張錦捷，袁楊，曾慶祝

（廣州大學化學化工學院，廣東廣州510006）

Zn（Ⅱ）親和肽的分離純化及肽-鋅配合作用研究

張錦捷，袁楊，曾慶祝*

（廣州大學化學化工學院，廣東廣州510006）

采用自制的殼聚糖-Zn親和層析介質(zhì)對羅非魚蛋白多肽進行分離純化，篩選出與Zn2+有較強配位作用的親和肽，并研究Zn2+與親和肽的配位作用動力學及形成配合物的結構特征。采用高效液相色譜、電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）、紫外及紅外光譜儀、掃描電子顯微鏡等分析手段對肽-鋅配合物進行結構表征。結果表明，制備的殼聚糖-Zn親和介質(zhì)能夠實現(xiàn)從羅非魚蛋白酶解產(chǎn)物中選擇性篩選分離出與Zn2+有較強配位作用的親和肽；多肽原液、TP1組分、TP2組分與Zn2+通過配合反應形成肽-鋅配合物的鋅含量分別為8.533%、1.700%、16.87%；所得親和肽與Zn2+具有較強配位作用，配合物的穩(wěn)定常數(shù)為1.005×106，并分析了肽-鋅配合物的基本結構特征。

親和層析；多肽；鋅離子；肽-鋅配合物；配合作用

鋅是人體必需的微量元素之一，它不但具有重要的生物功能，而且參與多種酶的合成與組成，與肌體的代謝及某些疾病的發(fā)生有極為密切的關系[1]。人體在進行正常的新陳代謝時，會造成人體內(nèi)鋅的大量流失，而食物中的鋅僅有10%左右能被人體吸收，因此，人們普遍存在缺鋅的現(xiàn)象[2]。相關研究表明，鋅與氨基酸、多肽等配基形成螯合物或配合物后有助于機體對鋅的吸收[3]。

固定化金屬螯合親和層析（IMAC）技術是利用蛋白質(zhì)或多肽表面暴露的一些氨基酸殘基與載體上的金屬離子親和力之間的差異來達到相關組分分離純化的效果，目前主要用于蛋白質(zhì)、酶、多肽及氨基酸的分離純化[4]。譚天偉等[5]將殼聚糖附著在玻璃微珠上，通過在殼聚糖表面引入活性配基后螯合金屬離子制成IMAC介質(zhì)后用于分離純化超氧化物歧化酶，試驗結果表明，分離純化效果良好，純化倍數(shù)達20倍，回收率達89%。Larry Riggs等[6]設計了一種采用Ca（III）-IMAC進行多級層析分離蛋白質(zhì)的方案，利用磷酸化肽與Ca（III）的親和能力，實現(xiàn)對牛奶中磷酸化肽的選擇性結合。

本文采用殼聚糖-Zn親和層析介質(zhì)從魚蛋白水解產(chǎn)物多組份體系中篩選及選擇性分離出與鋅離子有較強親和作用的多肽——親和肽，進一步研究親和肽與鋅的配合作用動力學，并解析肽-鋅配合物的分子結構特征，研究結果對深入探究微量元素-多肽配合物的功能活性及其應用具有參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

羅非魚蛋白酶解液、殼聚糖-Zn親和層析介質(zhì)：廣州大學化學化工實驗室自制。

1.1.2 主要試劑

Alcalase蛋白酶（2.4L FG，2085283 U/g）：天津諾維信生物技術有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、冰乙酸、乙酸鈉、乙二胺四乙酸二鈉、乙酸鋅、溴化鉀、無水乙醇：天津市致遠化學試劑有限公司。

1.1.3 主要儀器設備

CBS-A自動層析儀及恒流泵：上海滬西分析儀器廠有限公司；LC1260高效液相色譜液相儀：Agilent；FD-1A-50冷凍干燥機：北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；NexION 300電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：PerkinElmer；JSM-7001F掃描電子顯微鏡：JEOL；Tensor27傅里葉變換紅外光譜儀：Bruker。

1.2 方法

1.2.1 羅非魚蛋白酶解液制備

魚糜∶水=1∶3（質(zhì)量比）→調(diào)pH值→加入Alcalase蛋白酶→50℃恒溫酶解4 h→100℃滅活→冷卻→抽濾→超濾→濃縮→干燥→收集備用

1.2.2 殼聚糖-Zn親和層析介質(zhì)制備[7]

參照文獻[7]的制備方法。以殼聚糖微球為載體，環(huán)氧氯丙烷為活化劑、亞氨基二乙酸為螯合配基，氯化鋅為螯合鹽制備殼聚糖-鋅親和層析介質(zhì)。

1.2.3 層析分離

殼聚糖-鋅層析介質(zhì)柱為1.0 cm×40 cm，用5倍體積緩沖液平衡，然后取2 mL一定濃度的酶解液上樣，流速為1 mL/min。采用EDTA洗脫緩沖液洗脫，流速為1 mL/min，在280 nm波長下檢測洗脫液各組分多肽含量，收集洗脫峰，濃縮，脫鹽，凍干備用。

1.2.4 多肽含量測定

雙縮脲法[8]。

1.2.5 多肽得率計算方法

1.2.6 肽-鋅配合物的制備

多肽樣液→加入乙酸鋅→調(diào)pH 4.5→45℃水浴反應40 min→濃縮→加入無水乙醇→靜置30 min→4 000 r/min離心→收集沉淀物（肽-鋅配合物）→冷凍干燥→備用

1.2.7 肽-鋅配合物的鋅含量測定

采用ICP-MS法。

2 結果與討論

2.1 Zn2+親和肽的層析分離

比較了多肽樣液濃度、磷酸鹽緩沖液及乙酸鈉緩沖液作為上樣液、EDTA緩沖液為洗脫液對親和肽分離純化的影響。試驗結果顯示，多肽液上樣濃度為20%，pH為4.0的乙酸-乙酸鈉為緩沖液，EDTA洗脫液的濃度為0.2 mol/L，親和肽的分離純化效果較好，見圖1。

圖1 多肽液的親和層析分離Fig.1 Chromatography spectra of peptides

2.2 親和肽的高效液相分離純化

親和肽的高效液相分離純化如圖2所示。

親和層析分離第二組分的高效液相色譜圖譜中僅有唯一單峰，出峰時間在50 s左右，說明殼聚糖-Zn親和層析介質(zhì)對Zn2+親和肽具有較好的分離純化效果，所得親和肽的純度較高。

2.3 肽-鋅配合物的鋅含量

采用ICP-MS測定肽-鋅配合物的鋅含量，測定結果如表1所示。

圖2 層析第二組分的高效液相色譜圖譜Fig.2 Chromatogram of TP2

表1 各組分多肽與Zn2+配合形成肽-鋅配合物的鋅含量Table 1 Zn content in different zinc-peptide complex

由多肽原液制備的肽-鋅配合物鋅含量為8.533%，親和層析第一組分為1.700%，第二組分為16.87%?？梢?，親和層析所得第一組分多肽與鋅離子的配位作用較弱，形成的配合物不多。第二組分形成的配合物鋅含量明顯高于多肽原液和第一組分，說明該組分多肽與鋅離子的配位作用較強，是制備肽－Zn配合物的目標親和肽。

2.4 肽－鋅配合作用動力學分析

以多肽濃度與鋅離子濃度比值為橫坐標，吸光度（A值）為縱坐標，繪制A－C多肽/CZn2+曲線圖，如圖3所示。

圖3 A-C多肽/CZn2+曲線圖Fig.3 The plot of A-C多肽/CZn2+

圖3發(fā)現(xiàn)，曲線在C多肽/CZn2+=2.5時出現(xiàn)明顯的轉折，據(jù)此判斷鋅離子與多肽進行配位作用的配位比為2.5∶1。

設配位作用的反應方程式為：mPep+nZn2+=PepmZnn，即m=1，n=2.5。

由圖3可知，A1=0.761，A0=0.802，c=0.1 mol/L。

則解離度 α=（A0－A1）/A0=（0.802－0.761）/0.802= 0.051 12。

解離常數(shù)K′=（[M]m[N]n）/[MmNn]=（mmnnαm+ncm+n－1）/（1－α）=（1×2.52.5×（0.051 12）1+2.5×（0.1）1+2.5－1）/（1－0.005 112）= 9.947×10－7。

則穩(wěn)定常數(shù)K=1/K′=1/9.947×10－7=1.005×106。

結果表明，肽與Zn2+通過配位作用形成的肽－鋅配合物性質(zhì)比較穩(wěn)定。

2.5 肽－鋅配合物的紫外－可見光譜分析

多肽及肽－鋅配合物的紫外吸收光譜圖如圖4所示。

圖4 多肽及其配合物的紫外吸收光譜Fig.4 UV spectra of peptide and zinc-binding peptide

多肽的吸收曲線最大吸收峰位于192 nm；肽－鋅配合物的吸收曲線最大吸收峰位于197 nm，向長波方向移動了5 nm，且肽－鋅配合物對應的吸收峰強度比多肽對應的吸收峰強度明顯增強。這是由于多肽分子中的－COOH、－NH2、－OH等基團與鋅離子發(fā)生配位作用，引起紫外吸收光譜的位移[9]。

2.6 肽－鋅配合物的紅外光譜分析

多肽、肽－鋅配合物的紅外光譜圖如圖5所示。

多肽與鋅離子配位作用前后的紅外圖譜發(fā)生了明顯變化。多肽在3 305.80 cm－1處吸收峰，與鋅離子配位后移至3 284.58 cm－1；在3 080.24 cm－1處吸收峰，與鋅離子配位后吸收峰消失，該吸收峰是由N－H伸縮振動引起。多肽在1 656.76 cm－1與1 398.13 cm－1處由COO－伸縮振動引起的吸收峰，與鋅離子配位后分別移至1 591.18 cm－1與1 402.17 cm－1；在1 550.25 cm－1與1 448.15 cm－1處由NH2伸縮振動引起的吸收峰，與鋅離子配位后消失。在1 045.00 cm－1～1 340.00 cm－1范圍，多肽與肽－鋅配合物的譜圖中多處吸收峰發(fā)生變化；多肽－鋅配合物分別在676.97 cm－1與619.11 cm－1處出現(xiàn)強的Zn-O伸縮振動吸收峰，這是由羧基與鋅離子的配位作用形成的[10-12]。

圖5 多肽與肽-鋅配合物的紅外光譜Fig.5 FT-IR spectra of peptide and zinc-binding peptide

2.7 肽-鋅配合物的掃描電鏡分析

多肽與肽-鋅配合物的掃描電子顯微鏡照片如圖6所示。

多肽與肽-鋅配合物的電鏡圖有較大差異。肽-鋅配合物呈現(xiàn)分布均勻的顆粒狀，可能是由于多肽與鋅離子配位后形成穩(wěn)定的多環(huán)配位化合物，體現(xiàn)出類似球體的顆粒狀。

3 結論

采用自制的殼聚糖-Zn親和層析介質(zhì)對羅非魚蛋白多肽進行分離純化，篩選出了與Zn2+有較強配位作用的親和肽，分離純化的適宜工藝條件為：上樣緩沖液為乙酸-乙酸鈉，pH為4.0；多肽原液上樣濃度為20%；洗脫緩沖液為0.2 mol/L EDTA；通過高效液相色譜檢測分析顯示，目標多肽組分的分離純化效果良好。通過ICP-MS測定多肽原液、TP1組分、TP2組分與鋅配位反應后配合物中鋅的含量，結果是第二組分多肽與鋅通過配合作用形成配合物的鋅含量最高，為16.87%，多肽與鋅配位反應的穩(wěn)定常數(shù)為1.005×106；通過對多肽及肽-鋅配合物的紫外光譜、紅外光譜、掃描電子顯微鏡等表征分析，證實鋅離子與多肽發(fā)生了配位作用并生成肽-鋅配合物。

[1] 韓櫻,何慧,程海霞,等.蛋清肽-Zn(II)配合物的制備[J].食品工業(yè)科技,2011,32(9):357-360

[2] 陳忠海.小兒鋅缺癥的診斷與治療[J].秦山衛(wèi)生,2004,28(3):15-16

[3] 曾慶祝,陳陸欣.多肽-鋅配合物的生物功能活性及安全性[J].現(xiàn)代食品科技,2013,29(8):2035-2039

[4] Chaga G S.Twenty-five years of immobilized metal ion affinitychromatography:past,present and future[J].J Biochem Bioph Methods,2001,49:313-334

[5]譚天偉,桑晉.殼聚糖涂層親和層析在超氧化物歧化酶純化中的應用[J].高校化學工程學報,1998,2(12):189-192

[6] Larry R,Cathy S.Autometed signature peptide approach for proteomics[J].Chromatography A,2001,924:359-368

[7]張錦捷,曾慶祝.瓊脂糖-Zn(II)親和層析分離純化羅非魚水解多肽初探[J].食品研究與開發(fā),2016,37(1):13-17

[8] 魯偉,任國譜,宋俊梅.蛋白水解液中多肽含量的測定方法[J].食品科學,2005,26(7):169-171

[9] 邢穎.氨基酸金屬離子螯合物合成條件及測定方法的研究[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學,2011

[10]許慶陵,曾慶祝,閆磊,等.羅非魚多肽‐鋅配合物的制備及其生物活性[J].食品科學,2010,31(10):75-80

[11]Miguel M,Tamis D.Zinc mediated methyl transfer from trimethyl phosphate to chelating and non-chelating alkyl tiols.Model for Zndependent methytransferases[J].Inorganin Biochemistry,2003,94: 193-196

[12]楊未.氨基酸過渡金屬配合物的紅外與拉曼光譜研究[D].杭州:浙江工業(yè)大學,2008

Purification and Complexation Reaction of Hydrolysis Peptide with Binding Zinc（II）

ZHANG Jin-jie，YUAN Yang，ZENG Qing-zhu*
（College of Chemical Engineering，Guangzhou University，Guangzhou 510006，Guangdong，China）

Tilapia protein hydrolysate peptide was separated and purified by using zinc chelating polysaccharide affinity chromatography media.And the complexation reaction of peptide with zinc was investigated.The structure characteristic of peptide-zinc complexes was characterized by HPLC，ICP-MS，UV-vis spectroscopy，F(xiàn)T-IR spectroscopy and SEM.The results showed that the tilapia hydrolysis polypeptide had been effectively purified and proved that chelating reaction between peptide and Zn2+had occurred and zinc-binding peptide complexes had been produced.The total zinc content of zinc-binding peptide complexes produced by hydrolysis polypeptide，TP1and TP2were 8.533%，1.700%and 16.87%，respectively.The properties of zinc-peptide complexes was stable whose stability constant was 1.005×106.

IMAC（immobilized metal-chelate affinity chromatography）；polypeptide；zinc-ion；zinc-peptide complexation；chelation reaction

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.010

2016-07-25

廣東省科技計劃項目（2015A020209192，2014A010107029）；廣州市科技計劃項目（201604020089）；廣州市黃埔區(qū)科技計劃項目（201516/20150000644）

張錦捷（1989—），男（漢），碩士，研究方向：食品加工副產(chǎn)物的高值化利用。

*通信作者：曾慶祝（1965—），男，教授，博士，研究方向：生物活性肽及其功能性。