康超，伍淑婕，李燕，2，段振華，潘中田，帥良，陳振林，羅楊合，*

（1.賀州學(xué)院食品科學(xué)與工程技術(shù)研究院，廣西賀州542899；2.大連工業(yè)大學(xué)，遼寧大連116034）

響應(yīng)面法優(yōu)化馬蹄發(fā)酵果醋工藝研究

康超1，伍淑婕1，李燕1，2，段振華1，潘中田1，帥良1，陳振林1，羅楊合1，*

（1.賀州學(xué)院食品科學(xué)與工程技術(shù)研究院，廣西賀州542899；2.大連工業(yè)大學(xué)，遼寧大連116034）

以馬蹄為原料，通過(guò)響應(yīng)面法分析探索液態(tài)發(fā)酵馬蹄果酒、果醋的生產(chǎn)工藝條件。結(jié)果表明，馬蹄酒精發(fā)酵的工藝參數(shù)為pH 4.5，溫度30℃，時(shí)間7 d，接種量3%，馬蹄酒精發(fā)酵酒精度達(dá)14.5%；醋酸發(fā)酵最佳工藝條件為初始酒精濃度9.9%，轉(zhuǎn)速143 r/min，發(fā)酵溫度31.8℃，在此條件下，果醋的酸度為5.638 g/100 mL。

馬蹄；果醋；發(fā)酵條件；響應(yīng)面法

馬蹄（Chinese water chestnut），學(xué)名荸薺（Eleochaurus toberosa），為莎草科荸薺屬的地下球莖[1]，果實(shí)中富含碳水化合物、多糖、各種維生素、胡蘿卜素、脂肪、蛋白質(zhì)、微量元素、黃酮類及多酚類等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[2-4]。研究表明，馬蹄具有調(diào)節(jié)血脂、調(diào)節(jié)免疫、抗菌抗氧化等多種生理功能，具有很好的藥用價(jià)值，是優(yōu)良的保健食品[2，5-6]。

我國(guó)的馬蹄產(chǎn)量占全球95%以上，廣西賀州、桂林兩市馬蹄種植面積超過(guò)40萬(wàn)畝，產(chǎn)量超過(guò)80萬(wàn)t，占我國(guó)馬蹄產(chǎn)量70%以上。尤其是賀州，享有“世界馬蹄看中國(guó)，中國(guó)馬蹄看賀州”的美譽(yù)[7-8]。目前，馬蹄深加工產(chǎn)品很少，主要是清水馬蹄罐頭、馬蹄果脯及飲料等[7，9]。每年12月到來(lái)年2月是馬蹄收獲期，馬蹄市場(chǎng)價(jià)為每斤1.5元～2.0元。第二年7月～8月，馬蹄市場(chǎng)價(jià)為每斤4.0元～6.0元。這是由于馬蹄不易貯藏、供應(yīng)量變少等原因?qū)е碌摹?/p>

隨著人們生活水平的提高，馬蹄產(chǎn)品的種類和品質(zhì)已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足市場(chǎng)消費(fèi)需求，市場(chǎng)需求越來(lái)越多高品質(zhì)的馬蹄新產(chǎn)品。近年來(lái)，各種果醋飲品的研究受到越來(lái)越多的重視，山楂醋[10-11]，蘋果醋[12-14]、木瓜醋[15]、柿子醋[16]、桑果醋[17]、山藥醋[18]等各種果醋飲品不斷投入研發(fā)并投放市場(chǎng)。目前對(duì)馬蹄醋的研究較少[19-21]，市場(chǎng)上幾乎沒(méi)有馬蹄果醋品種，因此深加工發(fā)酵制備富含果醋和馬蹄藥用保健功能的馬蹄果醋產(chǎn)品，具有巨大的開發(fā)應(yīng)用前景。本研究以馬蹄為原料，響應(yīng)面法優(yōu)化馬蹄果醋的發(fā)酵工藝，旨在為我省市馬蹄資源的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮馬蹄、白砂糖：市售。

氫氧化鈉、檸檬酸等：分析純；糖化酶、淀粉酶、果膠酶：諾維信生物技術(shù)有限公司（100 000 U/g）；安琪活性干酵母：湖北安琪酵母股份有限公司；醋酸菌：北京微生物研究所（菌號(hào)AS1.41）。

1.2 儀器與設(shè)備

JYZ－A530榨汁機(jī)：九陽(yáng)股份有限公司；ZQZY－VC恒溫震蕩搖床：上海知楚分析儀器制造有限公司；BSA124S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SHZ－82A數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇金怡有限責(zé)任公司；PAL－1糖度計(jì)：日本ATAGO（愛(ài)拓）科學(xué)儀器有限公司；DA－130酒精計(jì)：日本京都電子公司；pHS－4C酸度計(jì)：成都世紀(jì)方舟科技有限公司。

1.3 工藝流程

1.3.1 馬蹄水解液制備流程

1.3.2 馬蹄果醋發(fā)酵工藝流程

1.4 試驗(yàn)內(nèi)容

酒精發(fā)酵條件優(yōu)化：以酶解后獲得的馬蹄汁為原料接入酵母種子液進(jìn)行酒精發(fā)酵，分別對(duì)接種量、初始pH值、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時(shí)間進(jìn)行正交試驗(yàn)，研究其對(duì)馬蹄酒精發(fā)酵階段的影響。

醋酸發(fā)酵條件優(yōu)化：以獲得的馬蹄果酒為原料，對(duì)pH值、糖度、酸度等進(jìn)行調(diào)整后，接種醋酸菌進(jìn)行醋酸發(fā)酵，分別以初始酒精濃度、轉(zhuǎn)速及發(fā)酵溫度為影響因素考察其對(duì)酸度的影響。根據(jù)Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

1.5 測(cè)定方法

酒精度測(cè)定：蒸餾法酒精計(jì)測(cè)定；糖度測(cè)定：糖度計(jì)；總酸度測(cè)定：酸堿中和滴定法；pH值測(cè)定：精密pH計(jì)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels in the response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 馬蹄酒精發(fā)酵工藝確定

為確定較好的馬蹄果酒酒精發(fā)酵工藝條件，在前期單因素條件基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，以接種量（A）、初始pH值（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、發(fā)酵溫度（D）為考察因素，以酒精度為考察指標(biāo)，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 馬蹄酒精發(fā)酵條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for alcoholic fermentation conditions optimization

由表2可知，試驗(yàn)確定馬蹄酒精發(fā)酵條件優(yōu)化時(shí)，pH值及溫度比對(duì)馬蹄酒精發(fā)酵有較大影響，各因素對(duì)發(fā)酵酒精度的影響大小順序依次為：pH值＞溫度＞時(shí)間＞接種量，由正交試驗(yàn)得知，馬蹄酒精發(fā)酵最佳組合為A2B2C3D2，即接種量3%，pH 4.5，時(shí)間7 d，溫度30℃；由于最佳組合沒(méi)有在正交表的組合中，所以需要做驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明當(dāng)組合為A2B2C3D2時(shí)，馬蹄酒精發(fā)酵酒精度達(dá)14.5%。因此，選擇發(fā)酵7 d的馬蹄果酒進(jìn)行過(guò)濾及調(diào)整成分后，接種醋酸菌種子液進(jìn)行醋酸發(fā)酵。

2.2 馬蹄醋酸發(fā)酵工藝確定

2.2.1 發(fā)酵初始酒精濃度對(duì)馬蹄醋酸發(fā)酵的影響

將酒精發(fā)酵濃度調(diào)整為6%、8%、10%、12%，在醋酸菌接種量為10%（搖床轉(zhuǎn)速150 r/min，溫度30℃）的條件下，考察不同酒精起始濃度對(duì)醋酸發(fā)酵酸度的影響，見(jiàn)圖1。

圖1 酒精濃度對(duì)醋酸發(fā)酵的影響Fig.1 Effects of alcohol content on acetic fermentation

由圖1可知，酒精濃度越低，醋酸發(fā)酵產(chǎn)酸能力越小，但當(dāng)酒精濃度達(dá)到12%，可能由于其濃度過(guò)高，從而抑制醋酸菌的產(chǎn)酸能力，醋酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸情況沒(méi)有酒精初始濃度為10%的產(chǎn)酸能力強(qiáng)；同時(shí)，研究表明隨著醋酸發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，醋酸發(fā)酵速率上升緩慢，當(dāng)酒精初始濃度為10%，醋酸菌發(fā)酵7 d，酸度達(dá)到5.5 g/100 mL，繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵，產(chǎn)酸能力并沒(méi)有得到很大改變。

2.2.2 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)馬蹄醋酸發(fā)酵的影響

由于醋酸菌是好氧微生物，當(dāng)氧氣充足時(shí)，才能進(jìn)行旺盛的生理活動(dòng)，缺氧時(shí)會(huì)抑制醋酸細(xì)菌的生長(zhǎng)，因此，將酒精發(fā)酵濃度調(diào)整為10%，在醋酸菌接種量為10%，發(fā)酵溫度30℃的條件下，考察不同搖床轉(zhuǎn)速（120、150、180、210 r/min）對(duì)醋酸發(fā)酵酸度的影響，見(jiàn)圖2。

圖2 轉(zhuǎn)速對(duì)醋酸發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of rotation rate on acetic fermentation

由圖2可知，轉(zhuǎn)速越高，醋酸發(fā)酵產(chǎn)酸能力相對(duì)會(huì)越強(qiáng)，但考慮到生產(chǎn)實(shí)際情況，本研究選取120 r/min～150 r/min做后續(xù)正交試驗(yàn)研究。

2.2.3 發(fā)酵溫度對(duì)馬蹄醋酸發(fā)酵的影響

醋酸菌的最適生長(zhǎng)溫度為30℃～35℃，溫度太高或者太低，均不利于醋酸菌的繁殖生長(zhǎng)。因此，將酒精發(fā)酵濃度調(diào)整為10%，在醋酸菌接種量為10%，發(fā)酵溫度30℃、轉(zhuǎn)速150r/min的條件下，考察不同溫度（30、32、34℃）對(duì)醋酸發(fā)酵酸度的影響，見(jiàn)圖3。

圖3 溫度對(duì)醋酸發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of temperature on acetic fermentation

由圖3可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，在不同溫度條件下，發(fā)酵酸度逐漸增加，發(fā)酵1 d～3 d，產(chǎn)酸變化幅度不大，隨后出現(xiàn)差異，30℃條件下，發(fā)酵產(chǎn)酸情況較好。

2.2.4 醋酸發(fā)酵條件響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化

2.2.4.1 響應(yīng)面優(yōu)化模型建立分析

應(yīng)用Box-behnken對(duì)馬蹄果醋發(fā)酵條件進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，用Design-expert V8.0.6軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果（表3）進(jìn)行回歸分析，以馬蹄果醋發(fā)酵獲得的醋酸產(chǎn)量（酸度）為Y值（響應(yīng)值），獲得總酸對(duì)初始酒精濃度、轉(zhuǎn)速和發(fā)酵溫度3個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸模型：

總酸（g/100 mL）=5.58+0.025A-0.10B+0.18C+ 0.30AB-0.10AC+0.05BC-0.17A2-0.42B2-0.52C2。對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

續(xù)表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Continue table 3 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

表4 響應(yīng)面二次回歸方程模型方差分析結(jié)果Table 4 ANOVA results of quadratic regression model for response surface

由表4可知，該模型具有顯著性（P＜0.05），模型失擬項(xiàng)0.066 7（＞0.05）不顯著，模型的調(diào)整確定系數(shù)（R2adj）為0.970 5，可解釋97.05%響應(yīng)值的變化，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.987 3，與R2adj較接近，表明此模型擬合程度好，誤差不大，故可用此模型對(duì)馬蹄果醋發(fā)酵工藝條件結(jié)果進(jìn)行分析與預(yù)測(cè)。在總的作用因素中，A，BC均不顯著，AC差異顯著，B，C，AB，A2，B2，C2均極顯著。

2.2.4.2 響應(yīng)面結(jié)果分析與優(yōu)化

根據(jù)回歸方程做響應(yīng)面圖及其等高線圖，考察所擬合的響應(yīng)面的形狀，分析初始酒精濃度、轉(zhuǎn)速及發(fā)酵溫度對(duì)酸度的影響，相應(yīng)的響應(yīng)面見(jiàn)圖4～圖6。

圖4 酒精濃度與轉(zhuǎn)速交互影響醋酸的響應(yīng)面圖（a）及等高圖（b）Fig.4 Response surface and contour of effects of initial alcohol content and rotation rate amount on acid content

圖5 酒精濃度與發(fā)酵溫度交互影響醋酸的響應(yīng)面圖（a）及等高圖（b）Fig.5 Response surface and contour of effects of initial alcohol content and temperature amount on acid content

圖6 轉(zhuǎn)速與發(fā)酵溫度交互影響醋酸的響應(yīng)面圖（a）及等高圖（b）Fig.6 Response surface and contour of effects of rotation rate and temperature amount on acid content

由圖可知，該結(jié)果與之前的單因素試驗(yàn)結(jié)果一致，并且單因素值增加，響應(yīng)值隨之增加，但是當(dāng)響應(yīng)值達(dá)到某一程度后，會(huì)出現(xiàn)下降趨勢(shì)。綜合表2～表3與圖4～圖6，并進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸模型線性擬合后可知，馬蹄果醋發(fā)酵工藝的最佳條件是：初始酒精濃度9.89%，轉(zhuǎn)速142.74 r/min，發(fā)酵溫度31.76℃，在此工藝條件下，馬蹄果醋發(fā)酵產(chǎn)酸的理論值為5.645 g/ 100 mL。為驗(yàn)證響應(yīng)面試驗(yàn)法獲得結(jié)果的可信度，根據(jù)工藝（初始酒精濃度9.9%，轉(zhuǎn)速143 r/min，發(fā)酵溫度31.8℃）進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)3次，平均酸度為5.638 g/ 100 mL，所得試驗(yàn)值與理論值相對(duì)誤差小，說(shuō)明經(jīng)響應(yīng)面分析方法優(yōu)化獲得的工藝參數(shù)是可信的，具有較好的實(shí)用價(jià)值。

3 結(jié)論與討論

本研究確定馬蹄果酒酒精發(fā)酵工藝條件，在單因素條件基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，以接種量、初始pH值、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度為考察因素，結(jié)果顯示各因素對(duì)發(fā)酵酒精度的影響依次為pH值＞溫度＞時(shí)間＞接種量，最佳酒精發(fā)酵工藝條件為pH 4.5，溫度30℃，時(shí)間7 d，接種量3%，馬蹄酒精發(fā)酵酒精度達(dá)14.5%。

本研究通過(guò)單因素試驗(yàn)和Box－Behnken設(shè)計(jì)試驗(yàn)，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化馬蹄果醋的醋酸發(fā)酵工藝條件，得出最佳的發(fā)酵工藝參數(shù)：初始酒精濃度9.9%，轉(zhuǎn)速143 r/min，發(fā)酵溫度31.8℃，在此條件下，果醋的酸度為5.638 g/100 mL。本研究建立的二次線性回歸模型準(zhǔn)確有效，優(yōu)化馬蹄果醋發(fā)酵工藝參數(shù)是可行的，并且試驗(yàn)擬合較好，有一定的實(shí)用價(jià)值，可為特色營(yíng)養(yǎng)發(fā)酵馬蹄果汁果醋的進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

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Optimization of Fermentation Conditions for Chinese Water Chestnut Vinegar by Response Surface Methodology

KANG Chao1，WU Shu-jie1，LI Yan1，2，DUAN Zhen-hua1，PAN Zhong-tian1，SHUAI Liang1，CHEN Zhen-lin1，LUO Yang-he1，*
（1.Research Institute of Food Science&Engineering Technology，Hezhou University，Hezhou 542899，Guangxi，China；2.Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，Liaoning，China）

Chinese water chestnut was utilized as raw material to brew fruit vinegar via submerged fermentation. Response surface methodology（RSM）was applied to optimize the fermentation condition.The optimal alcohol fermentation conditions were as follows：pH 4.5，temperature 30℃，time 7 day，yeast inoculum 3%and alcohol content 14.5%.Based on single experiment，the initial alcohol content，rational speed，fermentation temperature were chosen as influencing factors，and the acidity was selected as response value.The optimal fermentation condition were determined as follows：initial alcohol content 9.9%，rational speed 143 r/min，fermentation temperature 31.8℃.Under such optimal conditions，the acidity was 5.638 g/100 mL.

Chinese water chestnut；fruit vinegar；fermentation conditions；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.015

2016－08－16

國(guó)家自然科學(xué)基金（21365011）；廣西自然科學(xué)基金（2013GXNSFAA019046）；賀州學(xué)院博士啟動(dòng)基金（HZUBS201515）；賀州市科學(xué)研究與技術(shù)開發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（賀科攻1541004）

康超（1985—），女（漢），講師，博士，研究方向：食品工程和天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。

*通信作者：羅楊合（1969—），男，教授，博士，研究方向：天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。