李漪倩，諸 蓉，蔡小薇，張 斌，王儒鵬，何 威

? 論 著 ?

肝核受體激動劑對人表皮鱗狀細胞癌SCL-1細胞增殖作用的影響

李漪倩，諸 蓉，蔡小薇，張 斌，王儒鵬，何 威

李漪倩

目的探討肝核受體LXRs激動劑T0901317人表皮鱗狀細胞癌SCL-1細胞增殖的影響及可能機制。方法CCK-8法檢測不同濃度T0901317（1.0、10.0、20.0 μmol/ L）作用SCL-1細胞24、48、72 h后細胞增殖率的變化。流式細胞儀檢測不同濃度肝核受體激動劑對SCL-1細胞周期分布的影響。反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）及免疫印跡試驗（Western blot）檢測肝核受體激動劑對細胞周期相關(guān)因子PCNA、p21、p27、CCND1表達水平的影響。結(jié)果T0901317可明顯抑制SCL-1細胞增殖，并呈現(xiàn)一定的時間和濃度依賴性；肝核受體激動劑作用于細胞株后，SCL-1細胞的G1期百分率上升，而S期、G2 期百分率下降；且在一定濃度范圍內(nèi)導(dǎo)致細胞周期因子p21的mRNA及蛋白表達增加，而其他細胞周期相關(guān)因子表達未見明顯變化。結(jié)論肝核受體LXRs激動劑可能通過促進細胞周期調(diào)節(jié)負性因子p21的表達，導(dǎo)致細胞周期靜息甚至停滯于G1期，從而抑制細胞增殖。

癌，鱗狀細胞；SCL-1細胞；LXRs；p21；G1期阻滯

[J Pract Dermatol, 2017, 10(2):65-69]

皮膚鱗狀細胞癌 (squamous cell carcinoma，SCC，簡稱皮膚鱗癌)，是皮膚科臨床上最常見的皮膚惡性上皮細胞腫瘤[1]，近年來，皮膚鱗癌的發(fā)生率呈逐年升高趨勢。該病不僅可以導(dǎo)致患者容貌改變或毀損而影響美觀，還可因可能發(fā)生的腫瘤轉(zhuǎn)移而威脅患者的健康，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。但目前為止，皮膚鱗癌的發(fā)病機制目前仍不十分清楚。肝臟X受體（liver X activated receptors，LXRs）是代謝性核受體家族的成員之一，目前已鑒定發(fā)現(xiàn)LXRα和LXRβ兩種亞型。且兩種受體在人類皮膚中均有表達[2]。近年來有研究表明，LXRs直接或者間接誘導(dǎo)參與了調(diào)控腫瘤有關(guān)糖脂代謝的基因表達，參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有部分研究發(fā)現(xiàn)LXRβ經(jīng)激動劑T0901317作用可以發(fā)生活化，并使得一些腫瘤細胞的增殖得到抑制[3,4]。但其在皮膚鱗癌SCC發(fā)病中的作用及機制尚不明確。本實驗采用LXR激動劑T0901317處理體外培養(yǎng)的皮膚鱗癌SCL-1細胞，觀察其對皮膚鱗癌細胞增殖抑制作用的影響，并探索其產(chǎn)生作用可能的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

人皮膚鱗狀細胞癌SCL-1細胞（廣州吉妮歐生物技術(shù)公司）。主要試劑1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（美國Gibco公司），胰蛋白酶（Hyclone公司），T0901317（美國Sigma公司），DMSO（美國Sigma公司）。Trizol（美國Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）試劑盒以及PCR試劑盒（日本TaKaRa公司）。PCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。兔抗人p27抗體（美國Abcam公司），兔抗人p21抗體（美國Abcam公司），兔抗人CCND1抗體（美國Abcam公司），兔抗人PCNA抗體（美國abcam公司），鼠抗人β-肌動蛋白抗體（德國Santacruz公司）。羊抗鼠及羊抗兔二抗（中杉金橋）。BCA 蛋白濃度測定試劑盒（中國碧云天生物技術(shù)公司），蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟和細胞裂解液（Pierce公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與藥物處理 SCL-1細胞生長于含10%FBS 、100 U/L青霉素及0.1 mg/ml 鏈霉素的1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5% CO2溫箱培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。將用DMSO溶解的T0901317，溶解濃度為0.01 mol/L，保存于-80℃冰箱中，實驗前用培養(yǎng)基稀釋成終濃度。

1.2.2 CCK-8法 將處于對數(shù)生長期的SCL-1細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl，3 000個細胞，待細胞完全貼壁后分別加入不同濃度的T0901317，使其終濃度為 1.0、10.0、20.0 μmol/L 和 0.1% 的 DMSO，其中每孔設(shè)3個復(fù)孔，陰性對照孔只加1640培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后每孔加入CCK-8各10 μl，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，將96孔板放置在酶標儀上，選定450 nm波長，測定各孔的A 值。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期 將對數(shù)生長期的SCL-1細胞以1×105個接種在6孔板中。在37℃、5%CO2條件下孵育24 h，去上清液，加入含1.0、10.0、20.0 μmol/L的T0901317的培養(yǎng)基2 ml（對照組為空白培養(yǎng)基），作用24 h后，將貼壁細胞用0.25%的胰酶消化后，加入預(yù)冷的PBS清洗細胞。去上清液后，緩慢加入-20℃ 的70%乙醇過夜。上機前加入含 1 mg/ml的 Rnase 的碘化丙啶(10 mg/L)，4℃條件下染色30 min在流式細胞儀上測定。

1.2.4 RT- PCR 使用RT- PCR即實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction)檢測增生細胞核抗原 ( proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、細胞周期蛋白D1(CCND1)、p21、p27基因的表達。步驟如下：將約1×105個細胞接種在6孔板中，給予T0901317刺激 24 h后的進行裂解，采用TRIzol提取各組細胞中的總RNA，將1 μg總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的操作步驟反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA 作為PCR模板，-20℃ 保存。引物序列：p21上游引物 5'-GCCCGCTCTACATCTTCTG-3'，下游引物 5'-GTGCCATCTGTTTACTTCTCAA -3'，擴增產(chǎn)物 424 bp。以β-肌動蛋白作為內(nèi)參照 (285 bp)，上游引物 5'-GTGAAGGTGACAGCAGTCGGTT-3'，下游引物 5'-GAAGTGGGGTGGCTTTTAGGA-3'。p27引物序列：上游引物5'-CAAGTACGAGTGGC AGAGGTG-3',下游引物，5'-ATGCGTGTCCTCAG AGTTAGCC -3'，擴增產(chǎn)物172 bp。PCNA上游引物：5'- TGATGAGGTCCTTGAGTG-3'，下游引物5'-GAGTGGTCGTTGTCTTTC- 3', 擴增產(chǎn)物為 332 bp。CCND1上游引物：5'-GAACACGGCTCACGCTTAC-3'，下游引物 ：5'-TTGTGCCCTTGCCCCATC-3'，擴增片段 105 bp。PCR條件:采用 SYBR Green 染料法進行實時PCR檢測。根據(jù)試劑盒要求配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性 5 min，然后94℃變性 1 min，58℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，擴增35 個循環(huán)，最后 72℃延伸 10 min。β-肌動蛋白擴增28個循環(huán)。各樣本結(jié)果均用其相應(yīng)的β-肌動蛋白標化。

1.2.5 總蛋白的提取及Western blot 采用Western blot檢測PCNA、p21、p27、CCND1蛋白的表達。步驟如下：細胞的鋪板和藥物處理同前一項，棄去培養(yǎng)液后，用PBS清洗細胞，棄去殘余液體，每管以一定比例加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF，置于冰浴中 30 min，使細胞充分裂解，12 000 r/ min離心15 min，取上清液于另一新的EP管中，用BCA 法測定蛋白濃度。將所提取的蛋白加入 5×SDS 蛋白上樣緩沖液煮沸備用，取 40 μg的細胞蛋白樣品上樣于配制好的10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離，用濕轉(zhuǎn)的方法將蛋白轉(zhuǎn)至 PVDF膜上。濕轉(zhuǎn)結(jié)束后，用5%脫脂奶粉將PVDF膜于37℃孵箱封閉1 h，后將膜封入含有兔抗人p21單克隆抗體( 工作濃度 1:1 000) 、兔抗人p27單克隆抗體( 工作濃度 1:1 000)、兔抗人PCNA單克隆抗體( 工作濃度 1:1 000)、兔抗人CCND1單克隆抗體( 工作濃度 1:1 000)及鼠抗人β-肌動蛋白單克隆抗體( 工作濃度 1:500)的封閉液的小塑料袋內(nèi), 4℃過夜。取膜用TBST洗3次，每次10 min。洗后1:5 000稀釋二抗，于 37℃孵育1 h ，TBST洗3次后在暗室中用化學(xué)發(fā)光底物法將 PVDF膜曝光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用 t 檢驗，采用2-△△CT法計算Real-Time PCR所得的計量方法進行分析。以 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度LXR受體激動劑作用于SCL-1細胞不同時間對其增殖的影響

使用加入含1.0、10.0、20.0 μmol/L的LXR受體激動劑T0901317分別作用于SCL-1細胞24 h、48 h、72 h后，測得450 nm處A值，計算中以A 值表示，行統(tǒng)計學(xué)分析，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）（表1）。LXR受體激動劑T0901317對細胞的增殖有抑制作用，且隨時間濃度抑制作用呈增強趨勢（圖1）。

藥物對細胞增殖的抑制率計算公式：抑制率=1-[A(加藥) -A（空白）]/[ A（對照）- A（空白）]。A（加藥）：具有細胞、CCK溶液和藥物溶液的孔的吸光度；A（空白）：具有培養(yǎng)基和CCK溶液而沒有細胞的孔的吸光度；A（對照）：具有細胞、CCK溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度。

2.2 不同濃度LXR受體激動劑作用24 h對SCL-1細胞周期分布的影響

不同濃度T0901317作用于細胞后，在20.0 μmol/L的濃度作用下SCL-1細胞中G0/G1期細胞比例分別為68.86%和68.96%，明顯高于對照組47.51%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；而S期細胞比例中，T0901317處理組也顯著低于對照組（ P＜0.01），提示LXR激動劑可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的SCL-1細胞周期中的G0/G1期細胞比例升高，而S期細胞比例則明顯降低（表2，圖2）。由此LXR受體激動劑可能抑制細胞由G1期進入S期，導(dǎo)致細胞周期停滯，從而抑制細胞增殖。

表1 不同濃度LXR受體激動劑T0901317作用SCL-1細胞不同時間后的抑制率 （±s，%）

表1 不同濃度LXR受體激動劑T0901317作用SCL-1細胞不同時間后的抑制率 （±s，%）

注：空白對照組的抑制率值皆為0，與對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

T0901317處理組 1.0 μmol/L 10.0 μmol/L 20.0 μmol/L 24 h 0.040±0.050 0.090±0.090 0.250±0.030**48 h 0.240±0.130 0.310±0.110**0.430±0.030**72 h 0.550±0.008*0.590±0.024**0.640±0.011**

圖1 T0901317作用不同時間不同濃度的增殖抑制情況

表2 不同濃度LXRs激動劑作用于SCL-1細胞24 h后流式得細胞周期各數(shù)值

圖2 對照組、20.0 μmol/L T0901317組作用24 h后細胞周期分布結(jié)果圖

表3 不同濃度LXR受體激動劑T0901317作用皮膚鱗癌SCL-1細胞后相關(guān)基因的2-△△CT值 （±s）

表3 不同濃度LXR受體激動劑T0901317作用皮膚鱗癌SCL-1細胞后相關(guān)基因的2-△△CT值 （±s）

注：與對照組比較：*P＜0.05，**P＜0.01

T0901317 空白對照組 1.0 μmol/L 10.0 μmol/L 20.0 μmol/L PCNA 1.062±0.044 1.024±0.039 0.680±0.077*0.150±0.090**p21 1.880±0.280 3.210±0.120**5.120±0.310**6.560±1.650**p27 1.130±0.210 1.110±0.150 1.160±0.130 1.048±0.200 CCND1 1.090±0.100 1.130±0.100 1.120±0.110 1.120±0.110

2.3 實時熒光定量PCR檢測細胞周期相關(guān)因子基因表達變化

1.0 、10.0、20.0 μmol/L T0901317處理細胞24 h后，細胞周期相關(guān)因子mRNA的相對表達見表3。PCNA mRNA的表達水平呈下降趨勢（P ＜0.05），而p21 mRNA的表達水平則呈上升趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。而p27及CCND1的mRNA表達未見明顯變化（P＞0.05）（圖3）。

2.4 不同濃度LXR受體激動劑作用對SCL-1細胞中細胞周期各相關(guān)因子蛋白表達的影響

與對照組相比，分別以1.0、10.0和20.0 μmol/L的T0901317處理細胞24 h后，Western blot檢測PCNA蛋白表達明顯降低，而p21蛋白表達水平有明顯上升的趨勢，蛋白的表達水平與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。CCND1及p27蛋白表達無明顯變化，各組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖4、5）。

圖3 不同濃度T0901317作用24 h后對細胞周期因子mRNA表達的影響

圖4 對照組及1、10、20 μmol T0901317劑量誘導(dǎo)下的周期因子蛋白表達

圖5 灰度掃描分析蛋白PCNA、p21 的表達變化

3 討論

目前已有許多研究表明，腫瘤脂類異常代謝是整個腫瘤代謝紊亂或稱腫瘤代謝重編程的重要組成部分。幾乎所有類型的腫瘤細胞都可以表現(xiàn)出內(nèi)源性的脂肪酸從頭合成能力的增強[5]。研究如何通過阻斷脂類代謝相關(guān)途徑抑制腫瘤細胞中能量的生成，從而達到治療惡性腫瘤的目的正成為新的治療替代方案[6]。LXRs作為一種氧化固醇激活的核受體，其參與機體的多種生理活動的調(diào)節(jié)，包括膽固醇的代謝和轉(zhuǎn)運，脂肪的形成，糖類的代謝和炎癥等過程。

LXRs的調(diào)控涉及多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，關(guān)系較為復(fù)雜。在腫瘤類疾病中的研究認為，LXRs在不同類型腫瘤生理過程中可能發(fā)揮雙重作用，一方面LXRs可抑制包括肝癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、黑素瘤等多種腫瘤細胞的增殖[3,7-9]；另一方面，某些腫瘤組織本身可以產(chǎn)生LXR激動劑，抑制機體本身的免疫反應(yīng)，從而使腫瘤細胞免于免疫系統(tǒng)監(jiān)視[10]。在一項口腔鱗癌的研究中，發(fā)現(xiàn)LXR受體激動劑減弱了腫瘤的生長，而其中腫瘤細胞內(nèi)ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白A1（ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1）表達上調(diào)，而細胞內(nèi)膽固醇的水平有所降低[11]。在分子機制水平上，LXRs可通過使細胞周期促進因子的表達降低，升高抑制因子的表達來靶向調(diào)節(jié)細胞周期的幾個關(guān)鍵點。盡管LXRs對細胞周期的所有調(diào)節(jié)因子活性都可能有所影響，但似乎主要集中于G0/G1期，從而導(dǎo)致細胞周期靜息。筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)，無論在體外培養(yǎng)鱗癌細胞，抑或人原位鱗癌組織中均存在肝臟X受體的表達升高。

本實驗的研究結(jié)果顯示，在1.0～20.0 μmol/L的濃度范圍內(nèi)T0901317試劑可抑制皮膚鱗癌SCL-1細胞增殖，并在一定程度上呈現(xiàn)時間及劑量依賴性。而流式細胞儀檢測結(jié)果提示，激活LXRs可阻滯SCL-1細胞周期進程，將細胞阻滯于G1期，提示其可以通過改變細胞周期的進程而抑制SCL-1細胞生長。RT-PCR及 Western blot的檢測結(jié)果均提示經(jīng)過LXRs激動劑處理后，作為評定細胞增生活性標志物的PCNA mRNA和其蛋白的表達水平明顯降低。而其他細胞周期相關(guān)調(diào)節(jié)因子中，細胞負性調(diào)節(jié)因子p21的表達則明顯上升，其余細胞周期相關(guān)因子則未出現(xiàn)明顯的變化趨勢。p21是最先發(fā)現(xiàn)的一類重要的廣譜細胞周期蛋白激酶抑制因子，幾乎能抑制所有周期蛋白-周期蛋白依賴性激酶復(fù)合物的活性，使得細胞周期停滯，細胞的增殖受到抑制[12]。它受癌基因p53的調(diào)節(jié)，在依賴p53的表達通路上與腫瘤的表達含量、表達位置，以及腫瘤的最終預(yù)后都有著密切的關(guān)系。而在乳腺癌的研究中已發(fā)現(xiàn)LXR激動劑能夠升高p53的表達[13]。因此，筆者推測肝核受體激動劑作用可能正是通過調(diào)節(jié)細胞周期抑制因子p21的表達，從而抑制細胞周期進程，導(dǎo)致細胞周期停滯，使得細胞增殖得到抑制，但其具體機制尚有待進一步的實驗證實。

[1] Jemal AR, Siegel E, Ward E, et al. Cancer statistics [J]. CA Cancer J Clin, 2007, 57:43-66.

[2] Russell LE, Harrison WJ, Bahta AW, et al. Characterization of liver X receptor expression and function in human skin and the pilosebaceous unit [J]. Exp Dermatol, 2007, 16(10):844-852.

[3] Pommier AJ, Alves G, Viennois E, et al. Liver X receptor activation downregulates AKT survival signaling in lipid rafts and induces apoptosis of prostate cancer cells [J]. Oncogene, 2010, 29(18):2712-2723.

[4] Candelaria NR, Addanki S, Zheng J, et al. Antiproliferative effects and mechanisms of liver X receptor ligands in pancreatic ductal adenocarcinoma cells [J]. PLoS One, 2014, 9(9):e106289.

[5] Mashima T, Seimiya H, Tsuruo T. De novo fatty-acid synthesis and related pathways as molecular targets for cancer therapy [J]. Br J Cancer, 2009, 100(9):1369-1372.

[6] Hsu PP, Sabatini DM. Cancer cell metabolism: Warburg and beyond [J]. Cell, 2008, 134(6):703.

[7] Catia T, Silvano S, Steffensen KR, et al. LXR-dependent and -independent effects of oxysterols on immunity and tumor growth [J]. Eur J Immunol, 2014, 44(7):1896-1903.

[8] Chuu CP, Lin HP. Antiproliferative effect of LXR agonists T0901317 and 22(R)-hydroxycholesterol on multiple human cancer cell lines [J]. Anticancer Res, 2010, 30(9):3643-3648 .

[9] Pencheva N, Tran H, Buss C, et al. Convergent multi-miRNA targeting of ApoE drives LRP1/LRP8-dependent melanoma metastasis and angiogenesis [J]. Cell, 2012, 151(5):1068-1082 .

[10] Villablana EJ, Raccosta L, Zhou D, et al. Tumor mediated liver X receptor-alpha activation inhibits CC chemokiine receptor-7 expression on dendritic cellsand dampens antitumor response [J]. Nat Med, 2010, 16(1):98-105 .

[11] Kaneko T, kanno C, Lchikawa-Tomikawa N, et al. Liver X receptor reduces proliferation of human oral cancer cells by promoting cholesterol efflux via up-regulation of ABCA1 expression [J]. Oncotarget, 2015, 32(6):3345-3357.

[12] Shapiro GI. Cyclin-dependent kinase pathways as targets for cancer treatment [J]. J Clin Oncol, 2006, 24 (11):1770-1783.

[13] Vedin LL, Lewandowski SA, Parini P, et al. The oxysterol receptor LXR inhibits proliferation of human breast cancer cells [J]. Carcinogenesis, 2009, 30(4):575-579 .

Effects of LXRs agonists on the proliferation of SCL-1 cells

LI Yi-qian，ZHU Rong，CAI Xiao-wei，et al
Department of Dermatology, the Second Aff liated Hospital, the Third Military Medical University, Chongqing 400037, China

ObjectiveTo detect the effects of LXRs agonists T0901317 on human cutaneous squamous cell carcinoma SCL-1.Methods24,48 and 72 hours after T0901317(1.0, 10.0, 20.0 μmol/L) with different concentrations acting on SCL-1 cells, CCK-8kit assay was performed to detect cell proliferation. After having been treated with T0901317(1.0, 10.0, 20.0 μmol/L) for 24 hours, SCL-1 cells cycle progression was analyzed by flow cytometry. RT-PCR and Western blot were used to detect the expression of cell cycle related factors’ genes and proteins.ResultsT0901317 inhibited the proliferation of SCL-1 cells in the concentration and time dependant manners. The proportion of SCL-1 cells in G1-phase increased, while that in G2- and S-phase decreased after having been treated with T0901317 (1.0, 10.0 ,20.0 μmol/L) for 24 hours. The result of PCR and Western blot showed that the expression of p21 protein was up-regulated, but the other cell cycle factors had no obviously changes.ConclusionThe inhibition of SCL-1 cells proliferation by LXRs agonists is involved in G1-phase arrest, which might be related to the increased expression of p21 factor.

Aarcinoma，squamous cell；SCL-1 cells；LXRs；p21；G1-phase arrest

R739.5

A

1674-1293(2017)02-0065-05

2016-12-15

2017-01-09）

（本文編輯 耿建麗）

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20170201

國家自然科學(xué)基金青年基金資助項目（81502369）

400037 重慶，第三軍醫(yī)大學(xué)附屬新橋醫(yī)院（李漪倩，諸蓉，蔡小薇，張斌，王儒鵬，何威）

李漪倩，碩士研究生，住院醫(yī)師，研究方向 ：皮膚腫瘤，E-mail: 619104962@qq.com

何威，E-mail: weiheskin@163.com