臧 劍，顏育民，張志剛，鄒世湘，彭 瓊

（1.廣東菰稻農業(yè)有限公司，廣東 廣州 511400；2.湖南雜交水稻研究中心，湖南 長沙410125；3.湖南旺湘隆農業(yè)有限公司，湖南 長沙 410125；4.湖南省農業(yè)生物技術研究中心，湖南 長沙 410125）

菰均一化全長cDNA 文庫的構建

臧 劍1，顏育民2，張志剛2，鄒世湘3，彭 瓊4

（1.廣東菰稻農業(yè)有限公司，廣東 廣州 511400；2.湖南雜交水稻研究中心，湖南 長沙410125；3.湖南旺湘隆農業(yè)有限公司，湖南 長沙 410125；4.湖南省農業(yè)生物技術研究中心，湖南 長沙 410125）

為了獲得國家二級保護植物品種菰的功能基因信息，并克隆功能基因片段，研究以SMART（switching mechanism at 5 end of RNA transcript）方式合成菰全長cDNA，結合DSN（duplex-specific nuclease）均一化技術，構建菰葉片組織的均一化全長cDNA文庫。該cDNA文庫庫容量大，達到了3.6×106PFU/mL，插入片段平均長度為1 000 bp，重組率為97.9%。均一化全長cDNA文庫能有效富集低豐度表達基因，降低冗余率，適用于目的基因的篩選，以及后續(xù)的基因、蛋白互作分析。

菰；均一化；cDNA文庫；功能基因

菰（Zizania latifolia （Griseb.） Stapf）即茭白，為多年水生禾本科植物，國家二級保護植物品種，也是水稻的近緣屬。菰米是菰的穎果，又稱茭米、黑米、雕胡米、雕菰、茭白子[1]。由于生物量大、抗病蟲害能力強、耐寒性好等優(yōu)良性狀，近年來被專家學者用作水稻遺傳育種優(yōu)良基因資源庫的重要來源之一[2]。然而，針對菰的分子生物學研究仍然處于起步階段，菰的遺傳信息尚未完全獲知，這嚴重阻礙了其作為水稻育種優(yōu)良基因資源庫的應用。

構建cDNA文庫是功能基因組學研究的基本手段之一，在研究某類特定細胞基因組表達狀態(tài)及基因的功能鑒定方面具有特殊的優(yōu)勢，在動植物的個體發(fā)育及細胞周期調控（細胞分化、細胞衰老和凋亡）等生命進程的研究中具有更為廣泛的應用價值[3]。然而，以常規(guī)方法構建的cDNA文庫通常面臨著高通量分析過程中重復拷貝比例高這一問題，對基因的篩選和鑒定造成不必要的浪費[4]。研究表明，這一問題主要是因為高等真核生物的細胞中基因表達水平差異較大引起的。

為了克服基因轉錄水平上巨大差異給文庫篩選和分析帶來的障礙，人們試圖在文庫測序前就降低高豐度轉錄本的克隆，增加中、低豐度轉錄本出現的頻率，以有利于低豐度表達基因的發(fā)現[5]。因此，均一化cDNA文庫便應運而生。目前，主要有2種觀點來構建均一化cDNA文庫[6]。一種是以復性動力學為原理。通常，高豐度cDNA在退火下復性速度快，而低豐度cDNA復性需要較長時間，從而可以通過控制復性時間來降低豐度；另一種則認為基因組DNA在拷貝數上具有相對均一化的性質，那么通過cDNA和DNA的飽和雜交就可以降低文庫中高拷貝存在的cDNA豐度，從而降低高豐度轉錄本的克隆。自1990年首次報道均一化cDNA文庫以來，各種構建方法便層出不窮，目前該技術已日趨完善，市場上也有各種試劑盒以供選擇。

該研究以菰幼嫩的葉片組織為試驗材料，采用雙鏈特異性核酸酶（DSN）酶切的均一化技術并結合SMART技術構建葉片的均一化全長cDNA文庫，并從中挑取陽性克隆進行測序及生物信息學分析，該方法不僅能解決常規(guī)操作步驟復雜、RNA容易降解的問題，而且能夠克服基因轉錄水平上的巨大差異，提高發(fā)現隨機序列和稀有基因的幾率，為菰新基因的發(fā)掘和功能基因組學的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試材料 供試材料菰取自湖南省沅江市洞庭湖區(qū)，選取生長狀況良好的菰幼嫩葉片，迅速投入液氮，存于-70℃ 超低溫冰箱備用。

1.1.2 主要試劑 Plant RNA提取試劑盒Tiangen（北京）、凝膠回收試劑盒（PureLink Quick Gel Extraction and PCR Purification Combo Kit）、SMART cDNA Library Construction Kit（Clontech，634901）、QIA quick PCR Purification Kit（Qiagen，28104）、Advantage 2 Polymerase Mix（Clontech，639201）、Duplex-Specific Natlax（Evrogen，EA003）、Sfi I（NEB，R0123L）、DL2000 Marker（TaKaRa，D501A）。

1.2 試驗方法

1.2.1 菰總RNA獲得 使用Plant RNA（Tiangen，北京）提取試劑盒提取菰幼嫩葉片的RNA。

1.2.2 雙鏈全長cDNA的合成 使用SMART cDNA Library Construction Kit（Clontech，Cat. No.634901）試劑盒（5′和3′端均帶有特異引物的全長cDNA）合成第1鏈。使用CDS III/3'引物和特異引物5'引物（5'-AAG CAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'），通過LD-PCR（long distance polymerasechain reaction）反應合成雙鏈全長cDNA，純化后用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.3 蛋白酶K消化 蛋白酶K消化參照鄭鴻昌等[7]的方法，加入25 μL去離子水溶解沉淀，最后取5 μL樣品進行電泳檢測。

1.2.4 cDNA文庫均一化 （1）雜交。將已純化的雙鏈cDNA加入0.2 mL PCR管中與雜交試劑混勻，而后分為4等分置于PCR管中。反應體系（16 μL）：ds cDNA (1 μg) 8 μL；2×Hybridization buffe 8 μL。反應條件：98℃預處理2 min，然后迅速轉入68℃中雜交5 h。（2）DSN消化。反應體系（10 μL）：雜交后的cDNA 4 μL；2×DSN master buffer（68℃預熱）5 μL；DSN solution（含DSN，1/2 DSN，1/4 DSN，control）1 μL。反應條件：68℃反應 25 min后；加入10 μL 2×DSN stop buffer室溫放置5 min終止反應，-20℃保存。（3）兩次PCR放大。cDNA均一化后，參照蔣敏等[8]的方法進行兩次PCR的放大處理。取5 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 cDNA文庫構建 （1）酶切消化。反應體系（100 μL）：ds cDNA（2 g）79 μL；10×Sfi Buffer 10 μL；Sfi I酶10 μL；100×BSA 1 μL。反應條件：50℃溫浴2 h進行sfi I酶切消化。（2）質粒轉化。純化酶切cDNA后，T4 DNA連接酶與適量的pUC19改造載體于4℃下連接過夜進行質粒轉化，此時即為初始均一化全長cDNA文庫。（3）文庫放大。為了放大文庫的質量，挑選24個克隆，37℃，200 r/min培養(yǎng)過夜，利用M13正反向引物進行菌落PCR擴增。反應體系（25 μL）：ddH2O 19.5 μL；10×PCR Buffer 2.5 μL；50×dNTP Mix 0.5 μL；M13F引物 0.5 μL；M13R引物 0.5 μL；rTag酶 0.5 μL；PCR模板1 μL。反應程序：94℃ 3 min； 94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 1 min；36個循環(huán)；72℃ 5 min。從各管中分別取5 μL PCR產物進行電泳檢測。

1.2.6 均一化效率驗證 取200 μL菌液涂布于15 cm培養(yǎng)皿上（Apr-IPTG/x-gal LB固體培養(yǎng)基），觀察記錄菌落總數，按照“重組率（%）=（菌落總數-藍斑總數）/菌落總數×100”的公式計算重組率。按照公式“文庫容量=克隆數/涂板體積×稀釋倍數×重組液體積”計算文庫容量。式中，涂板體積為0.2 mL，稀釋倍數為10，重組液體積為30 mL。參照高山等[9]的方法，以1/2 DSN和control為模板，利用用18S管家基因進行PCR檢測，經Tanon GIS軟件分析灰度后，驗證cDNA文庫的均一化效率。

2 結果與分析

2.1 cDNA 質量鑒定

如圖1所示，反轉錄后cDNA 呈現均勻的彌散帶，大小分布在750～2 000 bp，符合植物雙鏈cDNA 長度。彌散帶的亮度代表菰葉片中的RNA 成分具有多樣性和復雜性。試驗中合成的cDNA 質量較高，可以進行下一步試驗。

圖1 菰葉片cDNA 電泳圖

2.2 均一化處理cDNA及效果分析

未經過均一化處理的傳統cDNA文庫具有高豐度轉錄基因克隆數目過多的缺點[10]。在該研究中，與對照相比，cDNA經過3個不同濃度DSN的均一化處理后在第一次PCR擴增時發(fā)現，1/4DSN均一化處理后，PCR產物中間較亮的條帶消失明顯，呈現一條均勻的彌散條帶（圖2A），表明高豐度表達基因的豐度呈現出明顯下降的趨勢。因此，選擇1/4DSN的cDNA進行第2次PCR放大。檢測結果同樣顯示擴增條帶均勻彌散，擴增產物有所增加（圖2B），可以用于建庫。

2.3 cDNA文庫質量分析

重組菌涂布試驗結果顯示，菌落總數為2 440個，其中藍斑50個，即：重組率=（2 440-50）/2 440=97.9%，具有較高的重組效率。通過計算得出文庫容量為3.6×106PFU/mL。隨機挑取24個陽性克隆，用插入位點兩側引物進行菌落PCR擴增電泳檢測，發(fā)現插入片段大多＞750 bp，平均大小為1 000 bp（圖3）。以1/2 DSN和對照為模板，用18S管家基因進行PCR，產物經電泳后用Tanon GIS軟件分析灰度，結果顯示該cDNA文庫均一化后比非均一化的豐度下降26 倍以上（圖4）。

圖2 DNS消化cDNA后第1次PCR放大檢測（A）和第2次PCR放大檢測（B）

圖3 隨機挑取24個陽性克隆進行插入片段的PCR檢測

圖4 均一化效率驗證

3 討 論

構建cDNA文庫是獲得研究對象基因序列信息的有效方法之一，可為新基因的發(fā)掘、功能基因的鑒定提供高效、便捷的途徑。經典的cDNA文庫構建往往所需時間較長、克隆的片段較短，不能提供完整的mRNA信息，而均一化的cDNA文庫能增加低豐度mRNA的表達機會。

重組率、庫容量、插入片段大小及均一化效果等是對均一化cDNA文庫構建質量的主要評價指標[11]。該研究獲得的原始文庫容量為3.6×106PFU/mL，保證了文庫的完整性與覆蓋度。插入片段平均長度為1 000 bp，重組率為97.9%，均一化全長cDNA文庫能有效富集低豐度表達基因，降低冗余率。研究結果表明，該文庫是一個高質量的全長均一化cDNA文庫。該方法構建的文庫不僅為功能基因的驗證奠定了基礎，而且為進一步發(fā)掘和利用菰自身有利基因打下了基礎。

[1] 金增輝. 菰米的營養(yǎng)化學與開發(fā)利用[J]. 糧食加工，2016，41（1）：58-61.

[2] 沈瑋瑋，宋成麗，陳 潔，等. 轉菰候選基因克隆獲得抗白葉枯病水稻植株[J]. 中國水稻科學，2010，24（5）：447-452.

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[6] Zhang Z Q，Xiao G，Tan T L，et al. Advances in normalized cDNA library and its applications[J]. Agricultural Science＆Technology，2010，（4）：1-5，43.

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（責任編輯：成 平）

Establishment of a Normalized Full-Length cDNA Library of Zizania latifolia

ZANG Jian1，YAN Yu-min2，ZHANG Zhi-gang2，ZOU Shi-xiang3，PENG Qiong4
（1. Guangdong Gudao Agricultural Limited Company, Guangzhou 511400, PRC; 2. Hunan Hybrid Rice Research Center, Changsha 410125, PRC; 3. Hunan Wangxianglong Agricultural Limited Company, Changsha 410125, PRC; 4. Hunan Agricultural Biotechnology Research Center, Changsha 410125, PRC）

In order to obtain functional genes, a narmalized stems cDNA library was constructed from precious plant Zizania latifolia (Griseb.) Stapf. SMART (switching mechanism at 5 end of RNA transcript) cDNA synthesis combined with DSN (duplex-specific, nuclease) normalization was applied to construct the normalized full-length cDNA library of Z. latifolia. The titer of cDNA library was about 3.6×106PFU/mL and the average insertion size was about 1.0 kb with high recombination rate (97.9%). Homogenization full-length cDNA library enrichment of low abundance is suitable for the purpose of gene selection and subsequent analysis of the gene and protein interactions, for expressing genes effectively and reducing the redundancy rate.

Zizania latifolia; normalization; cDNA library; functional gene

Q943.2

A

1006-060X（2017）04-0011-03

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.004.003

2017-02-08

湖南農業(yè)科技創(chuàng)新資金（2016QN08）

臧 劍（1972-），男，湖南沅江市人，工程師，主要從事水稻育種研究。

彭 瓊