(fā)現(xiàn)高脂誘導(dǎo)后主動(dòng)脈脂質(zhì)沉積明顯，血管內(nèi)膜增厚，出現(xiàn)明顯的泡沫細(xì)胞和炎癥反應(yīng)，表明高脂誘導(dǎo)24周能成功建立五指山小型豬AS模型。

除血脂異常外，慢性炎癥反應(yīng)不僅是AS的基本特征，也是始動(dòng)因子，在斑塊破裂中起著重要的作用，并與生物活性脂質(zhì)介質(zhì)的形成有關(guān)，貫穿于AS的發(fā)生發(fā)展中，是疾病產(chǎn)生病變的關(guān)鍵因素之一。C反應(yīng)蛋白已被證實(shí)在冠心病患者中明顯增加，并與疾病的嚴(yán)重程度及其并發(fā)癥相關(guān)，是AS的標(biāo)志物之一[9]。CRP主要在肝臟中合成，并受炎癥因子和IL-6控制[10]。研究發(fā)現(xiàn)，在肥胖兒童中CRP明顯增加，且循環(huán)血液中1/3的IL-6來(lái)源于脂肪細(xì)胞，故IL-6可能是促發(fā)肥胖患者CRP升高的聯(lián)系紐帶之一[11,12]。同樣，本研究亦表明高脂誘導(dǎo)后五指山小型豬CRP明顯升高，同時(shí)腹主動(dòng)脈組織中IL-6表達(dá)亦顯著增加，而且CRP和IL-6兩者密切相關(guān)，這也證實(shí)了炎癥貫穿AS發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程，而IL-6可能通過(guò)增強(qiáng)炎癥反應(yīng)，降解斑塊內(nèi)的基質(zhì)使斑塊纖維帽變薄而使斑塊破裂。

近來(lái)發(fā)現(xiàn)Lp-PLA2是一種由巨噬細(xì)胞及單核細(xì)胞分泌主要與低密度脂蛋白結(jié)合的酶，其水平與LDL呈正相關(guān)，是預(yù)測(cè)AS的危險(xiǎn)標(biāo)志物[13]，受到相關(guān)炎性介質(zhì)的調(diào)節(jié)，參與炎癥反應(yīng)，促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展[14]。在AS斑塊中表達(dá)顯著升高，尤其在易損斑塊纖維帽的巨噬細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)，表明Lp-PLA2與心血管事件有著密切的聯(lián)系，故Lp-PLA2水平的升高提示斑塊形成和破裂的危險(xiǎn)性很大[15]。另外，循環(huán)血液中Lp-PLA2的含量及活性的變化也與炎癥密切相關(guān)，Lp-PLA2活性的增高不僅可作為AS相關(guān)的炎性生物標(biāo)志物，也提示機(jī)體中脂質(zhì)過(guò)氧化和氧化應(yīng)激水平增高[16]。Lp-PLA2能通過(guò)裂解氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)中的氧化磷脂生成溶血卵磷脂(LysoPC)和氧化游離脂肪酸等促炎性介質(zhì)[17]，使內(nèi)皮功能發(fā)生異常，從而能刺激黏附因子和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，介導(dǎo)炎性反應(yīng)，導(dǎo)致單核細(xì)胞由管腔向內(nèi)膜聚集浸潤(rùn)，并參與巨噬細(xì)胞的形成過(guò)程中，使巨噬細(xì)胞內(nèi)的膽固醇大量堆積聚集，促進(jìn)脂質(zhì)沉積并形成泡沫細(xì)胞，最終出現(xiàn)脂質(zhì)條紋和斑塊，促進(jìn)AS的發(fā)生與發(fā)展，甚至誘發(fā)血栓形成和心血管事件的發(fā)生[18,19]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，Lp-PLA2抑制劑darapladib能有效減少冠狀動(dòng)脈的斑塊面積[3]。本研究也發(fā)現(xiàn)高脂誘導(dǎo)后五指山小型豬循環(huán)血液中Lp-PLA2活性和成分均明顯升高；同時(shí)相關(guān)分析顯示，Lp-PLA2活性與CRP和LDL-C明顯正相關(guān)，表明循環(huán)血液中Lp-PLA2活性的變化可作為AS炎癥、脂質(zhì)代謝異常和心血管事件發(fā)生的標(biāo)志物。此外，IL-6不僅影響CRP外，還可能與Lp-PLA2有關(guān)。有學(xué)者認(rèn)為L(zhǎng)p-PLA2與IL-6可能共同參與AS的形成中[20]，并發(fā)現(xiàn)Lp-PLA2抑制劑darapladib干預(yù)能影響IL-6水平，臨床研究亦發(fā)現(xiàn)在肥胖婦女中Lp-PLA2的活性與ox-LDL和IL-6有顯著的相關(guān)性[21]，其機(jī)制可能與年齡及堆積的內(nèi)臟脂肪，能通過(guò)LDL的氧化作用及氧化應(yīng)激激活炎癥和細(xì)胞因子的表達(dá)導(dǎo)致AS有關(guān)[22]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)Ox-LDL促進(jìn)IL-6的分泌和通過(guò)活化磷脂酰肌醇3激酶及p38絲裂原蛋白激酶途徑刺激單核細(xì)胞中Lp-PLA2的表達(dá)[23]。同樣，本研究也發(fā)現(xiàn)高脂誘導(dǎo)后五指山小型豬腹主動(dòng)脈組織中Lp-PLA2mRNA和蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)，相關(guān)分析也顯示與IL-6蛋白表達(dá)呈一致性，提示Lp-PLA2與IL-6存在一定的聯(lián)系并共同促進(jìn)AS炎癥的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使斑塊不穩(wěn)定性增加。

綜上所述，高脂誘導(dǎo)五指山小型豬24周能成功建立AS模型，表現(xiàn)出明顯的血脂紊亂異常、炎癥反應(yīng)、血管脂質(zhì)沉積明顯和動(dòng)脈粥樣硬化；且Lp-PLA2在參與血管炎癥和AS斑塊形成中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。因此，抑制炎癥反應(yīng)可能是干預(yù)AS形成的一個(gè)重要靶點(diǎn)。Lp-PLA2作為一種新的炎癥反應(yīng)標(biāo)志物，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，能獨(dú)立預(yù)測(cè)AS的風(fēng)險(xiǎn)及評(píng)價(jià)斑塊的穩(wěn)定性，對(duì)于AS的預(yù)防和治療具有潛在的臨床價(jià)值[24]。但Lp-PLA2的應(yīng)用前景還需要更多的臨床研究進(jìn)一步開(kāi)拓和發(fā)展。

[1] Cerelli MJ, Grimm K, Duan X, et al. Evaluation of recombinant enzyme calibration to harmonize lipoprotein-associated phospholipase A2activity results between instruments [J].Clin Biochem, 2016, 49(6): 480-485.

[2] Toth PP, Mccullough PA, Wegner MS, et al. Lipoprotein-associated phospholipase A2: role in atherosclerosis and utility as a cardiovascular biomarker [J]. Expert Rev Cardiovasc Ther, 2010, 8(3): 425-438.

[3] Wilensky RL, Shi Y, Mohler ER 3rd, et al. Inhibition of lipoprotein-associated phospholipase A2 reduces complex coronary atherosclerotic plaque development [J]. Nat Med, 2008, 14(10):1059-1066.

[4] Fenning RS, Burgert ME, Hamamdzic D, et al. Atherosclerotic plaque inflammation varies between vascular sites and correlates with response to inhibition of lipoprotein-associated phospholipase A2 [J].J Am Heart Assoc, 2015, 4(2): e001477.

[5] 謝忠忱, 黃廣勇, 尹明,等. 五指山小型豬冠狀動(dòng)脈球囊損傷術(shù)[J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志, 2006,18(9):559-559.

[6] 陳華, 謝忠忱, 黃廣勇,等. 五指山小型豬動(dòng)脈粥樣硬化模型的建立[J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué), 2007, 24(6):39-45.

[7] Ming YS, Feng HX, Shi CT, et al. Effect of atorvastatin on serum levels of total cholesterol and high-sensitivity C-reactive protein in high-risk patients with atrial fibrillation in Asia [J]. ClinTher, 2015, 37(8):1740-1750.

[8] Alexy T, Pais E, Wenby RB, et al. Abnormal blood rheology and chronic low grade inflammation：possible risk factors for accelerated atherosclerosis and coronary artery disease in Lewis negative subjects [J]．Atherosclerosis, 2015, 239(1): 248-251.

[9] Backes JM, Howard PA, Moriarty PM. Role of C-reactive protein in cardiovascular disease [J].Ann Pharmacother,2004, 38(1): 110-118.

[10] Heinrich PC, Castell JV, Andus T. Interleukin-6 and the acute phase response [J].Biochem J, 1990, 265(3): 621-636.

[11] Cook DG, Mendall MA, Whincup PH, et al. C-reactive protein concentration in children: relationship to adiposity and other cardiovascular risk factors [J]. Atherosclerosis, 2000, 149(1):139-150.

[12] Yudkin JS, Kumari M, Humphries SE, et al. Inflammation, obesity, stress and coronary heart disease: is interleukin-6 the link?[J] Atherosclerosis, 2000,148(2): 209-214.

[13] Ait-Oufella H, Mallat Z, Tedgui A. Lp-PLA2 and sPLA2: cardiovascular biomarkers [J]. Med Sci (Paris), 2014, 30(5): 526-531.

[14] Garg PK, McClelland RL, Jenny NS, et al. Lipoprotein-associated phospholipase A2 and risk of incident cardiovascular disease in a multi-ethnic cohort: The multi ethnic study of atherosclerosis [J]. Atherosclerosis, 2015, 241(1): 176-182.

[15] Gilstrap LG, Wang TJ. Biomarkers and cardiovascular risk assessment for primary prevention: an update [J]. Clin Chem, 2012, 58(1):72-82.

[16] Kim JY, Hyun YJ, Jang Y, et al. Lipoprotein-associated phospholipase A2 activity is associated with coronary artery disease and markers of oxidative stress: a case-control study [J]. Am J ClinNutr, 2008, 88(3): 630-637.

[17] Tellis CC,Tselepis AD. Pathophysiological role and clinical significance of lipoprotein-associated phospholipase A2(Lp-PLA2) bound to LDL and HDL [J]. Curr Pharm Des, 2014, 20(40): 6256-6269.

[18] 郭旭, 華川, 李偉中, 等. 脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2、缺血修飾蛋白在動(dòng)脈硬化性腦梗死的應(yīng)用價(jià)值[J]. 臨床軍醫(yī)雜志, 2012, 40(10): 1102-1104.

[19] Lee JY，Byeon SK，Moon MH. Profiling of oxidized phospholipids in lipoproteins from patients with coronary artery disease by hollow fiber flow field-flow fractionation and nanoflow liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J]. Anal Chem, 2015, 87(2): 1266-1273.

[20] 孫姬, 陳一竹, 郭玲玉, 等. 輔酶Q10對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血脂及炎癥因子表達(dá)的影響[J].診斷學(xué)理論與實(shí)踐, 2015,4: 357-362.

[21] Paik JK，Kim M，Kim M，et al. Circulating Lp-PLA2activity correlates with oxidative stress and cytokines in overweight/obese postmenopausal women not using hormone replacement therapy [J]. Age (Dordr), 2015, 37(2):32.

[22] Paik JK, Kim JY, Kim OY, et al. Circulating and PBMC Lp-PLA2 associate differently with oxidative stress and subclinical inflammation in nonobese women (menopausal status) [J]. PLoS One, 2012, 7(2): e29675.

[23] Wang WY，Li J，Yang D, et al. OxLDL stimulates lipoprotein-associated phospholipase A2 expression in THP-1 monocytes via PI3K and p38 MAPK pathways [J]. Cardiovasc Res, 2010, 85(4):845-852.

[24] Tyagi MG，Mathew SK. Lipoprotein associated phospholipase A2 enzyme: possible new roles and inhibition for therapeutic intervention [J]. Int J Res Med Sci, 2014, 2(3): 805-809.

Establishment of a Wuzhishan minipig model of atherosclerosis induced by high fat/cholesterol diet and regulation of Lp-PLA2expression

WANG Jing, PAN Yong-ming, XU Xiao-ping, CAI Yue-qin, CHEN Fang-ming, CAI Zhao-wei, CHEN Min-li*

(Laboratory Animal Research Center, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)

Objective To establish a Wuzhishan minipig model of atherosclerosis (AS) induced by high fat/cholesterol diet, and observe the changes of expression of lipoprotein associated phospholipase A2(Lp-PLA2) in plasma and plaques.Methods 10 Wuzhishan minipigs were randomly divided into 2 groups: The normal control (Ctr,n=4) group was fed with normal diet, and AS model (n=6) group fed with high fat/cholesterol diet for 24 weeks. After the modeling for 24 weeks, the changes of total cholesterol (TC), low density lipoprotein (LDL-C), high density lipoprotein (HDL-C), triglyceride (TG), C-reactive protein (CRP), Lp-PLA2activity and composition were detected. The changes of vascular lipid deposition and plaques were assessed by pathology using oil red O staining and HE staining, respectively, and immunohistochemical staining for IL-6 protein expression. Moreover, the expression ofLp-PLA2mRNA determined by RT-PCR and protein by Western blot were observed in the abdominal aortic tissues. Results Compared with the control group, the body weight, body mass index (BMI), TC, LDL-C, HDL-C, CRP, Lp-PLA2activity and composition and aortic lipid deposition were significantly increased, and AS plaque formation was observed in the AS model group (P<0.05,P<0.01). The expression ofLp-PLA2mRNA and protein and IL-6 protein in abdominal aortic tissues were also significantly increased (P<0.05). Conclusions Long-term high fat/cholesterol diet feeding for 24 weeks can induce atherosclerosis in Wuzhishan minipigs, and Lp-PLA2 plays a key role in the vascular inflammation and plaque formation.

Wuzhishan minipig; Atherosclerosis; Lipoprotein associated phospholipase A2; Inflammation

CHEN Min-li, E-mail: cmli991@ aliyun.com

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31572346)；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(LY16C040001)；浙江中醫(yī)藥大學(xué)比較醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(XTD201301)。

汪晶(1990-)，女，碩士生，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較藥理。E-mail: 1209076410@qq.com

陳民利(1963-)，女，教授，研究方向?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)。E-mail: cmli991@ aliyun.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 02-0194-07

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.02.015

2016-10-18