巴 根，呂雪蓮，王聰敏，丁 瀟，區(qū)敏儀，祝 賀，楊蓉婭

CARD9 基因敲除小鼠骨髓來源樹突狀細胞對阿薩希毛孢子菌臨床株的免疫反應(yīng)缺陷

巴 根，呂雪蓮，王聰敏，丁 瀟，區(qū)敏儀，祝 賀，楊蓉婭

巴 根

目的初步探討CARD9基因敲除小鼠骨髓來源樹突狀細胞（bone marrowderived dendritic cell, BMDC）對阿薩希毛孢子菌臨床株（Trichosporon asahii, T.asahii）的免疫反應(yīng)缺陷。方法體外培養(yǎng)野生型（wild type, WT）與CARD9基因敲除型（CARD9 knockout, CARD9-/-）小鼠BMDC并分別與熱滅活的T.asahii進行共培養(yǎng)，比較兩者對菌體的黏附吞噬能力、表面共刺激分子的激活、細胞因子的表達以及兩種小鼠感染菌株后的生存率。結(jié)果共培養(yǎng)24 h后，WT與CARD9-/-小鼠BMDC對T.asahii的黏附吞噬情況比較未見明顯差異；經(jīng)T.asahii刺激的CARD9-/-小鼠BMDC的CD80、CD86激活情況以及白細胞介素(IL)-6、腫瘤壞死因子(TNF)-α表達水平均明顯低于WT小鼠BMDC（P＜0.05）；感染T.asahii的CARD9-/-小鼠的生存率明顯低于WT小鼠（P＜0.05）。結(jié)論CARD9-/-小鼠BMDC對T.asahii的免疫反應(yīng)缺陷主要體現(xiàn)在共刺激分子的激活以及促炎細胞因子的表達，但并未影響其對T.asahii的吞噬識別。

阿薩希毛孢子菌；基因，CARD9；樹突狀細胞

[J Pract Dermatol, 2017, 10(2):73-76]

阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii, T.asahii）是毛孢子菌病（trichosporonosis）的主要致病菌，多引起免疫缺陷患者播散性感染[1]。本課題組在臨床上發(fā)現(xiàn)了國內(nèi)首例播散性阿薩希毛孢子菌病[2]，患者無腫瘤及人免疫缺陷病毒（human immunodef ciency virus，HIV）感染等獲得性免疫缺陷病史，長期抗真菌治療療效不理想。對該患者進行全外顯子組測序分析顯示其CARD9基因存在錯義點突變進而造成了CARD9功能缺陷。CARD9即胱天蛋白酶募集域蛋白-9（caspase recruitment domain-containing protein 9，CARD9），是一種重要的接頭蛋白，能夠與B細胞淋巴瘤因子-10（BCL10）、胃腸黏膜相關(guān)淋巴組織-1（MALT1）結(jié)合形成CBM復(fù)合體，在抗真菌免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要的胞內(nèi)信號傳導(dǎo)作用，主要表達于巨噬細胞、中性粒細胞以及樹突狀細胞（dendritic cell, DC）[3]。而DC作為調(diào)動并調(diào)節(jié)宿主抗真菌免疫反應(yīng)的關(guān)鍵，能夠在病原真菌入侵時將菌體黏附吞噬，同時激活表面共刺激分子，并表達多種細胞因子，從而對其進行抗原提呈并誘導(dǎo)Th細胞（helper T cell）的分化，激活適應(yīng)性免疫將其殺滅[4,5]。

本研究通過體外實驗?zāi)MDC對致病真菌的免疫識別過程，利用CARD9基因敲除型（CARD9 Knockout, CARD9-/-）小鼠CARD9功能缺陷的特點，分別將野生型（wild type，WT）與CARD9-/-小鼠骨髓來源樹突狀細胞（bone marrow-derived dendritic cell, BMDC）與分離自播散性阿薩希毛孢子菌病患者的T.asahii進行共培養(yǎng)，比較兩者對菌體的黏附吞噬能力、表面共刺激分子的激活、細胞因子的表達以及兩種小鼠感染菌株后的生存率，從微觀和宏觀角度初步探索CARD9基因敲除小鼠BMDC對T.asahii的免疫反應(yīng)缺陷，為研究CARD9功能缺陷及播散性阿薩希毛孢子菌病患者的發(fā)病機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 IX73型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）、普通光學(xué)顯微鏡（德國Leica公司）、LRH-150-MS型真菌培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）、5810R冷凍離心機（德國Eppendorf公司）、3111型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）、LSRFortessa型流式細胞儀（美國BD公司）。

1.1.2 試劑 胎牛血清（香港BIOCIO公司），RPMI-1640液體培養(yǎng)基（美國Gibco公司），磷酸鹽緩沖液PBS（美國Hyclone公司），鏈霉素-青霉素（美國Gibco公司），重組小鼠GM-CSF、重組小鼠IL-4（美國PeProtech公司），APC標(biāo)記的小鼠CD11c單抗、PE標(biāo)記的小鼠CD80單抗、FITC標(biāo)記的小鼠CD86單抗、小鼠Fc block（美國BD公司），4%多聚甲醛、紅細胞裂解液（北京索萊寶生物科技有限公司），YPD干粉（北京奧博星生物技術(shù)有限公司），AimPlex小鼠Th1/Th2/Th17-16因子試劑盒（北京曠博生物技術(shù)股份有限公司）。

1.1.3 菌株 T.asahii分離自播散性阿薩希毛孢子菌病患者頸部皮損，通過基因測序并比對GenBank/ EMBL/DDBJ國際核酸序列數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)該菌株rRNA大亞基D1/D2區(qū)域堿基序列與阿薩希毛孢子菌標(biāo)準(zhǔn)株完全相同，證實為阿薩希毛孢子菌并保藏于陸軍總醫(yī)院皮膚科實驗室（菌藏號：BM1403）。

1.1.4 實驗動物 選取WT（C57BL/6）與CARD9-/-純系小鼠，雄性，周齡6～8 w，體重18～20 g，由清華大學(xué)動物實驗中心提供[許可證號：SCXK（京）2014-0007]。

1.2 方法

1.2.1 WT與CARD9-/-小鼠BMDC誘導(dǎo)培養(yǎng) 將WT與CARD9-/-小鼠頸椎脫臼處死，無菌取股骨及脛骨骨髓。加入紅細胞裂解液去除紅細胞，離心（1 500 r/min, 5 min）后棄上清。RPMI-1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）懸浮細胞，以每孔2×106密度接種于6孔培養(yǎng)板，加入細胞因子GM-CSF（終濃度20 ng/ml）、IL-4（終濃度10 ng/ml），置于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔日半量換液并補足細胞因子。培養(yǎng)至8 d時，各取1×104的WT與CARD9-/-小鼠懸浮細胞，流式細胞術(shù)檢測其CD11c（小鼠BMDC的特異性標(biāo)志）表達率分別為（96.37 ±0.92）%和（97.11±1.84）%，說明誘導(dǎo)培養(yǎng)成功。收獲剩余懸浮及半懸浮細胞，并以相同濃度重新鋪入6孔板中待用。

1.2.2 菌懸液配制 將凍存于-80℃甘油中的T.asahii復(fù)溫后接種于20 ml液體YPD培養(yǎng)基中，35℃振蕩培養(yǎng)18 h，增殖產(chǎn)生大量孢子。取10 ml熱滅活（121℃，15 min）并離心（1 500 r/min, 5 min）棄掉YPD培養(yǎng)基，以無菌生理鹽水配制濃度為1×107/ml的熱滅活菌懸液；另10 ml直接離心（1 500 r/min, 5 min），棄掉YPD培養(yǎng)基并以無菌生理鹽水配制相同濃度的成活T.asahii菌懸液待用。

1.2.3 BMDC對T.asahii的吞噬率測定 將圓形細胞粘附載玻片（直徑1cm）置于24孔板中，以每孔1 ×105密度分別鋪入WT與CARD9-/-小鼠BMDC，貼壁2 h后加入熱滅活T.asahii菌懸液（細胞與菌體濃度比例為1:5）。置于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)24 h后棄掉上清，PBS漂洗3次，4%多聚甲醛固定10～20 min后取出圓形蓋玻片置于載玻片上。經(jīng)瑞氏-姬姆薩染色后用倒置相差顯微鏡觀察BMDC對T.asahii的吞噬現(xiàn)象，至少計數(shù)100個細胞，吞噬率=吞噬T.asahii的BMDC細胞個數(shù)/所計數(shù)的BMDC細胞總數(shù)×100%。

1.2.4 BMDC表面共刺激分子檢測 將培養(yǎng)有WT與CARD9-/-小鼠BMDC的6孔板中分別加入熱滅活T.asahii菌懸液（細胞與菌體濃度比例為1:5），以未加入菌懸液的WT與CARD9-/-小鼠BMDC作為對照組，置于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)24 h。收集各組BMDC，調(diào)整單個待測樣本細胞數(shù)至5× 105，以50 μl的Fc-block冰上孵育5 min，PBS洗滌1次。分別加入APC-CD11c、FITC-CD86與PE-CD80單抗各1 μl，4℃避光孵育30 min，用PBS洗滌1次，流式細胞儀上機檢測。

1.2.5 BMDC產(chǎn)生細胞因子檢測 收集上一步實驗中各組上清液，采用AimPlex小鼠Th1/Th2/Th17-16因子試劑盒檢測小鼠BMDC細胞因子IL-1β、白細胞介素(IL)-6、IL-23和腫瘤壞死因子(TNF)-α的產(chǎn)生水平，具體操作按照試劑盒說明書進行，每組設(shè)1個復(fù)孔。

1.2.6 感染小鼠生存率分析 分別取WT小鼠與CARD9-/-小鼠各3只（生存率分析要求樣本含量為觀察協(xié)變量的5～20倍。本實驗的觀察協(xié)變量僅有小鼠生存時間1項，樣本含量為WT小鼠與CARD9-/-小鼠共6只，樣本含量為觀察協(xié)變量的6倍，符合統(tǒng)計學(xué)要求），采用1 ml注射器將成活T.asahii菌懸液經(jīng)尾靜脈對每只小鼠各接種0.1 ml。每日觀察小鼠，連續(xù)觀察16 d，記錄小鼠生存情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用GraphPad Prism5.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析及圖表制作，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析（oneway ANOVA）比較各組間均值，采用Log-rank檢驗比較小鼠生存率。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMDC形態(tài)及其對T.asahii的吞噬比較

經(jīng)瑞氏-姬姆薩染色可見，培養(yǎng)至8 d時WT與CARD9-/-小鼠BMDC在光鏡下分布較均勻，表面可見典型的樹枝樣突起，其形態(tài)比較未見明顯差異（圖1a）。與T.asahii共培養(yǎng)24 h后可見，WT與CARD9-/-小鼠BMDC對菌體均具有黏附吞噬作用，且兩者吞噬形態(tài)相似（圖1b），兩組吞噬率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖1c）。

2.2 BMDC表面共刺激分子的活化比較

共培養(yǎng)24 h后，以CD11c陽性的細胞圈門檢測各組BMDC表面共刺激分子表達情況。結(jié)果顯示，未經(jīng)T.asahii刺激的WT與CARD9-/-小鼠BMDC均低表達CD80與CD86，且差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而經(jīng)T.asahii刺激的WT與CARD9-/-小鼠BMDC的CD80與CD86表達水平均明顯升高，但CARD9-/-小鼠BMDC的表達水平明顯低于前者（P＜0.05）（圖2）。

2.3 BMDC各細胞因子的表達比較

共培養(yǎng)24 h后，未經(jīng)T.asahii刺激的WT與CARD9-/-小鼠BMDC均低表達IL-6和TNF-α，且表達差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P均＞0.05）；而經(jīng)T.asahii刺激的WT小鼠BMDC表達IL-6和TNF-α水平均明顯高于CARD9-/-小鼠BMDC（P＜0.05）（圖3）。

圖1 WT與CARD9-/-小鼠BMDC及其對T.asahii吞噬功能的比較（HE染色）

圖2 對照組與T.asahii刺激組共刺激分子的表達比較

圖3 對照組與T.asahii刺激組細胞因子表達比較

2.4 感染小鼠生存率比較

連續(xù)觀察16 d，感染T.asahii的CARD9-/-小鼠全部死亡，分別于9 d死亡2只，11 d死亡1只；而感染T.asahii的WT小鼠則全部存活。Log-rank生存率分析提示兩組小鼠生存率差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。

圖4 感染小鼠生存率比較

3 討論

新近研究顯示，CARD9功能缺陷可以導(dǎo)致白念珠菌、疣狀瓶霉、皮炎外瓶霉以及紅色毛癬菌等多種真菌播散性感染[6-8]。而真菌感染后宿主免疫細胞對致病真菌反應(yīng)的第一步就是將其吞噬，但這一功能信號在胞內(nèi)的傳遞并不依賴于CARD9的介導(dǎo)[9,10]。本實驗中可以看到WT與CARD9-/-小鼠BMDC對菌體均具有黏附吞噬作用，且兩組吞噬率比較未見明顯差異，說明CARD9功能缺陷同樣并未影響B(tài)MDC對T.asahii的吞噬作用。

DC攝取致病真菌后便通過模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）對菌壁各種抗原成分進行識別，這其中dectin-1（DC-associated C-type lectin）受體能夠識別真菌菌壁的重要抗原成分β-葡聚糖（β-glucan），其后在脾酪氨酸酶（spleen tyrosine kinase, Syk）作用下促使CARD9與BCL10、MALT1形成CBM復(fù)合體，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（nuclear factor kappa B）促進共刺激分子CD80和CD86的活化[10,11]。本實驗以小鼠BMDC的特異性標(biāo)志CD11c圈門，可以看到經(jīng)T.asahii刺激的WT與CARD9-/-小鼠BMDC其共刺激分子表達水平均明顯升高，但后者明顯低于前者。這說明盡管兩者均能夠識別T.asahii，但CARD9功能缺陷影響了CBM復(fù)合體的形成，進而降低了共刺激分子的表達，從而阻礙了抗原提呈過程。

另外本實驗中經(jīng)T.asahii刺激的WT小鼠BMDC表達IL-6和TNF-α水平明顯高于CARD9-/-小鼠，這其中TNF-α能夠趨化中性粒細胞早期殺滅真菌；而IL-6則介導(dǎo)Th17細胞的分化，通過適應(yīng)性免疫效應(yīng)進一步清除真菌[12]。Th17細胞在宿主對抗真菌感染中具有重要作用，而多數(shù)文獻[3,6-8,10]報道CARD9功能缺陷主要引起IL-6低表達進而影響了Th17細胞的分化，從而造成宿主對各種機會性致病真菌易感。本研究中動物實驗顯示感染T.asahii的CARD9-/-小鼠全部死亡，而WT小鼠則全部存活，兩者生存率存在明顯差異，從宏觀角度證實了CARD9功能缺陷的確會導(dǎo)致宿主對T.asahii免疫功能下降。但由于CARD9在中性粒細胞及巨噬細胞中均有表達且同樣影響二者抗真菌效應(yīng)的發(fā)揮，與此同時Th1與Th2細胞也參與了適應(yīng)性免疫反應(yīng)過程，因此上述通路缺陷是否直接造成了宿主感染T.asahii還有待研究[6,12-13]。

綜上所述，該研究初步表明，CARD9-/-小鼠BMDC對T.asahii的免疫反應(yīng)缺陷主要影響共刺激分子的激活以及促炎細胞因子的表達，但并未影響其對T.asahii的吞噬識別。這也為研究CARD9功能缺陷及播散性阿薩希毛孢子菌病患者的發(fā)病機制奠定了基礎(chǔ)。

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The impairment of immune response against Trichosporon asahii clinical isolate in CARD9 knockout murine bone marrow-derived dendritic cell

BA Gen，LV Xue-lian，WANG Cong-min，et al
Department of Dermatology, PLA Army General Hospital & Second Military Medical University, Beijing 100700, China

ObjectiveTo investigate the impairment of immune response against Trichosporon asahii(T.asahii) clinical isolate in CARD9 knockout murine bone marrow-derived dendritic cell(BMDC).MethodsAfter in vitro co-culture of BMDCs from wild type mice(WT) and CARD9 knockout mice(CARD9-/-) with heat-killed T.asahii, the phagocytotic ability, costimulatory molecules activation and cytokines production of BMDCs between WT and CARD9-/- were compared.ResultsCompared with the WT BMDC, the phagocytotic ability of CARD9-/- BMDC was not signif cantly impaired, but its activation of CD80 and CD86 and the production of IL-6 and TNF-α were significantly lower after co-cultured with T.asahii for 24h. After having been infected by T.asahii, the CARD9-/- mice showed remarkable lower survival rate than the WT mice.ConclusionCARD9-/- BMDC exhibited the defects in costimulatory molecules activation and inf ammatory cytokines production but not the phagocytotic ability against T.asahii.

Trichosporon asahii；Gege，CARD9；Dendritic cell

R756.9

A

1674-1293(2017)02-0073-04

2016-10-10

2017-01-18）

（本文編輯 祝賀）

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20170203

國家自然科學(xué)基金面上項目（81471928；81571972）；全軍醫(yī)學(xué)科技青年培育項目（14QNP010）

100700 北京，陸軍總醫(yī)院（第二軍醫(yī)大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院）皮膚科（巴根，王聰敏，丁瀟，區(qū)敏儀，祝賀，楊蓉婭）；首都醫(yī)科大學(xué)附屬安貞醫(yī)院皮膚科（呂雪蓮）

巴根，在讀碩士研究生，主要研究方向：阿薩希毛孢子菌與宿主天然免疫，E-mail: 1311571168@qq.com

楊蓉婭，E-mail: yangrya@sina.com