馬銘研，吳惠芳，章璐幸，陳維

（浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江寧波315000）

響應(yīng)面法優(yōu)化厚殼貽貝多糖提取工藝及抗腫瘤活性研究

馬銘研，吳惠芳，章璐幸*，陳維

（浙江醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，浙江寧波315000）

以厚殼貽貝多糖提取率為響應(yīng)值，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，以液料比、酶解溫度、酶解時間和pH值為試驗因素，采用響應(yīng)面法建立數(shù)學(xué)模型，篩選最佳提取工藝條件；建立小鼠S180實體瘤模型，分為模型對照組、厚殼貽貝多糖實驗低、中、高劑量組、環(huán)磷酰胺對照組。測定小鼠腫瘤生長抑制率、脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。通過二次回歸模型響應(yīng)面分析，確定厚殼貽貝多糖的最佳提取工藝條件為液料比9.8 mL/g、酶解溫度46℃、酶解時間133 min和pH5.9，在此條件下厚殼貽貝多糖提取率為19.2%，與模擬方程得出的18.9%無顯著性差異；并且中、高劑量厚殼貽貝多糖對小鼠的腫瘤抑制率分別為36.8%和51.9%。得到酶解法提取厚殼貽貝多糖的最佳提取工藝并證實其免疫增強(qiáng)作用。

厚殼貽貝多糖；響應(yīng)面；抗腫瘤；酶解法

厚殼貽貝，俗稱“淡菜”，在浙江沿海廣泛分布，養(yǎng)殖技術(shù)成熟。我國古代對貽貝的藥用價值就有研究，《本草匯言》載：淡菜，補(bǔ)虛養(yǎng)腎之藥也[1]。而在現(xiàn)代研究中，也證實了貽貝提取物含有多種維生素和碘、鐵、鈣等物質(zhì)，其中的有維生素B族和多種微量元素具有醫(yī)治口角炎、舌炎、眼疾和貧血，改善人體血液循環(huán)的功能。貽貝還可作為防治動脈粥樣硬化和高血壓的保健食品[2]。目前，關(guān)于厚殼貽貝多糖（Mytilus coruscus polysaccharides，MCP）提取的研究不多，而且沒有關(guān)于酶解法提取工藝優(yōu)化的相關(guān)研究。通過此試驗使用響應(yīng)面法優(yōu)化厚殼貽貝多糖提取工藝，并進(jìn)一步探究厚殼貽貝多糖是否有抑制腫瘤的作用，為厚殼貽貝合理開發(fā)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 動物及瘤株

ICR小白鼠，雄性和雌性各25只，清潔級，體質(zhì)量18 g～22 g：由杭州醫(yī)學(xué)研究中心提供；S－180肉瘤細(xì)胞，參考文獻(xiàn)[3]方法培養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器

正丁醇、乙醇、氯仿、氫氧化鈉（均為分析純）、胰蛋白酶（1 000 U）：寧波奧博有限公司。

可見分光光度計（722S）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；恒溫水浴鍋（HH-1，HH-2）：上海精密科學(xué)儀器有限公司；電子天平（BS124S）：北京北分天普儀器技術(shù)有限公司；離心機(jī)（LXJ-IIB）：上海金鵬分析儀器有限公司。

2 方法

2.1 厚殼貽貝多糖的提取

稱取100 g厚殼貽貝勻漿，經(jīng)酶法浸提、脫脂、去蛋白、離心、加乙醇得到厚殼貽貝多糖粗品，冷凍凍干得到厚殼貽貝多糖。

2.2 多糖含量的測定

多糖測定采用苯酚－硫酸法[4]。以葡萄糖（mg/mL）作為標(biāo)準(zhǔn)品制定標(biāo)準(zhǔn)曲線測定提取液中厚殼貽貝多糖的含量，待測樣品用純化水稀釋后，使得吸光度值在0.2～0.8的有效范圍內(nèi)。厚殼貽貝多糖提取率計算如下：Y/%=[（A×B）/1 000C]×100，式中：Y為多糖提取率，%；A為由回歸方程求得的多糖濃度，（mg/mL）；B為多糖液體積，mL；C為厚殼貽貝質(zhì)量，g。

2.3 多糖提取單因素試驗

分別考察pH值（4.0、5.0、6.0、7.0）、液料比[5、10、15、20（mL/g）]、酶解溫度（30、40、50、60℃）和酶解時間（60、120、150、240 min）對厚殼貽貝多糖提取率的影響。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

依據(jù)單因素試驗得到的結(jié)果，選擇液料比、酶解溫度、酶解時間、pH值為變量，根據(jù)Box-Behnken設(shè)計，進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗，利用Design Expert軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，因素水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面因素設(shè)計和水平Table 1 Independent variables and their levels used in the response surface design

2.5 腫瘤模型的建立

按移植性腫瘤研究法建立小鼠模型[5]。在無菌條件下，于生長狀況、體重相同的健康小鼠左后肢皮下接種S180腫瘤細(xì)胞液，每只0.2 mL，共50只，雌雄各半，建立荷瘤小鼠模型。

2.6 分組及給藥

接種24 h后，隨機(jī)分成模型組、環(huán)磷酰胺組（25 mL/kg）、厚殼貽貝多糖低、中、高劑量組（50、100、200 mL/kg），共5組：每組隨機(jī)挑選雌、雄小鼠各5只，對每只小鼠分別進(jìn)行稱重，做好標(biāo)記，并做好記錄，每日灌胃給藥，連續(xù)給藥一周。

2.7 體內(nèi)抗腫瘤作用研究

末次給藥24 h后稱其體質(zhì)量，計算體質(zhì)量增加值；頸椎脫臼處死小白鼠，摘取瘤塊、脾臟及胸腺并稱重，計算抑瘤率、脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)。公式如下：

抑瘤率/%=（模型組瘤重-給藥組瘤重）/模型組瘤重×100；

脾臟指數(shù)=小鼠脾重（mg）/小鼠的體質(zhì)量（g）；

胸腺指數(shù)=小鼠的胸腺重（mg）/小鼠的體質(zhì)量（g）；

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗

各因素對多糖提取率的影響見圖1。

圖1 各因素對多糖得率的影響Fig.1 Effect of extraction parameters on yield of MCP

如圖1a所示，當(dāng)提取pH值達(dá)到6以上時，多糖提取率達(dá)到最大，隨著pH值的進(jìn)一步增加，多糖提取率呈下降趨勢，分析原因可能胰蛋白酶在弱酸性環(huán)境下分解蛋白的能力變?nèi)酰赃x擇pH4～6范圍提取厚殼貽貝多糖適宜；如圖1b所示，當(dāng)提取溫度上升到50℃時，多糖提取率最大，隨著溫度的升高，多糖提取率沒有增加，故選擇30℃～50℃為宜；如圖1c所示，當(dāng)酶解時間大于150 min后，多糖提取率有所下降，可能酶解時間過長，酶的活力下降，故選擇60 min～150 min為宜；如圖1d所示，多糖提取率隨著液料比的增加呈先增大后減小的趨勢，當(dāng)液料比為10時，多糖提取率達(dá)到最大，然后呈下降趨勢，考慮后續(xù)工藝處理及生產(chǎn)成本，故選5（mL/g）～20（mL/g）為宜。

3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

利用Design Expert軟件設(shè)計四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，試驗方案見表2。

表2 厚殼貽貝多糖提取率的響應(yīng)面試驗方案和結(jié)果Table 2 Box behnken design and the response values for extraction yield of MCP

續(xù)表2 厚殼貽貝多糖提取率的響應(yīng)面試驗方案和結(jié)果Continue table 2 Box behnken design and the response values for extraction yield of MCP

表2中各試驗條件對應(yīng)的真實值和預(yù)測值基本接近，使用Design Expert 8.0.6對表2試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析的擬合二次多項式模型Table 3 The fitted quadratic polynomial model of ANOVA

二次回歸方程的擬合得到自變量（X1、X2、X3和X4）與多糖提取率（Y）的二次多元回歸方程：

由表3可知，模型的P＜0.05，說明模型極顯著，X1、X2、和為顯著影響因素，說明對厚殼貽貝多糖提取影響較大，該回歸模型的總決定系數(shù)和調(diào)節(jié)決定系數(shù)均說明該方程擬合程度好，試驗誤差小，故該方程模型成立可用于酶解提取多糖的分析和預(yù)測。圖2為響應(yīng)值對應(yīng)各試驗因素所形成的響應(yīng)面剖面圖。

圖2 各兩因素交互影響多糖提取率的響應(yīng)面剖面圖Fig.2 Contour plots showing the interaction between two test variables

由圖2可看出各參數(shù)之間的相互作用，圖中曲線越接近橢圓則反映兩因素交互作用越強(qiáng)，曲線越陡峭，表明該因素對多糖提取效率的影響越大[6]。由回歸方程經(jīng)處理得到最佳提取條件為：液料比9.8（mL/g）、酶解溫度46℃、酶解時間133 min和pH5.9，在此條件下厚殼貽貝多糖提取率為19.2%，與模擬方程得出的18.9%，吻合良好。

3.3 厚殼貽貝多糖對小鼠S180實體瘤生長的抑制作用

厚殼貽貝多糖對小鼠S180實體瘤生長的抑制作用結(jié)果如表4。

表4 厚殼貽貝多糖、CTX對小鼠體重、荷瘤小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響Table 4 Effect of treatment with CTX or MCP in mice bearing S180 tumor on body weight，spleen index and thymus index

厚殼貽貝多糖在低、中、高劑量時對S180肉瘤的抑制率分別為13.7%、36.8%、51.9%，其中中、高劑量時具有顯著性意義，P＜0.05和P＜0.01。值得關(guān)注的是，環(huán)磷酰胺在抑制腫瘤的同時，對小鼠的抑制明顯，體質(zhì)量顯著減少，P＜0.01；而從小鼠體質(zhì)量變化結(jié)果得知，厚殼貽貝多糖實驗組小鼠體質(zhì)量均增加，并且高劑量組與模型組相比較有顯著差異。

3.4 厚殼貽貝多糖和環(huán)磷酰胺分別對荷瘤小鼠免疫器官的影響

如表4環(huán)磷酰胺可降低荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，具有明顯的免疫抑制不良反應(yīng)。低劑量的厚殼貽貝多糖對小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)沒有明顯的影響，而中、高劑量的厚殼貽貝多糖可以顯著提高荷瘤小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)，P＜0.05和P＜0.01，顯示出較強(qiáng)的體內(nèi)免疫促進(jìn)作用。說明厚殼貽貝多糖可以改善環(huán)磷酰胺對小鼠的免疫損傷。

4 結(jié)論

目前，厚殼貽貝多糖的提取主要以熱水堿提為主[7]，多糖提取率較低，溫度過高也影響了多糖的活性，鐘城城等[8]使用聯(lián)合酶提取粗多糖具有較高的多糖提取率，證明酶解法提取多糖優(yōu)于傳統(tǒng)方法。本研究通過單因素和響應(yīng)面分析得到酶解提取厚殼貽貝多糖的最佳工藝，液料比9.8（mL/g）、酶解溫度46℃、酶解時間133 min和pH5.9，并進(jìn)行體內(nèi)抗腫瘤作用研究，中、高劑量厚殼貽貝多糖對小鼠的腫瘤抑制率分別達(dá)到36.8%和51.9%，之前的報道主要闡述厚殼貽貝多糖在體外對腫瘤細(xì)胞具有抑制作用[9－12]，本研究結(jié)果顯示，厚殼貽貝多糖在體內(nèi)也具有一定的抗腫瘤作用，為進(jìn)一步合理開發(fā)利用厚殼貽貝提供理論依據(jù)。

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Optimization of Extraction of Mytilus coruscus Polysaccharide by Response Surface Method and Investigation on Antitumor Activity

MA Ming－yan，WU Hui－fang，ZHANG Lu－xing*，CHEN Wei
（Zhejiang Pharmaceutical College，Ningbo 315000，Zhejiang，China）

Employing a three－level and four－variable Box－Behnken design and setting the Mytilus coruscus polysacchrides（MCP）extraction yield（%）as response value，the optimum enzymatic extraction conditions were as follows：extraction time was 133 min，extraction temperature was 46℃，extraction pH was 5.9，and ratio of liquid to fresh flesh was 9.8 mL/g.Under the optimized conditions，the predict extraction yield indicated from the RSM model was 18.9%，which showed compliance to the experimental yield（19.2%）.The antitumor activity was investigated in mice.The tumor growth inhibitory rate，spleen index and thymus index were calculated.The tumor inhibition rates of medium and high dose MCP were 36.8%and 51.9%，respectively，which were significantly different with model group.Spleen index and thymus index significantly increased in medium and high dose MCP group.It was obviously that MCP could improve the immunity and inhibit the growth of tumor.

Mytilus coruscus polysacchrides；response surface method；antitumor；enzyme extraction

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.007

2016－11－21

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金（21502172）；浙江醫(yī)藥高等專科學(xué)校校級課題（201509）

馬銘研（1980—），女（漢），講師，碩士，研究方向：天然產(chǎn)物開發(fā)。

*通信作者：章璐幸（1985—），女（漢），實驗師，碩士，研究方向：藥物質(zhì)量與控制。