趙健宇，劉立立，蘭時(shí)樂，楊友才

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

好氧反硝化細(xì)菌LKX-1菌株培養(yǎng)基與發(fā)酵條件的優(yōu)化

趙健宇，劉立立，蘭時(shí)樂，楊友才

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

采用單因素試驗(yàn)法研究了蒙氏假單胞菌LKX-1菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件，并采用正交試驗(yàn)法對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：麥芽糖 2.0%，酵母粉 2.0%，KH2PO40.15%，MgSO4·7H2O 0.10%；最適發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度30℃，接種量1.0%，初始pH值7.0，裝液量100 mL/瓶（三角瓶容量250 mL），發(fā)酵時(shí)間24 h；在此條件下，發(fā)酵液中活菌數(shù)可達(dá)4.5×1014CFU/mL。

好氧反硝化細(xì)菌；培養(yǎng)基；發(fā)酵條件；優(yōu)化

由于農(nóng)村生活廢水存在排放不集中、收集困難等問題，因此很難將城市生活污水處理方法向農(nóng)村推廣應(yīng)用；加上我國大部分農(nóng)村沒有污水排放管網(wǎng)和污水處理系統(tǒng)，導(dǎo)致這些生活污水未經(jīng)任何處理就直接排放到自然環(huán)境中，農(nóng)村河道、地下水水體污染越來越嚴(yán)重，對(duì)生態(tài)環(huán)境造成了極大破壞。目前，這一問題已引起了社會(huì)的廣泛關(guān)注。當(dāng)前，對(duì)于農(nóng)村生活廢水較為成熟的處理技術(shù)主要有穩(wěn)定塘處理技術(shù)[1]、人工濕地處理系統(tǒng)[2]、土地處理技術(shù)[3]和生物膜技術(shù)[4-5]等。盡管這些技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中取得了一定效果，但也存在投資和處理成本較高、工藝復(fù)雜、占地面積大以及處理效果不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。

近年來，生物脫氮因其高效、安全、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)成為污水凈化研究的熱點(diǎn)。但傳統(tǒng)的反硝化細(xì)菌基本為厭氧菌，其對(duì)生長環(huán)境和污水處理?xiàng)l件要求嚴(yán)格，制約了生物除氮技術(shù)在污水處理中的推廣應(yīng)用。于是，好氧反硝化菌便進(jìn)入了人們的視線。好氧反硝化細(xì)菌包括泛養(yǎng)副球菌（Paracoccus pantotropha）、假單胞菌屬的某一種（Pseudomonas spp.）和糞產(chǎn)堿菌（Alcaligenes faecalis）、Aquaspirillum、Thauera、生絲微菌屬（Hyphomicroobium）[6-9]等，這些細(xì)菌在污水脫氮處理方面已有大量應(yīng)用報(bào)道[10-11]。課題組從水稻土中分離到了一株脫氮能力較強(qiáng)的好氧硝化細(xì)菌LKX-1[12]，筆者對(duì)其適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了初步研究，以期為該菌株在農(nóng)村生活廢水生物除氮處理中的應(yīng)用奠定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 蒙氏假單菌LKX-1（Pseudomonas monteilii LKX-1），由洞庭湖農(nóng)村生態(tài)健康湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定和保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，NaCl 0.5%，瓊脂2%，pH值7.0～7.5。種子培養(yǎng)基：葡萄糖3%，蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，NH4NO30.5%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH值7.0～7.5?；A(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2%，蛋白胨1%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH值7.0～7.5。以上培養(yǎng)基均在121℃滅菌25 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培 養(yǎng) 斜面培養(yǎng)：將分離得到的目的菌株接種于斜面培養(yǎng)基表面，在30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。液體種子培養(yǎng)：將斜面菌種接種于液體種子培養(yǎng)基中，30℃，180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，備用。發(fā)酵培養(yǎng)：按2%（V/V）的接種量將培養(yǎng)好的液體種子接入裝有100 mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃，180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基的單因素試驗(yàn) （1）碳源：改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中碳源的種類，分別加入2%的葡萄糖、乙酸鈉、蔗糖、玉米淀粉、麥芽糖，其他條件不變，培養(yǎng)24 h后測定活菌數(shù)。（2）麥芽糖濃度：在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的麥芽糖，其他條件不變，培養(yǎng)24 h后測定活菌數(shù)。（3）氮源種類：在等氮條件下，在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加硝酸銨、豆餅粉、蛋白胨、魚粉、酵母粉，其他條件不變，培養(yǎng)24 h后測定活菌數(shù)。（4）酵母粉濃度：在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入1.7%、2.0%、2.3%、2.6%、2.9%的酵母粉，其他條件不變，培養(yǎng)24 h后測定活菌數(shù)。（5）KH2PO4濃度：改變基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中KH2PO4濃度，分別添加0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%的KH2PO4，其他條件不變，培養(yǎng)24 h后測定活菌數(shù)。（6）MgSO4·7H2O濃度：在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%的MgSO4·7H2O，其他條件不變，培養(yǎng)24 h后測定活菌數(shù)。

1.2.3 發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn) （1）初始pH值：用稀酸或稀堿分別調(diào)節(jié)基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，其他條件不變，培養(yǎng)24 h后測定活菌數(shù)。（2）接種量：將培養(yǎng)好的液體種子分別按0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%（V/V）的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，其他條件不變，培養(yǎng)24 h后測定活菌數(shù)。（3）裝液量：在250 mL三角瓶中分別添加80、90、100、110、120 mL的發(fā)酵培養(yǎng)基，其他條件不變，培養(yǎng)24 h后測定活菌數(shù)。（4）發(fā)酵時(shí)間：在上述得到的適宜條件下，發(fā)酵12 h后開始取樣，以后每隔12 h取樣一次，直到60 h后終止培養(yǎng)，測定活菌數(shù)。

1.2.4 發(fā)酵條件的正交優(yōu)化 選擇對(duì)活菌數(shù)影響較大的因素如培養(yǎng)基的初始pH值、接種量和發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行3因素3水平的L9（33）正交優(yōu)化，正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)因素水平

1.3 活菌數(shù)的測定

準(zhǔn)確吸取10 mL發(fā)酵液于90 mL帶有適量玻璃珠的無菌水中，振蕩10 min后，采用10倍稀釋法依次稀釋至10-10，分別吸取10-8、10-9、10-10這3個(gè)稀釋度的稀釋液0.1 mL于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板表面，涂布均勻，于30℃下恒溫培養(yǎng)24 h，計(jì)數(shù)平板上的菌落數(shù)。選取菌落數(shù)在30～300的稀釋度平板的平均菌落數(shù)進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算公式如下：

活菌數(shù)（CFU/mL）=某一稀釋度下的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×1/V。

式中，V表示接種體積（mL）。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1 碳 源 微生物細(xì)胞中，含碳量占據(jù)干重的一半，因此除水分外，碳源是微生物生長過程中需求量最大的營養(yǎng)物質(zhì)[9]。它既是細(xì)胞碳架的組成成分，也是維持細(xì)胞生命活動(dòng)的的能量物質(zhì)，以及代謝產(chǎn)物的組成成分，在配置微生物培養(yǎng)基時(shí)有重要的指導(dǎo)作用。由圖1可知，不同碳源下蒙氏假單胞菌LKX-1液體發(fā)酵培養(yǎng)的活菌數(shù)差異較大，其中以麥芽糖為碳源時(shí)，發(fā)酵液中活菌數(shù)最多，達(dá)到2.93×1013CFU/mL。故選擇麥芽糖作為蒙氏假單胞菌LKX-1發(fā)酵培養(yǎng)的碳源。

圖1 碳源種類對(duì)蒙氏假單胞菌LKX-1發(fā)酵培養(yǎng)活菌數(shù)的影響

2.1.2 麥芽糖添加量 不合適的碳源濃度將影響培養(yǎng)基的滲透壓、碳氮比等，進(jìn)而影響微生物的生長、繁殖和代謝。從圖2中可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著麥芽糖添加量的增加，蒙氏假單胞LKX-1的活菌數(shù)逐漸降低；當(dāng)麥芽糖添加量大于等于2.0%時(shí)，細(xì)菌生長受到嚴(yán)重影響；當(dāng)麥芽糖添加量為1.0%時(shí)，活菌數(shù)最多，為2.97×1013CFU/mL。故選擇麥芽糖添加量為1.0%。

2.1.3 氮源種類 氮是構(gòu)成細(xì)胞生命物質(zhì)蛋白質(zhì)和核酸等的主要元素，通常占細(xì)胞干重的12%～15%，微生物對(duì)不同氮源的利用能力不同。由圖3可知，在等氮條件下，當(dāng)以酵母粉為氮源時(shí)，發(fā)酵液中活菌數(shù)最大，達(dá)到2.59×1013CFU/mL。故選擇酵母粉作為蒙氏假單胞菌LKX-1發(fā)酵培養(yǎng)的氮源。

圖2 麥芽糖添加量對(duì)蒙氏假單胞菌LKX-1發(fā)酵培養(yǎng)活菌數(shù)的影響

圖3 氮源種類對(duì)蒙氏假單胞菌LKX-1發(fā)酵培養(yǎng)活菌數(shù)的影響

2.1.4 酵母粉添加量 從圖4中可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著酵母粉濃度的增加，發(fā)酵液中活菌數(shù)隨之增加。當(dāng)酵母粉添加量為2.0%時(shí)，活菌數(shù)達(dá)2.96×1013CFU/mL。酵母粉添加量超過2%時(shí)，發(fā)酵液中活菌數(shù)快速下降。原因是隨著酵母粉添加量的增加，改變了培養(yǎng)基中的C/N，從而影響了菌株的生長繁殖。故選擇酵母粉添加量為2.0%。

圖4 酵母粉添加量對(duì)蒙氏假單胞菌LKX-1發(fā)酵培養(yǎng)活菌數(shù)的影響

2.1.5 KH2PO4添加量 無機(jī)鹽或礦質(zhì)元素的主要作用之一是為微生物提供碳、氮源以外的各種重要元素，在細(xì)胞內(nèi)起著調(diào)節(jié)酶促反應(yīng)、維持細(xì)胞膜平衡以及滲透壓的作用。鹽濃度的大小影響著微生物的呼吸速率以及酶活性的大小[13]。磷是細(xì)胞中核酸和蛋白質(zhì)的必要成分，也是細(xì)胞中三磷酸腺苷的組成成分。適量的磷有利于促進(jìn)糖代謝，但磷含量過低或過高，都會(huì)影響微生物的生長和代謝。從圖5中可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨KH2PO4濃度的增加，發(fā)酵液中活菌數(shù)也隨之增加；當(dāng)KH2PO4濃度為0.15%時(shí)，活菌數(shù)最多，達(dá)到3.03×1013CFU/mL；當(dāng)濃度超過0.15%時(shí)，活菌數(shù)顯著下降。故選擇KH2PO4添加量為0.15%。

圖5 KH2PO4添加量對(duì)蒙氏假單胞菌LKX-1發(fā)酵培養(yǎng)活菌數(shù)的影響

2.1.6 MgSO4·7H2O添加量 鎂離子不參與任何細(xì)胞物質(zhì)的合成，但它是許多重要酶的激活劑，鎂離子不但影響基質(zhì)的氧化，還影響蛋白質(zhì)的合成，能促進(jìn)碳水化合物的新陳代謝、核酸的合成、磷酸鹽的轉(zhuǎn)化等。由圖6可知，當(dāng)MgSO4·7H2O添加量為0.10%時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到2.85×1013CFU/mL，但當(dāng)MgSO4·7H2O添加量超過0.10%，活菌數(shù)隨之下降。故選擇MgSO4·7H2O添加量為0.10%。

圖6 MgSO4·7H2O添加量對(duì)蒙氏假單胞菌LKX-1發(fā)酵培養(yǎng)活菌數(shù)的影響

2.2 發(fā)酵條件的優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果 （1）初始pH值。由圖7可知，在6.0～7.5范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)基初始pH值升高，活菌數(shù)隨之增加，當(dāng)培養(yǎng)基初始pH值為7.5時(shí)，發(fā)酵液中活菌數(shù)最大，達(dá)到4.5×1013CFU/mL。（2）接種量。接種量過少，會(huì)導(dǎo)致延滯期和發(fā)酵周期延長，并增加了發(fā)酵過程中雜菌污染的幾率；接種量過多，會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵前期營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快而影響發(fā)酵后期的供應(yīng)，同時(shí)隨著種子帶入的發(fā)酵副產(chǎn)物也會(huì)影響微生物的生長繁殖。由圖8可知，當(dāng)接種量為1%時(shí)，活菌數(shù)達(dá)到6.0×1013CFU/mL。但接種量超過1%，活菌數(shù)明顯下降。（3）裝液量。氧氣是好氧微生物生長繁殖的必需生長條件，培養(yǎng)基中溶氧量對(duì)菌體的生長、代謝產(chǎn)物的形成都會(huì)產(chǎn)生影響。工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中，往往通過增加通風(fēng)量和提高攪拌速度來滿足菌體對(duì)氧氣的需求；而實(shí)驗(yàn)室條件下，則是通過裝液量和搖床轉(zhuǎn)速來調(diào)節(jié)培養(yǎng)液中的溶氧量。裝液量大，三角瓶中相對(duì)空間較小，培養(yǎng)液中溶解氧含量低；裝液量過小，雖然能提高培養(yǎng)液中的溶氧量，但由于培養(yǎng)基中的水分蒸發(fā)速度過快會(huì)使培養(yǎng)液中代謝副產(chǎn)物濃度提高，從而影響微生物的生長。于是，適宜的裝液量對(duì)細(xì)菌發(fā)酵也很關(guān)鍵。由圖9可知，在250 mL三角瓶中裝100 mL培養(yǎng)液，活菌數(shù)最多，達(dá)到5.4×1013CFU/mL。（4）發(fā)酵時(shí)間。由圖10可知，在最優(yōu)培養(yǎng)基配方以及最佳接種量和裝液量的條件下，蒙氏假單胞菌LKX-1發(fā)酵培養(yǎng)的最適培養(yǎng)時(shí)間為24 h時(shí)，活菌數(shù)最高，達(dá)到6.6×1013CFU/mL。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過24 h時(shí)，活菌數(shù)顯著下降。這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)時(shí)間過長，培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)消耗、代謝副產(chǎn)物積累和菌體生長環(huán)境如pH值等的改變，導(dǎo)致菌體生長減緩甚至死亡，加上蒙氏假單胞菌是非芽孢菌，對(duì)環(huán)境中各種因素較為敏感，由此加速了蒙氏假單胞菌菌體的死亡。

圖7 初始pH值對(duì)蒙氏假單胞菌LKX-1發(fā)酵培養(yǎng)活菌數(shù)的影響

圖8 接種量對(duì)蒙氏假單胞菌LKX-1發(fā)酵培養(yǎng)活菌數(shù)的影響

圖9 裝液量對(duì)蒙氏假單胞菌LKX-1發(fā)酵培養(yǎng)活菌數(shù)的影響

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 從表2中極差數(shù)據(jù)可以看出，各因素中對(duì)活菌數(shù)影響最大的是發(fā)酵時(shí)間，其次是接種量，而初始pH值的影響最?。挥杀?中各影響要素的均值大小可知，發(fā)酵條件的最佳優(yōu)化組合為A1B2C2，即發(fā)酵時(shí)間為24 h，接種量為1.0%，初始pH值為7.0。在最佳發(fā)酵條件下，菌株LKX-1的活菌數(shù)為4.5×1014CFU/mL，其活菌數(shù)比優(yōu)化前提高了近15倍。

圖10 發(fā)酵時(shí)間對(duì)蒙氏假單胞菌LKX-1發(fā)酵培養(yǎng)活菌數(shù)的影響

表2 發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)與討論

反硝化細(xì)菌越來越受到科研工作者的重視，其在工業(yè)廢水、養(yǎng)殖廢水和農(nóng)村生活廢水等污水處理領(lǐng)域的應(yīng)用逐漸成為研究的熱點(diǎn)。各種反硝化細(xì)菌具有不同的好氣性，培養(yǎng)基營養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件對(duì)反硝化細(xì)菌的生長也有較大影響[14-15]。張玉芹等[16]研究了好氧反硝化細(xì)菌B88和B237的發(fā)酵條件，它們?cè)赮B培養(yǎng)基中生長的菌體濃度分別為6.1×108和1.54 ×108個(gè)/mL；吳美仙等[17]分離到1株具有較強(qiáng)反硝化作用能力的菌株D2，在最適培養(yǎng)條件下最高生長濃度為4.2×105個(gè)/mL。該研究以從水稻田中分離的好氧反硝化細(xì)菌蒙氏假單胞菌LKX-1為菌種，采用單因素試驗(yàn)法研究了其發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件，并采用正交試驗(yàn)法對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，獲得適宜的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：麥芽糖 2.0%，酵母粉 2.0%，KH2PO40.15%，MgSO4·7H2O 0.10%；最適發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度30℃，接種量為1.0%，初始pH值 7.0，裝液量100 mL/瓶（三角瓶容量250 mL），發(fā)酵時(shí)間24 h。在此條件下，發(fā)酵液中活菌數(shù)最高可達(dá)4.5×1014CFU/mL。

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（責(zé)任編輯：成 平）

Studies on the Culture Medium and Fermentation Conditions of the Aerobic Denitrifier LKX-1

ZHAO Jian-yu，LIU Li-li，LAN Shi-le，YANG You-cai

（College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, PRC）

The composition of fermentation medium and fermentation conditions were studied by using single-factor test, and the fermentation conditions were optimized by using orthogonal experiment. The results showed that the optimal fermentation medium were as follows: maltose 2%, yeast powder 2%, KH2PO40.15%, MgSO4·7H2O 0.10%, and the optimal fermentation conditions were as follows: fermentation temperature 30℃, inoculation 1%, the initial pH 7.0, the liquid volume 100 mL/ bottle, fermentation time 24 h. Under these conditions, the viable count reached 4.5×1014CFU/mL.

aerobic denitrifier; culture medium; fermentation conditions; optimization

Q815

A

1006-060X（2017）04-0014-05

10.16498/j.cnki.hnnykx.2017.004.004

2017-02-09

湖南省農(nóng)業(yè)委員會(huì)2016年湖南重金屬污染耕地修復(fù)及農(nóng)作物種植結(jié)構(gòu)調(diào)整試點(diǎn)資金專項(xiàng)（湘財(cái)農(nóng)指〔2016〕130號(hào)）；湖南省環(huán)?？蒲许?xiàng)目（2015-109）

趙健宇（1992-），男，遼寧鞍山市人，碩士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)境生態(tài)學(xué)。

楊友才