楊俊峰

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014109）

大菱鲆魚皮多肽液的制備及其抗運動疲勞作用

楊俊峰

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭014109）

利用熱水水解法制備大菱鲆魚皮膠原蛋白。以制備的膠原蛋白為原料，利用復(fù)合蛋白酶酶解法制備大菱鲆魚皮多肽液，并利用單因素和正交試驗對復(fù)合蛋白酶酶解大菱鲆魚皮膠原蛋白的工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對得到的大菱鲆魚皮多肽液的抗運動疲勞作用進(jìn)行研究。結(jié)果表明，復(fù)合蛋白酶酶解法制備大菱鲆魚皮多肽液的最佳酶解工藝為：溫度50℃，pH 6.5，酶用量0.08%，酶解時間8 h。在此工藝條件下大菱鲆魚皮膠原蛋白的水解度為68.35%。小鼠負(fù)重游泳實驗和抗疲勞生化指標(biāo)結(jié)果表明大菱鲆魚皮多肽液具有良好的抗運動疲勞能力。

大菱鲆；魚皮；多肽液；正交試驗；抗運動疲勞

我國水產(chǎn)加工業(yè)發(fā)展迅速，大量的水產(chǎn)品通過深加工顯著提升了其原有價值，其中有關(guān)魚皮的深加工和營養(yǎng)價值的研究深受廣大研究者的關(guān)注[1-3]。如羅非魚魚皮通過酶解法可得到具有良好抗氧化能力的膠原肽[4]。張振新等[5]利用響應(yīng)面法優(yōu)化了酶解廢棄魚皮的工藝，為廢棄魚皮的生產(chǎn)再利用提供了理論依據(jù)。劉成梅等[6]則利用超濾技術(shù)制備了羅非魚魚皮多肽，并對羅非魚魚皮多肽的抗氧化活性進(jìn)行了深入研究。大菱鲆俗稱歐洲比目魚，在中國被稱為“多寶魚”，肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，深受我國消費者喜愛，在20世紀(jì)90年代末，大菱鲆在我國北方沿海推廣養(yǎng)殖，成為我國北方主要的海產(chǎn)品之一[7-8]。隨著大菱鲆產(chǎn)量的增加和加工業(yè)的興起，大菱鲆魚皮的進(jìn)一步加工利用將會成為提高大菱鲆經(jīng)濟(jì)效益的重要措施，然而目前此方面的研究并不多見。本研究以大菱鲆魚皮為研究對象，利用復(fù)合酶解法，對大菱鲆魚皮膠原蛋白進(jìn)行酶解，并利用正交試驗對酶解工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上對酶解得到的大菱鲆魚皮多肽液進(jìn)行抗運動疲勞的研究，以期為抗運動疲勞魚皮多肽的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 樣品來源

大菱鲆魚：大小均一，尾重（800±20）g，鮮活即殺，剝皮，并將剝好的魚皮在-18℃下冷藏備用。

1.2 材料與試劑

小鼠：32只雄性小鼠，年齡均為8周，體重為（220± 14）g。

復(fù)合蛋白酶（120個單位/mg）：赫澎（上海）生物科技有限公司；茚三酮顯色液：上海拓旸生物科技有限公司；氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：上海芃碩生物科技有限公司；尿素氮（BUN）檢測試劑盒、乳酸測定試劑盒和糖原測試盒：上海江萊生物科技有限公司。

1.3 儀器與設(shè)備

FA系列電子分析天平：上海光學(xué)儀器廠；Sykam（賽卡姆）氨基酸分析儀：德國曼默博爾公司；ATN-500全自動凱氏定氮儀：上海平軒科學(xué)儀器有限公司；小鼠恒溫游泳箱：安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司。

2 方法

2.1 大菱鲆魚皮膠原蛋白的制備

將冷凍的大菱鲆魚皮室溫解凍，清洗表面，按照林家福等[9]的研究利用熱水水解法提取大菱鲆魚皮膠原蛋白，熱水提取法工藝條件為：溫度90℃，pH6.0，固液比1∶13（g/mL），時間2 h，最后利用凱氏定氮法測定大菱鲆魚皮蛋白得率為276 mg/g魚皮，且得到的大菱鲆魚皮膠原蛋白無異味。

2.2 大菱鲆魚皮膠原蛋白水解度的測定

大菱鲆魚皮膠原蛋白水解度利用直接測定法進(jìn)行測定[10]。利用國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.5-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》中的方法測定大菱鲆魚皮膠原蛋白提取物中N的含量，利用茚三酮顯色法測定多肽液中游離-NH2的含量。計算公示為：

式中：Nh為大菱鲆魚皮膠原蛋白酶解液中的總游離-NH2數(shù)，mmol；N0為大菱鲆魚皮膠原蛋白中固有的游離-NH2數(shù)，mmol；N總為大菱鲆魚皮膠原蛋白強(qiáng)酸水解后的總游離-NH2數(shù)，mmol。

2.3 單因素試驗

利用單因素試驗分別研究溫度（40、45、50、55、60℃）、pH（5.5、6.0、6.5、7.0、7.5）、酶用量（0.02%、0.04%、0.06%、0.08%、0.10%）和酶解時間（2、4、6、8、10 h）對酶解法制備大菱鲆魚皮多肽液的影響。

2.4 正交試驗設(shè)計

為了進(jìn)一步優(yōu)化復(fù)合酶解法制備大菱鲆魚皮多肽液的工藝，在單因素試驗的基礎(chǔ)上設(shè)計正交試驗。選用溫度、pH值、酶用量和酶解時間4個因素進(jìn)行優(yōu)化組合，因素與水平表見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

2.5 大菱鲆魚皮多肽液抗運動疲勞作用分析

2.5.1 動物分組及給藥

將32只雄性小鼠隨機(jī)分為4組，A組為空白對照組，灌胃2.0 mL/d的生理鹽水，B、C和D組分別灌胃5、20、35 mL/（kg·d）的大菱鲆魚皮多肽液，并定義為低、中和高劑量組。灌胃量的確定參考蘇永昌等的研究[11]。灌胃上述4組小鼠均灌胃30 d，期間小鼠自由飲水和進(jìn)食。

2.5.2 大菱鲆魚皮多肽液對小鼠負(fù)重游泳力竭時間的影響

小鼠末次灌胃30 min后，以負(fù)重量為小鼠體重的5%，對4組小鼠進(jìn)行負(fù)重游泳試驗。具體方法為將4組試驗小鼠置于水溫為25℃，水深為30 cm的游泳箱進(jìn)行負(fù)重游泳試驗，并記錄4組小鼠首次下沉?xí)r間和力竭時間[12]。

2.5.3 大菱鲆魚皮多肽液對小鼠抗疲勞生化指標(biāo)的影響

小鼠負(fù)重游泳試驗結(jié)束后休息1 d，隨后進(jìn)行無負(fù)重游泳30 min，采用試劑盒法對4組小鼠進(jìn)行血清尿素氮（BUN）、血清乳酸（LD）和肝糖原（LG）測定。

2.6 數(shù)據(jù)分析

試驗結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，并利用SPSS 20.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，當(dāng)P＜0.05時定義差異顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素試驗

3.1.1 溫度對大菱鲆魚皮膠原蛋白水解度的影響

在溫度為40、45、50、55、60℃下分析溫度對大菱鲆魚皮膠原蛋白水解度的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 溫度對大菱鲆魚皮膠原蛋白水解度的影響Fig.1 Effect of the temperature on the DH of collagen of SMF

當(dāng)溫度為50℃時，大菱鲆魚皮膠原蛋白水解度最高。

3.1.2 pH值對大菱鲆魚皮膠原蛋白水解度的影響

在pH值為5.5、6.0、6.5、7.0和7.5下分析pH值對大菱鲆魚皮膠原蛋白水解度的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 溫度對大菱鲆魚皮膠原蛋白水解度的影響Fig.2 Effect of the pH on the DH of collagen of SMF

當(dāng)pH值為6.5時，大菱鲆魚皮膠原蛋白水解度最高。

3.1.3 酶用量對大菱鲆魚皮膠原蛋白水解度的影響

在酶用量為0.02%、0.04%、0.06%、0.08%和 0.10%下分析酶用量對大菱鲆魚皮膠原蛋白水解度的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 酶用量對大菱鲆魚皮膠原蛋白水解度的影響Fig.3 Effect of the enzyme dosage on the DH of collagen of SMF

隨著酶用量的增加，大菱鲆魚皮膠原蛋白的水解度也隨之增加，但是當(dāng)酶用量大于0.08%時，水解度的增加幅度減少，考慮到生產(chǎn)成本的問題，可以選擇最優(yōu)酶用量為0.08%。

3.1.4 酶解時間對大菱鲆魚皮膠原蛋白水解度的影響在酶解時間為2、4、6、8、10 h下分析酶時間對大菱鲆魚皮膠原蛋白水解度的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 酶解時間對大菱鲆魚皮膠原蛋白水解度的影響Fig.4 Effect of dissociation time on the DH of collagen of SMF

隨著酶解時間的增加，大菱鲆魚皮膠原蛋白的水解度也隨之增加，但是當(dāng)酶解時間大于8 h之后，水解度幾乎不會發(fā)生改變，因此，最優(yōu)酶解時間為8 h。

3.2 正交試驗

為了得到酶解大菱鲆魚皮膠原蛋白的最佳參數(shù)組合，在單因素試驗的基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗，并進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表2、表3所示。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

續(xù)表2 正交試驗結(jié)果Continue table 2 Results of orthogonal experiment

表3 方差分析Table 3 Variance analysis

由表2可知，4個因素對大菱鲆魚皮膠原蛋白水解度的影響順序為：溫度（A）＞pH值（B）＞酶解時間（D）＞酶用量（C），且最佳因素水平組合為A2B2C2D2，即溫度50℃，pH 6.5，酶用量0.08%，酶解時間8 h。由表3方差分析可知，4個因素都對大菱鲆魚皮膠原蛋白水解度有極顯著的影響（P＜0.01）。根據(jù)最佳參數(shù)進(jìn)行3次平行試驗，大菱鲆魚皮膠原蛋白水解度分別為68.93%、67.79%、68.33%，3次試驗的平均值為68.35%，其結(jié)果高于正交試驗各組的水解度。

3.3 大菱鲆魚皮多肽液抗運動疲勞作用研究

3.3.1 大菱鲆魚皮多肽液對小鼠負(fù)重游泳力竭時間的影響

記錄4組小鼠游泳首次下沉和游泳力竭時間，結(jié)果如圖5所示，與對照組相比（A），灌胃低（B）、中（C）和高（D）劑量大菱鲆魚皮多肽液的3組小鼠的游泳首次下沉?xí)r間和力竭時間得到了顯著的延長（P＜0.05），并隨著灌胃劑量的增加而增加，這說明大菱鲆魚皮多肽液具有良好的抗運動疲勞作用。

圖1 大菱鲆魚皮多肽液對小鼠游泳耐力的影響Fig.1 Effects of PISMF on swimming endurance of mices

3.3.2 大菱鲆魚皮多肽液對小鼠抗疲勞生化指標(biāo)的影響

為了進(jìn)一步研究大菱鲆魚皮多肽液對小鼠的抗運動疲勞作用，利用試劑盒法測定4組小鼠血清尿素氮、血乳酸和肝糖原含量，結(jié)果如表4所示。

表4 大菱鲆魚皮多肽液對運動后小鼠血清尿素氮、血乳酸和肝糖原含量的影響Table 4 Effects of PISMF on serum urea nitrogen，blood lactic acid and the content of hepatic glycogen of mices after exercising

與空白對照組相比，低、中和高劑量組的小鼠血清尿素氮和血乳酸的含量都顯著的降低（P＜0.05），而肝糖原含量顯著增加（P＜0.05）。運動時間過長機(jī)體會產(chǎn)生大量的血尿素氮，如果是激烈的無氧運動，血液中則會產(chǎn)生大量的乳酸，使人體產(chǎn)生疲勞感；而肝糖原是機(jī)體運動的主要能量來源，一定含量的肝糖原能夠減輕運動疲勞感[12－13]?？梢?，大菱鲆魚皮多肽液是通過減少機(jī)體血清中尿素氮和血乳酸的含量，并通過增加肝糖原含量來達(dá)到抗疲勞的作用。

4 結(jié)論

本研究優(yōu)化了復(fù)合酶法制備大菱鲆魚皮多肽液的工藝參數(shù)，結(jié)果表明，大菱鲆魚皮膠原蛋白水解度的影響順序為：溫度＞pH值＞酶解時間＞酶用量，復(fù)合蛋白酶酶解法制備大菱鲆魚皮多肽液的最佳酶解工藝為：溫度50℃，pH 6.5，酶用量0.08%，酶解時間8 h。此條件下大菱鲆魚皮膠原蛋白的水解度為68.35%。此外，通過小鼠負(fù)重游泳試驗表明大菱鲆魚皮多肽液具有抗運動疲勞能力，且是通過減少血清中尿素氮和血乳酸，和增加肝糖原含量。

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Preparation and Anti-exercise-fatigue Activity of Peptide Liquid from Scophthalmus maximus Fishskin

YANG Jun-feng
（Vocational and Technical College of Inner Mongolia Agricultural University，Baotou 014109，Inner Mongolia，China）

The collagen of Scophthalmus maximus fishskin（SMF）was prepared using the hot water extraction，and was used as the raw material for further study.The peptide liquid of Scophthalmus maximus fishskin（PISMF）was prepared using the compound proteinase enzyme hydrolysis method，which was optimized using the single factor experiment and orthogonal experiment.In addition，the anti-exercise-fatigue activity of PISMF was analyzed.The results showed that the optimum enzyme hydrolysis condition of collagen of SMF using compound proteinase enzyme hydrolysis method was：temperature 50℃，pH 6.5，enzyme dosage 0.08%，dissociationtime 8h.Under the optimum conditions，the enzymatic hydrolysis degree ofcollagenofSMF was 68.35%.The results of the weight-loaded swimming test and the biochemical indicators associated with fatigue showed that PISMF had a good resistance to movement fatigue.

Scophthalmus maximus；fishskin；peptide liquid；orthogonalexperiment；anti-exercise-fatigue

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.10.023

2016-10-04

楊俊峰（1979—），男（漢），講師，碩士，研究方向：食品科學(xué)，食品營養(yǎng)分析與安全檢測。