吉順梅，鄭昌月，李濤，李炳，周曉東

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院，上海 201508)

研究報(bào)告

短波視蛋白在豚鼠頻閃光誘導(dǎo)性近視和形覺剝奪近視眼模型中的表達(dá)差異

吉順梅，鄭昌月，李濤，李炳，周曉東*

(復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院，上海 201508)

目的 觀察豚鼠頻閃光誘導(dǎo)性近視和形覺剝奪近視模型中短波視蛋白(S-opsin)表達(dá)差異，并初步探討原因。方法 36只普通級2周齡豚鼠隨機(jī)分成三組：頻閃組(FLM組，n=13)，形覺剝奪組(FDM組，n=12)，對照組(n=11)。FLM組，飼養(yǎng)籠具安裝有頻閃儀(頻率0.5 Hz)，籠具內(nèi)裝有發(fā)光二極管；FDM組豚鼠右眼用半透明眼罩遮蓋，并確保豚鼠眼瞼能正常活動(dòng)；對照組豚鼠不予特殊處理。在造模第1天(0周)和第6周測量豚鼠右眼屈光度、眼軸長度和角膜曲率半徑，并通過免疫熒光法觀察S-opsin表達(dá)。結(jié)果 第0周，F(xiàn)LM、FDM組與對照組屈光度、眼軸長度、角膜曲率半徑差異均無顯著性(P>0.05)。造模6周后，與對照組相比，F(xiàn)LM組、FDM組屈光度變化值、眼軸長度變化值差異均有顯著性(P<0.05)，而角膜曲率半徑變化值差異無顯著性(P=0.358)，提示成功建立近視模型。FLM組與FDM組相比，屈光度變化值、眼軸長度變化值、角膜曲率半徑變化值差異均無顯著性(P>0.05)。免疫熒光結(jié)果顯示：FLM組視蛋白灰度值>對照組視蛋白灰度值>FDM組視蛋白灰度值，任意兩組進(jìn)行比較，差異均有顯著性(P<0.001)。結(jié)論 頻閃光和形覺剝奪均能建立近視模型，頻閃光誘導(dǎo)性近視模型中S-opsin產(chǎn)生增加，而形覺剝奪性近視模型中S-opsin產(chǎn)生減少，說明兩種近視模型的發(fā)生機(jī)制可能不同。

近視；短波視蛋白；頻閃光誘導(dǎo)；形覺剝奪；豚鼠

研究表明，近視的產(chǎn)生可源于過度的或不適當(dāng)?shù)墓獗┞?，以及光污染環(huán)境[1]，而頻閃光是光污染環(huán)境的重要組成部分。目前研究表明頻閃光能夠誘導(dǎo)近視形成[2,3]，并且近視程度與頻閃光的頻率有關(guān)[4]。頻閃光，由于其強(qiáng)烈的明暗對比，可造成一種典型的光覺異常環(huán)境，從而影響視覺信息的形成和視覺感知[5]，從而刺激豚鼠眼球增長，屈光度改變，引發(fā)視網(wǎng)膜電圖α波潛伏期延長，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)改變；眼底也可看到裂紋狀紋理[4]。有研究發(fā)現(xiàn)[6,7]，形覺剝奪性近視和光學(xué)離焦性近視的豚鼠眼模型中，視蛋白表達(dá)都發(fā)生了一定的變化，表明視錐細(xì)胞可能參與了豚鼠實(shí)驗(yàn)性近視眼的形成，近視的形成可能由變化的視蛋白表達(dá)啟動(dòng)，然而目前尚未見實(shí)驗(yàn)研究視蛋白與頻閃光誘導(dǎo)近視的關(guān)系。

本研究旨在通過觀察與分析兩種不同實(shí)驗(yàn)性近視模型中視網(wǎng)膜短波視蛋白(S-opsin)的分布與表達(dá)，探討這兩種模型的差異。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級2周齡英國種短毛三色雄性豚鼠36只，屈光介質(zhì)透明，排除眼部疾病及畸形。購自上海甲干生物科技有限公司【SCXK(滬)2015-0005】，體重為90～110 g，在上海市公共衛(wèi)生臨床中心中飼養(yǎng)【SYXK(滬)2015-0008】，室溫保持在20～22℃，相對濕度維持在55%～65%，正常室內(nèi)照明，光照周期12 h明∶12 h暗，光強(qiáng)度0～600 lx。按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷，自由攝食、進(jìn)水，每日補(bǔ)充新鮮蔬菜和維生素C。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 形覺剝奪性近視和頻閃光誘導(dǎo)性近視的模型建立

36只豚鼠隨機(jī)分為①頻閃組(flickering light-induced myopia，F(xiàn)LM組)，n=13，參考邸悅等[3]的方法建立頻閃光誘導(dǎo)性近視模型，飼養(yǎng)籠具安裝有頻閃儀(上海多毅科技有限公司，12 V方波脈沖電源，占空比50%，頻率0.5 Hz)。在每個(gè)籠具頂上的四個(gè)角落均裝有發(fā)光二極管(福州奧爾銳公司，LED燈，窄譜，峰值500 nm，色溫2850 K)。光照條件：0～600 lx。②形覺剝奪組(form-deprived myopia, FDM組)，n=12，右眼用半透明眼罩遮蓋，并確保豚鼠眼瞼能正?；顒?dòng)。每天檢查兩次。③對照組，n=11，豚鼠不予特殊處理，開放飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)周期為6周。1.2.2 眼球生物測量

將造模第一天記為0周。在造模0周、第6周各測量一次，測量均采用單盲法。造模結(jié)束時(shí)減去造模前所測得測量值之差即為該眼生物參數(shù)變化量[8]。

(1)屈光度測定使用睫狀肌麻痹劑復(fù)方托吡卡胺滴眼液(參天制藥有限公司，中國)后進(jìn)行帶狀光檢影驗(yàn)光[9]，散光以半量計(jì)入球鏡，重復(fù)測量3次后取平均值作為該眼的屈光度值。

(2)眼軸長度的測定應(yīng)用SUPER SW1000 眼科A 超測量儀，A 超頻率為11 MHz。先行角膜表面麻醉，測量時(shí)探頭對準(zhǔn)角膜中心并垂直于角膜平面。每只眼重復(fù)測量10次取平均值，精確到0.01 mm。

(3)角膜曲率半徑的測定為了校正曲率計(jì)(OM-4，Topcon，日本)，于曲率計(jì)鏡頭前貼一個(gè)+8.0D鏡片，讀數(shù)乘以0.451即為實(shí)際角膜曲率半徑[10]。計(jì)算水平和垂直向的平均值作為角膜曲率半徑值，每只眼重復(fù)測量三次取平均值。

1.2.3 取材

6周實(shí)驗(yàn)干預(yù)后，采用腹腔內(nèi)注射過量戊巴比妥鈉(0.2 mg/mL)麻醉處死動(dòng)物后，迅速取出右眼眼球，并固定。

1.2.4 免疫熒光染色

切片經(jīng)脫蠟，復(fù)水，PBS洗滌3次，0.3%雙氧水滅活，檸檬酸法進(jìn)行抗原修復(fù)，牛血清封閉，一抗(1∶50兔來源抗S-opsin, Abcam，香港)4℃冰箱孵育過夜，二抗37℃孵育1 h(1∶200山羊抗兔)，DAPI染色(1∶1000)后封片，激光共聚焦顯微鏡(Leica SP5，德國)觀察、拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 頻閃光誘導(dǎo)性近視眼模型的建立

實(shí)驗(yàn)造模0周，F(xiàn)LM組與對照組右眼的屈光度、眼軸長度、角膜曲率半徑差異均無顯著性(P=0.888,P=0.395,P=0.792)；與對照組右眼相比，造模6周后，F(xiàn)LM組右眼屈光度、屈光度變化值、眼軸長度、眼軸長度變化值差異均有顯著性(P<0.001)，但角膜曲率半徑、角膜曲率半徑變化值差異無顯著性(P=0.2,P=0.358)。(見表1，表2)。

2.2 形覺剝奪性近視眼模型建立

實(shí)驗(yàn)造模0周，F(xiàn)DM組與對照組右眼的屈光度、眼軸長度、角膜曲率半徑差異均無顯著性(P=0.888,P=0.395,P=0.792)；與對照組右眼相比，造模6周后，F(xiàn)DM組豚鼠右眼屈光度、屈光度變化值、眼軸長度、眼軸長度變化值差異均有顯著性(P<0.001,P<0.001,P=0.003,P=0.005)，但角膜曲率半徑、角膜曲率半徑變化值差異無顯著性(P=0.2,P=0.358)。(見表1，表2)。

2.3 FLM組與FDM組中豚鼠右眼生物參數(shù)比較

實(shí)驗(yàn)造模0周，F(xiàn)LM組與FDM組右眼的屈光度、眼軸長度、角膜曲率半徑差異均無顯著性(P=0.888,P=0.395,P=0.792)(見表1)；造模6周后，F(xiàn)LM和FDM組屈光度、屈光度變化值、眼軸長度、眼軸長度變化值、角膜曲率半徑、角膜曲率半徑變化值差異均無顯著性(P=1.000，P=1.000，P=0.972，P=0.42，P=0.2，P=0.358)。見表2。

表1 造模0周，及6周后三組模型生物參數(shù)值Tab.1 Values of biological parameters of the three models at week 0 and week 6

注：表示與對照組比較，*P<0.05。

Note. Compared with the control group，*P<0.05.

表2 造模6周后三組模型生物參數(shù)值變化值Tab.2 Changes of the biological parameter values after treatment for 6 weeks

注：表示與對照組比較，＊P<0.05。

Note. Compared with the control group，*P<0.05.

2.4 免疫熒光

圖1A顯示視網(wǎng)膜各層S-opsin分布的免疫熒光圖像，表達(dá)S-opsin的細(xì)胞的分布主要集中在光感受器細(xì)胞層(RC)。三組模型豚鼠中S-opsin平均綠色通道灰度值各不同，分別與對照組比較，F(xiàn)LM組、FDM組差異均有顯著性(P<0.001)，并且FLM組與FDM組之間比較差異也有顯著性(P=0.001)，灰度值大小排列為FLM組>對照組>FDM組。(見表3，圖1B)。

表3 實(shí)驗(yàn)6周后S-opsin的平均灰度值Tab.3 Mean gray levels of S-opsin after experiment for 6 weeks

注：表示與對照組比較，*P<0.05。

Note. Compared with the control group，*P<0.05.

注：A:S-opsin的激光共聚焦圖片。綠色著染的為S-opsin，藍(lán)色著染的為細(xì)胞核；RC:感光細(xì)胞層，OPL:外網(wǎng)狀層，ONL:外核層，IPL:內(nèi)網(wǎng)狀層；INL：內(nèi)核層；GCL:神經(jīng)細(xì)胞節(jié)層；標(biāo)尺：25μm。B：對激光共聚焦圖片中視蛋白平均綠色通道灰度值進(jìn)行半定量分析。表示與對照組相比，*P<0.05；數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。圖1 S-opsin免疫熒光和蛋白質(zhì)半定量分析Note. A: Images of S-opsin taken by confocal laser scanning microscopy. DAPI labeled cell nuclei (blue) co-labeled for S-opsin localization(red); RC：Retinal photoreceptor cells, OPL: Outer plexiform layer, ONL: Outer nuclear layer, IPL: Inner plexiform layer, GCL: Ganglion cell layer; Scale bar=25 μm. B: Semi-quantitative analysis of S-opsin content by mean gray values of green channel. Compared with the control group,* P<0.05. All the data are expressed in Fig.1 Immunofluorescence and semi-quantification analysis of S-opsin protein expression

3 討論

我們研究發(fā)現(xiàn)，頻閃光和形覺剝奪均能誘導(dǎo)出實(shí)驗(yàn)性近視，這與既往研究報(bào)道的結(jié)果一致[11,12]。在FLM組中S-opsin增加，而FDM組中S-opsin減少，提示這兩種近視模型可能有著不同的發(fā)生機(jī)制。

視蛋白，主要由視覺細(xì)胞產(chǎn)生，參與視覺形成過程，是眼部感知光線的第一站。在哺乳類動(dòng)物，視錐細(xì)胞視蛋白分為三類：長波長視蛋白(L-opsin，最大吸收光譜值λmax=560 nm)、中波長視蛋白(M-opsin,λmax=530 nm)、短波長視蛋白(S-opsin,λmax=420 nm)[13]。在視覺傳導(dǎo)過程中，視蛋白參與視錐細(xì)胞視覺循環(huán)。視蛋白與視黃醛分離后，激活與其相連的G蛋白，經(jīng)過胞內(nèi)的磷酸化級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞膜上陽離子通道關(guān)閉，使細(xì)胞膜超極化，形成超極的感受器電位，將光信號放大并通過一系列電信號將信息傳遞至大腦[14]。由上可見，光線是視網(wǎng)膜感光細(xì)胞被刺激的前提條件。光線通過屈光系統(tǒng)，影響視蛋白表達(dá)，并經(jīng)過一系列反應(yīng)在視網(wǎng)膜上成像，所以光線條件對于視覺的形成很重要，并且會(huì)影響視覺的質(zhì)量。目前，我們的眼睛越來越多地暴露于來自視頻顯示終端的發(fā)光二極管的光，且長期連續(xù)注視視頻終端者較容易出現(xiàn)眼功能的改變，會(huì)出現(xiàn)視頻終端綜合征[15]，而這些光中包含了很多的藍(lán)光[16]，藍(lán)光為短波長光，所以本實(shí)驗(yàn)主要研究S-opsin。

視覺環(huán)境如光線強(qiáng)弱、光譜組成改變、顏色變化、物體空間性質(zhì)的改變等多方面都可能成為影響近視發(fā)生發(fā)展的因素，而在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，視覺環(huán)境改變的可控性又為進(jìn)一步具體研究提供了有利條件。本實(shí)驗(yàn)通過改變外界的光線條件影響豚鼠的屈光狀態(tài)，以及視蛋白的變化。通過觀察發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DM和FLM兩個(gè)模型都誘導(dǎo)了豚鼠近視，但是視蛋白的含量卻發(fā)生了不同的變化。我們認(rèn)為原因如下：

一方面，有研究發(fā)現(xiàn)[17,18]，出生后錐細(xì)胞具有可塑性，某些部位錐細(xì)胞可由于在發(fā)育過程中，一些事件作用于光感受器層，從而在無凋亡情況下密度發(fā)生改變，且不同類型間可相互轉(zhuǎn)化，本實(shí)驗(yàn)中短波視蛋白的改變可能是在頻閃光這種異常的光環(huán)境中豚鼠兩種不同錐細(xì)胞之間相互轉(zhuǎn)化的結(jié)果。形覺剝奪和頻閃光誘導(dǎo)對視蛋白表達(dá)的影響提示光線或視網(wǎng)膜成像是錐細(xì)胞發(fā)育過程中較重要的一方面，兩者都可干擾正常的視覺發(fā)育過程所需的錐細(xì)胞的轉(zhuǎn)化比率，并且干擾產(chǎn)生的影響可能不同。

另一方面，我們認(rèn)為可能是因?yàn)镕DM和FLM組豚鼠接受不同的非正常光線。目前對FDM已有較多的研究，而目前對FLM的研究較少，F(xiàn)LM誘導(dǎo)近視的機(jī)制很少被闡述。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)DM誘導(dǎo)近視的成因有很多，包括：研究發(fā)現(xiàn)可能是由于實(shí)驗(yàn)眼活動(dòng)減少[19]，也可能是Wnt3/β-catenin信號通路激活，通過TGF-β1因子，減少I型膠原，從而使鞏膜重塑，導(dǎo)致近視[20]，另外，還有研究發(fā)現(xiàn)近視形成伴隨DA水平下降[21]，此外，NMDAR1/NO-cGMP通路激活[22]也可參與近視的形成。對于FDM組，我們認(rèn)為由于與對照組相比，進(jìn)入眼中的光線異常，對眼球的光刺激減少，所以由視覺細(xì)胞產(chǎn)生的視蛋白減少。對于FLM組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：可能是頻閃光時(shí)間頻率的因素，光照強(qiáng)度的亮-暗周期性變化影響了豚鼠視網(wǎng)膜中感光細(xì)胞內(nèi)短波視蛋白的產(chǎn)生，從而改變了正常的正視化進(jìn)程，并誘導(dǎo)了近視產(chǎn)生。頻閃光照射條件下，光通量會(huì)周期性發(fā)生強(qiáng)弱改變，從而產(chǎn)生閃爍感。有研究認(rèn)為[23]，在這種頻閃光照射環(huán)境下，視覺環(huán)境隨光的閃爍出現(xiàn)明暗交替，視網(wǎng)膜上形成的物像在清晰與不清晰之間不斷變化，眼球不能獲得穩(wěn)定的光照度及清晰成像，容易引起視疲勞，從而誘導(dǎo)近視發(fā)生或加速其發(fā)展。我們認(rèn)為當(dāng)物像不清晰時(shí)，視網(wǎng)膜發(fā)出信息通過某種機(jī)制進(jìn)行調(diào)整，可能是通過視覺細(xì)胞產(chǎn)生更多短波視蛋白，力圖得到持續(xù)、穩(wěn)定、清晰的物像，在這調(diào)整過程中，眼球增大，發(fā)展為近視。本實(shí)驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于亮1 s，暗1 s(頻率為0.5 Hz)的特殊的頻閃光光照環(huán)境中，如果將0.5 Hz這種頻率的時(shí)間頻率轉(zhuǎn)化為空間頻率，相當(dāng)于頻閃組豚鼠處在一個(gè)能誘導(dǎo)近視發(fā)生的低空間頻率的視覺環(huán)境[24,25]，這種視覺環(huán)境也可能影響短波視蛋白的產(chǎn)生。

本實(shí)驗(yàn)通過發(fā)現(xiàn)頻閃光誘導(dǎo)性近視和形覺剝奪近視眼模型中視蛋白含量不同，得出兩種近視模型的發(fā)生機(jī)制可能不同的結(jié)論。今后我們還將繼續(xù)探索視蛋白變化伴隨的影響。我們將通過更多研究進(jìn)而探索視蛋白表達(dá)變化究竟是近視發(fā)生的原因，還是伴隨改變，明確其在實(shí)驗(yàn)性近視眼發(fā)病機(jī)制中的作用，從而為近視防治提供更多的參考資料。

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Changes of S-opsin expression in guinea pigs with flickering light-induced and form-deprived myopia

JI Shun-mei, ZHENG Chang-yue, LI Tao, LI Bing, ZHOU Xiao-dong*

(Jinshan Hospital, Fudan University, Shanghai 201508, China)

Objective To observe the changes of S-opsin expression in guinea pigs with flickering light-induced and form-deprived myopia, and to investigate the causes. Methods Thirty-six two-week-old healthy guinea pigs were randomly assigned to three groups: Flickering light-induced myopia group (FLM group，n=13), form-deprived myopia group (FDM group，n=12) and control group (n=11).For the FLM group, the cages were equipped with astroboscope (0.5 Hz), and LEDs were used as the light source. The right eyes of the guinea pigs in FDM group wore translucent goggles which did not interfere with the normal activity of their eyelids. No special treatment was given to the guinea pigs in the normal groups.All measurements were performed prior to and then after 6 weeks of treatment. The first measurement day was recorded as 0 week. Biological parameters, such as the refraction, axial length (AL) and corneal radius of curvature (CRC), were measured and fundus photography is performed before and after 6 weeks of the treatment. The expression of S-opsin was observed and analyzed by immunofluorescence technique and image analysis system. Results Before the treatment, no significant difference was found in three biometric measurements including refraction, AL and CRC between the groups at 0 week (P>0.05). After the treatment for 6 weeks, significant differences were found in changes of both the biometric measurements between the FLM and control groups, and between the FDM and control groups (P<0.05). However, no significant differences were found in the changes of CRC among the FLM, FDM and control groups(P=0.358), indicating that myopia models were established successfully. No significant differences were found in the changes of values of refraction, AL and CRC between the FLM and FDM groups (P>0.05). Expression of S-opsin differed in the FLM and FDM groups. For the mean gray values of green channel,compared with the control group respectively, significant differences were found in both the FLM and FDM group (P<0.001). The mean gray value of green channel of the FLM group was higher, however the mean gray value of green channel of the FDM group was lower. Conclusions Both guinea pig models of flickering light-induced and form-deprived myopia can be established successfully. S-opsin is increased in the flickering light-induced myopia model and decreased in the form-deprived myopia model, indicating that the mechanisms of formation of these two experimental myopia models may be different.

Myopia; S-opsin; Flickering light-induction; Form-deprivation; Guinea pigs

ZHOU Xiao-dong, E-mail: xdzhou2005@163.com

上海市自然科學(xué)基金(編號：17ZR1404200)；上海市衛(wèi)計(jì)委項(xiàng)目(編號：201640046)。

吉順梅(1991-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：眼視光學(xué)。E-mail:jishunmei22@126.com

周曉東，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師, 研究方向：眼視光學(xué)。E-mail: xdzhou2005@163.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 02-0201-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.02.016

2016-10-09