陶興林，謝志軍，朱惠霞，劉明霞，張金文，胡立敏

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，甘肅 蘭州 730070；3.農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制西北地區(qū)科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，甘肅 蘭州 730070)

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花椰菜2種雄性不育系花器特征及花藥發(fā)育的細(xì)胞學(xué)研究

陶興林1,2,3，謝志軍2,3，朱惠霞2,3，劉明霞2,3，張金文1*，胡立敏2,3

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，甘肅 蘭州 730070；3.農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制西北地區(qū)科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，甘肅 蘭州 730070)

本試驗(yàn)以花椰菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系09-R9、保持系09-24和溫敏細(xì)胞核雄性不育系GS-19為試驗(yàn)材料，采用形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)方法研究2種雄性不育系的形態(tài)特征和花藥發(fā)育的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)。結(jié)果表明，2種雄性不育系在育性轉(zhuǎn)換、花器形態(tài)特征及花藥發(fā)育的細(xì)胞學(xué)特征都存在著差異。不同溫度處理的09-R9、09-24和GS-19之間的育性轉(zhuǎn)換存在差異。09-R9和09-24的育性不受溫度影響，09-R9表現(xiàn)為不育，09-24完全可育；GS-19的育性受溫度影響，高溫(20 ℃)不育，低溫(15 ℃)育性恢復(fù)。GS-19和09-R9花蕾和花藥大小差異顯著，GS-19花蕾和花藥顯著小于09-R9；不育株與其可育株花的差異達(dá)到顯著水平，不育株花顯著小于可育株。顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)2種雄性不育系之間的花藥敗育時(shí)期和方式不同，09-R9花藥早期可以形成外形正常的花粉囊，但囊內(nèi)物質(zhì)隨著花蕾的發(fā)育逐漸解體，最終這種不正常的花粉囊全部解體消失，花藥發(fā)育受阻于花粉母細(xì)胞形成之前，屬于無花粉囊敗育類型。GS-19的花藥發(fā)育過程有花粉母細(xì)胞的分化，能形成正常花粉囊，不產(chǎn)生花粉?；蛘弋a(chǎn)生微量的無生活力的花粉粒，花藥發(fā)育受阻于花粉母細(xì)胞到四分體時(shí)期，屬于花粉母細(xì)胞敗育類型。超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，不育系09-R9和高溫條件下不育系GS-19花藥敗育相似，發(fā)生在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)期，沒有四分體的形成，形成了花粉粒外壁發(fā)育異常的“擬小孢子”，最后“擬小孢子”逐漸降解，只剩下花粉空殼。說明2種雄性不育系的敗育方式有差異，但是敗育時(shí)期一致，花藥發(fā)育均受阻于四分體形成之前。

花椰菜；雄性不育系；花器特征；花藥發(fā)育；細(xì)胞學(xué)

我國(guó)大部分農(nóng)村正處于由傳統(tǒng)農(nóng)耕模式向“種草養(yǎng)畜”模式的轉(zhuǎn)型時(shí)期，存在飼料來源嚴(yán)重缺乏等問題，冬季青飼料的缺乏更是嚴(yán)重制約了畜牧業(yè)的發(fā)展。因此，如能把花椰菜(Brassicaoleraceavar.botrytis)菜葉作為越冬青飼料加以開發(fā)，既可以實(shí)現(xiàn)花椰菜的綜合利用，又有助于畜牧業(yè)的發(fā)展。花椰菜是一種非常重要的十字花科蔬菜作物，被公認(rèn)為是最有營(yíng)養(yǎng)的作物之一，特別是鈣、抗氧化劑、維生素A、維生素K、胡蘿卜素、核黃素及鐵的含量很豐富[1-4]。此外，花椰菜菜葉具有良好的適口性，其干物質(zhì)中粗蛋白、粗纖維、粗脂肪、粗灰分以及無氮浸出物的含量分別為19.95%，6.53%，3.53%，13.37%及57.01%，具有良好的飼料開發(fā)價(jià)值。我國(guó)分布地區(qū)廣，品種類型豐富，具有非常明顯的雜種優(yōu)勢(shì)，是雜種優(yōu)勢(shì)利用潛力很大的一類作物，而雄性不育途徑是培育花椰菜新品種的主要途徑之一。2005年，課題組從花椰菜種質(zhì)資源圃里發(fā)現(xiàn)了幾株溫度敏感的不育株，后經(jīng)多代自交選育成育性穩(wěn)定的溫敏核不育系GS-19[5]，屬高溫不育類型。此外，通過回交轉(zhuǎn)育的方法，對(duì)引進(jìn)的細(xì)胞質(zhì)雄性不育材料經(jīng)過7代以上的轉(zhuǎn)育和選擇，獲得了花椰菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系09-R9，并對(duì)其花藥敗育進(jìn)行了初步研究[6]。目前，這兩種雄性不育系已經(jīng)在生產(chǎn)中進(jìn)行了應(yīng)用[7-8]，但導(dǎo)致花藥敗育的確切時(shí)期還不清楚。

作物的雄性不育類型較多，許多學(xué)者對(duì)其敗育時(shí)期和方式進(jìn)行了大量研究，發(fā)現(xiàn)不同作物或者同一作物不同的雄性不育系之間也有差異。對(duì)水稻(Oryzasativa)[9-10]、小麥(Triticumaestivum)[11]、油菜(Brassicacampestris)[12-14]、玉米(Zeamays)[15]、茄子(Solanummelongena)[16]、辣椒(Capsicumannuum)[17]、甘藍(lán)(Brassicaoleracea)[18]等作物的雄性不育系細(xì)胞學(xué)研究較多。明確不同類型花椰菜雄性不育系形態(tài)特征、敗育時(shí)期與細(xì)胞學(xué)特征，在花椰菜雄性不育系的研究和利用過程中具有重要意義。因此，本試驗(yàn)以飼菜兼用型花椰菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系09-R9和溫敏核雄性不育系GS-19為試驗(yàn)材料，用形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)方法研究了花椰菜2種雄性不育系09-R9和GS-19的花器形態(tài)及花藥敗育過程，確定其敗育類型和特點(diǎn)，為花椰菜雄性不育系進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，促使花椰菜兩系法雜交育種工作向更深層次推進(jìn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及處理

本試驗(yàn)選取的飼菜兼用型花椰菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系09-R9、保持系09-24，溫敏核雄性不育系GS-19均是甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所選育和提供。其中細(xì)胞質(zhì)雄性不育系09-R9育性穩(wěn)定，不產(chǎn)生花粉粒，育性變化不受環(huán)境條件影響，09-24是09-R9的保持系。溫敏核雄性不育系GS-19的育性表現(xiàn)與溫度有關(guān)，溫度高于18 ℃表現(xiàn)為不育，溫度低于16 ℃時(shí)表現(xiàn)為完全可育。

1.2 育性轉(zhuǎn)換觀察

2014年3月花盆直播細(xì)胞質(zhì)雄性不育系09-R9、保持系09-24、溫敏核雄性不育系GS-19，每個(gè)材料播20盆。顯球后分別移入20 ℃(16 h光照/8 h黑暗)和15 ℃(16 h光照/8 h黑暗)的人工智能氣候箱中，開花期觀察統(tǒng)計(jì)育性情況，可育率為可育花朵占每株隨機(jī)抽取100朵花的百分?jǐn)?shù)，每株重復(fù)3次，取10盆的平均值。

1.3 花器特征觀察

在09-R9、09-24及GS-19的盛花期分別采摘不育株與可育株開花前3～4 d的花蕾和當(dāng)天完全開放的花各10朵，用游標(biāo)卡尺測(cè)量花蕾、花冠、花絲及花藥等花器各部分大小，進(jìn)行比較分析。

1.4 花藥發(fā)育的顯微結(jié)構(gòu)觀察研究

花藥發(fā)育過程的觀察采用常規(guī)石蠟切片技術(shù)。在盛花期，取可育(對(duì)照)和不育株不同大小花蕾(0.5，1，3，5和7 mm)迅速投入卡諾氏(Carnoy’s)液中固定24 h，然后轉(zhuǎn)到70%酒精4 ℃保存。制作石蠟切片時(shí)，依次使用50%, 70%, 85%, 95%, 100%各級(jí)乙醇液脫水各15 min；用二甲苯透明2次，每次30 min。浸蠟和石蠟包埋后，用Leica旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)切片，切片厚度4～5 μm。貼片后將載玻片投入二甲苯中脫蠟(3 min)，蘇木精染色后投入二甲苯中3 min至透明，加拿大樹膠封藏。制好的石蠟切片在OLYMPUS BX53顯微鏡下觀察并照相。

1.5 花藥發(fā)育的超微結(jié)構(gòu)觀察研究

在盛花期，取GS-19不育和可育株不同發(fā)育時(shí)期的花藥，在4 ℃冰箱中用體積分?jǐn)?shù)為2%戊二醛固定2 h，磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffered saline，簡(jiǎn)稱PBS)洗3次，每次10 min；再浸泡于體積分?jǐn)?shù)為1%餓酸溶液中，4 ℃下2 h左右；用體積分?jǐn)?shù)為10%，20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%的系列乙醇各脫水10 min，用Epon818樹脂包埋，超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色，制好的透射電鏡標(biāo)本在透射電鏡(EM100C JEOL Tokyo)下觀察。

“為美好生活加油”是中國(guó)石化的企業(yè)使命，中國(guó)石化青工委也積極踐行綠色低碳戰(zhàn)略，廣泛傳播綠色環(huán)保理念，倡導(dǎo)綠色生活方式，組織動(dòng)員青年開展“光盤行動(dòng)”、植綠護(hù)綠、綠色出行、垃圾分類等環(huán)保實(shí)踐，大力開展以綠色生產(chǎn)為主題的“青年文明號(hào)”“青年綠色生產(chǎn)示范崗”創(chuàng)建活動(dòng)，提升青年環(huán)保意識(shí)和環(huán)保技能，助力綠色企業(yè)創(chuàng)建。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果為3次重復(fù)的平均值，使用 Excel 2010 軟件整理統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)、計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差并繪制圖表，用 SPSS 18.0 軟件進(jìn)行方差分析和多重差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種花椰菜雄性不育系的育性轉(zhuǎn)換

圖1 不同溫度處理雄性不育系的育性分析Fig.1 Fertility analysis of male sterile line in different temperature 不同字母表示差異顯著(P<0.05),下同。The different letters mean significant difference at P<0.05.The same below.

由圖1可以看出，2個(gè)溫度處理后的細(xì)胞質(zhì)雄性不育系09-R9和溫敏核雄性不育系GS-19之間的育性變化存在差異。細(xì)胞質(zhì)不育系09-R9和保持系09-24的育性不受溫度影響，09-R9可育率為0，始終保持完全不育，其保持系09-24可育率為100%，育性完全正常。溫敏核雄性不育系GS-19在2個(gè)溫度條件下可育率發(fā)生了顯著的變化，在15 ℃條件下，可育率為100%， 20 ℃可育率為0，完全不育，說明育性轉(zhuǎn)換受溫度控制。

2.2 2種花椰菜雄性不育系的花器形態(tài)差異分析

由圖2和圖3可以看出， 2種花椰菜雄性不育系的花蕾和花藥大小之間差異顯著，溫敏核不育系GS-19不育株的花蕾和花藥顯著小于細(xì)胞質(zhì)不育系09-R9，花冠大小和花柱長(zhǎng)短無顯著差異，但是與其可育株之間差異顯著，花器顯著小于可育株。2種雄性不育系的不育株和可育株的花蕾大小、花冠開度及花藥大小都有明顯的差異，不育株花的各個(gè)組成部分明顯小于可育株。GS-19的花為白色，15 ℃條件下，開花前花蕾正常大小，開花后明顯看到柱頭和雄蕊，產(chǎn)生大量花粉；20 ℃條件下，開花前花蕾小于可育時(shí)期花蕾，開花后只能看到柱頭，看不到雄蕊，剝開花瓣后，發(fā)現(xiàn)雄蕊萎縮于雌蕊基部，花藥干癟，不能形成花粉。09-R9 的花為黃色，育性表現(xiàn)與溫度沒有關(guān)系，完全不育，開花前花蕾小于可育時(shí)期花蕾，開花后只能看到柱頭，看不到雄蕊，剝開花瓣后，發(fā)現(xiàn)雄蕊萎縮于雌蕊基部，花藥干癟，不能形成花粉粒；而保持系09-24正好相反，育性同樣不受溫度影響，育性完全正常，花的各部分組成完全正常。

圖2 花椰菜雄性不育花和花蕾的比較Fig.2 Flowers compare of male sterile line in cauliflower

2.3 花藥發(fā)育的顯微結(jié)構(gòu)觀察

2.3.1 保持系09-24花藥的發(fā)育過程 保持系09-24花藥發(fā)育早期(花蕾大小為0.5 mm)，花藥的4個(gè)角隅處分化和形成細(xì)胞質(zhì)濃厚，體積大的造孢細(xì)胞，花藥的橫切面呈四棱型。當(dāng)花蕾長(zhǎng)約 1.0 mm 時(shí)，花藥的角隅處分化形成清晰的藥室，絨氈層細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)濃厚，顏色明顯深于藥室內(nèi)壁和中層，造孢細(xì)胞分裂形成花粉母細(xì)胞，花粉母細(xì)胞進(jìn)行減數(shù)分裂，形成四分體，被絨氈層包圍，此時(shí)花藥橫切面呈蝴蝶形(圖4A)，隨著絨氈層細(xì)胞開始解體向內(nèi)收縮，四分體孢子從中釋放出來，剛分離出來的小孢子外形不規(guī)則，但很快變成圓形或近圓形，成為單核花粉粒 (圖4B)。在即將成熟花藥中，單核花粉粒進(jìn)行核分裂，形成成熟花粉粒，花粉粒呈圓形，且染色很深(圖4C)。

圖3 花椰菜雄性不育系的花器形態(tài)比較Fig.3 Flowers of the male sterile line in cauliflower 上Top：花蕾Flower bud；中Middle：花Flower；下Bottom：雄蕊Stamen.

圖4 保持系09-24的花藥發(fā)育顯微結(jié)構(gòu)Fig.4 Micrographs of anther development of the 09-24 A：四分體時(shí)期的花藥(75×) Anther of tetrad (75×)；B：?jiǎn)魏嘶ǚ哿Ｆ诨ㄋ?150×) Anther of mononuclear pollen (150×)；C：花粉粒成熟期花藥(600×) Anther of mature pollen (600×).

2.3.3 溫敏核雄性不育系GS-19花藥發(fā)育特性 在低溫下(15 ℃)，GS-19花藥發(fā)育完全正常，發(fā)育早期呈四棱形，由孢原細(xì)胞經(jīng)過平周分裂形成造孢細(xì)胞和生周緣細(xì)胞。當(dāng)花蕾長(zhǎng)約 1.0 mm 時(shí)，花藥進(jìn)一步分化出4個(gè)藥室，藥室的壁層已分化完全，藥室內(nèi)的細(xì)胞染色均勻。花粉母細(xì)胞能進(jìn)行正常減數(shù)分裂，形成大量的四分體，且四分體的細(xì)胞質(zhì)濃，染色深(圖6A)。四分體孢子從中釋放出來，剛分離出來的小孢子外形不規(guī)則，但很快變成圓形或近圓形，成為單核花粉粒，在此發(fā)育過程中，絨氈層細(xì)胞逐漸向內(nèi)收縮 (圖6B)，在即將成熟花藥中，絨氈層逐步解體，細(xì)胞體積逐漸增大，進(jìn)行核分裂，形成成熟花粉粒，花粉粒呈圓形，且染色很深(圖6C)。

在高溫(20 ℃)條件下，GS-19花藥發(fā)育受阻，完全不育?；ㄋ幇l(fā)育早期，和低溫條件下一樣，分裂能力較強(qiáng)的胞原細(xì)胞經(jīng)過分裂形成正常的造孢細(xì)胞，該時(shí)期的雄蕊也呈四棱形。造孢細(xì)胞進(jìn)一步分化出4個(gè)藥室，藥室的壁層已分化完全，藥室內(nèi)的細(xì)胞染色較淺，藥室形狀不規(guī)則。花粉母細(xì)胞雖然也能進(jìn)行正常減數(shù)分裂，形成四分體，但是四分體的細(xì)胞質(zhì)不濃，染色淺(圖7A)。染色較淺的四分體為圓形或近圓形，只有個(gè)別能形成單核花粉粒，在此發(fā)育過程中，絨氈層細(xì)胞逐漸向內(nèi)收縮 (圖7B)。形成的少量單核花粉粒不能進(jìn)一步發(fā)育形成成熟花粉粒，絨氈層未解體，只留下一個(gè)空的花粉囊，花粉囊壁出現(xiàn)加厚的現(xiàn)象(圖7C)。

圖5 花椰菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系09-R9的花藥發(fā)育顯微結(jié)構(gòu)Fig.5 Micrographs of anther development of the 09-R9 A：四分體時(shí)期的花藥(75×) Anther of tetrad (75×)； B：?jiǎn)魏嘶ǚ哿Ｆ诨ㄋ?150×) Anther of mononuclear pollen (150×)；C：花粉粒成熟期花藥(600×) Anther of mature pollen (600×).

圖6 低溫條件下GS-19的花藥發(fā)育顯微結(jié)構(gòu)Fig.6 Micrographs of anther development of the GS-19 in low temperature (15 ℃) A：四分體時(shí)期的花藥(75×) Anther of tetrad (75×)；B：?jiǎn)魏嘶ǚ哿Ｆ诨ㄋ?150×) Anther of mononuclear pollen (150×)；C：花粉粒成熟期花藥(600×) Anther of mature pollen (600×).

圖7 高溫條件下GS-19不育株的花藥發(fā)育顯微結(jié)構(gòu)Fig.7 Micrographs of anther development of the GS-19 in high temperature (20 ℃) A：四分體時(shí)期的花藥(75×) Anther of tetrad (75×)；B：?jiǎn)魏嘶ǚ哿Ｆ诨ㄋ?150×) Anther of mononuclear pollen (150×)； C：花粉粒成熟期花藥(600×) Anther of mature pollen (600×).

2.4 花藥發(fā)育的超微結(jié)構(gòu)觀察

2.4.1 保持系09-24花藥的發(fā)育過程 保持系09-24花藥發(fā)育的初期，造孢細(xì)胞呈多邊形,核大質(zhì)體多,從外圍形成液泡,并有胼胝質(zhì)壁包裹，絨氈層發(fā)達(dá)，部分細(xì)胞有雙核仁，無壁由膜包裹，呈分泌細(xì)胞狀態(tài)，內(nèi)含物分解后呈點(diǎn)狀分布在膜上，再從膜上逐漸釋放出供孢子發(fā)育(圖8A)。到四分體時(shí)期，四分孢子被共同的胼胝質(zhì)包圍，壁外側(cè)出現(xiàn)了一層有缺口的電子致密帶，其上沉積了大量的黑色箭狀物質(zhì)。四分孢子中細(xì)胞器含量豐富，質(zhì)體高度發(fā)育，絨氈層胞質(zhì)進(jìn)一步濃縮成一團(tuán)，著色很深 (圖8B)，四分體孢子分裂形成正常的單核花粉粒。小孢子發(fā)育后期，中央大液泡逐漸變小至消失，細(xì)胞內(nèi)含物逐漸增多至布滿整個(gè)細(xì)胞，小孢子經(jīng)過不對(duì)稱有絲分裂形成成熟花粉粒，花粉粒細(xì)胞的內(nèi)壁物質(zhì)在局部向內(nèi)側(cè)擴(kuò)展并顯著增厚，絨氈層細(xì)胞消失，成熟花粉粒呈圓形(圖8C)。

圖8 09-24的花藥發(fā)育超微結(jié)構(gòu)Fig.8 Ultrastructure of anther development of the 09-24 A：花粉母細(xì)胞形成期Pollen mother cell formation；B：?jiǎn)魏嘶ǚ哿Ｆ贛ononuclear pollen；C：花粉粒成熟期Mature pollen；Ep：外表皮Epidermis；En：藥室內(nèi)壁Endothecium；MMC：花粉母細(xì)胞Pollen mother cell；T：絨氈層Tapetum；Msp：小孢子Microspore;PG：成熟花粉粒Mature pollen grain.

2.4.2 細(xì)胞質(zhì)雄性不育系09-R9花藥敗育的細(xì)胞學(xué)觀察 細(xì)胞質(zhì)雄性不育系09-R9花藥發(fā)育初期和保持系09-24一致，造孢細(xì)胞呈多邊形，核大質(zhì)體多，從外圍形成液泡，并有胼胝質(zhì)壁包裹，絨氈層發(fā)達(dá)，部分細(xì)胞有雙核仁，無壁由膜包裹，呈分泌細(xì)胞狀態(tài)，內(nèi)含物分解呈點(diǎn)狀分布在膜上，再從膜上逐漸釋放出供孢子發(fā)育(圖9A)。隨著花藥的發(fā)育，四分孢子形成后也被共同的胼胝質(zhì)包圍，壁外側(cè)也見有一層帶缺口的電子致密帶，但其上沉積了大量茸毛狀物質(zhì)。四分孢子分裂形成的單核花粉粒中細(xì)胞器較可育少，但液泡明顯比可育多(圖9B)?；ǚ哿Ｐ纬蛇^程中，小孢子細(xì)胞愈發(fā)皺縮，內(nèi)含物消失，不能形成正常的花粉粒(圖9C)。

圖9 09-R9的花藥發(fā)育超微結(jié)構(gòu)Fig.9 Ultrastructure of anther development of the 09-R9 A：花粉母細(xì)胞形成期Pollen mother cell formation；B：?jiǎn)魏嘶ǚ哿Ｆ贛ononuclear pollen；C：花粉粒成熟期Mature pollen；Ep：外表皮Epidermis；En：藥室內(nèi)壁Endothecium；MMC：花粉母細(xì)胞Pollen mother cell；T：絨氈層Tapetum；Msp：小孢子Microspore;PG：成熟花粉粒Mature pollen grain.

2.4.3 溫敏核雄性不育系GS-19花藥發(fā)育特性 在低溫條件下(15 ℃)，GS-19花藥發(fā)育完全正常?；ㄋ幇l(fā)育初期，雄蕊原基分化為4層，從外到內(nèi)依次是表皮、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層。絨氈層細(xì)胞呈長(zhǎng)方形，排列整齊，核大，核仁染色明顯，有的細(xì)胞含有兩個(gè)或多個(gè)核?；ǚ勰讣?xì)胞的形態(tài)與周圍的藥壁細(xì)胞明顯不同,細(xì)胞排列整齊而有序,細(xì)胞壁形狀規(guī)則,細(xì)胞核大,核仁染色明顯,沒有明顯的液泡(圖10A)。隨著小孢子發(fā)育，四分孢子被共同的胼胝質(zhì)包圍，外側(cè)出現(xiàn)了一層有缺口的電子致密帶，其上沉積了大量的黑色箭狀物質(zhì)。四分孢子分裂形成單核花粉粒，單核花粉粒中細(xì)胞器含量豐富，染色深，質(zhì)體內(nèi)部明顯可見一些電子密度較高的物質(zhì)，絨氈層胞質(zhì)進(jìn)一步濃縮成一團(tuán)，著色很深，出現(xiàn)個(gè)別“空腔”現(xiàn)象(圖10B)。小孢子進(jìn)一步發(fā)育，中央大液泡逐漸變小至消失，細(xì)胞內(nèi)含物逐漸增多至布滿整個(gè)細(xì)胞，小孢子經(jīng)過不對(duì)稱有絲分裂形成成熟花粉粒，花粉粒細(xì)胞的內(nèi)壁物質(zhì)在局部向內(nèi)側(cè)擴(kuò)展并顯著增厚，萌發(fā)孔形成，絨氈層細(xì)胞愈加降解至基本消失，花粉粒呈圓形(圖10C)。

在高溫(20 ℃)條件下，GS-19花藥發(fā)育受阻，完全不育?；ㄋ幇l(fā)育早期，和低溫條件下一樣，雄蕊原基已分化出4層,從外到內(nèi)依次是表皮、藥室內(nèi)壁、中層和絨氈層。絨氈層細(xì)胞呈長(zhǎng)方形，排列整齊，核大，核仁染色明顯?；ǚ勰讣?xì)胞的形態(tài)與周圍的藥壁細(xì)胞明顯不同，細(xì)胞排列整齊而有序，細(xì)胞壁形狀規(guī)則，細(xì)胞核大，核仁染色明顯，沒有明顯的液泡(圖11A)。隨著花藥的進(jìn)一步發(fā)育，四分體孢子形成后也被共同的胼胝質(zhì)包圍，壁外側(cè)也見有一層帶缺口的電子致密帶，但其上沉積了大量茸毛狀物質(zhì)。四分孢子分裂形成單核花粉粒，單核花粉粒中細(xì)胞器較可育少，但液泡明顯比可育多，可見液泡吞噬現(xiàn)象，絨氈層未解體(圖11B)。開花前，絨氈層完全解體，形成的花粉粒內(nèi)含物消失，只剩下壁外側(cè)有一層帶缺口的電子致密帶，不能形成正常的花粉粒(圖11C)。

圖10 低溫條件下GS-19的花藥發(fā)育超微結(jié)構(gòu)Fig.10 Ultrastructure of anther development of the GS-19 in low temperature (15 ℃) A：花粉母細(xì)胞形成期Pollen mother cell formation；B：?jiǎn)魏嘶ǚ哿Ｆ贛ononuclear pollen；C：花粉粒成熟期Mature pollen；Ep：外表皮Epidermis；En：藥室內(nèi)壁Endothecium；MMC：花粉母細(xì)胞Pollen mother cell；T：絨氈層Tapetum；Msp：小孢子Microspore;PG：成熟花粉粒Mature pollen grain.

圖11 高溫條件下GS-19花藥發(fā)育超微結(jié)構(gòu)Fig.11 Ultrastructure of anther development of the GS-19 in high temperature (20 ℃) A：花粉母細(xì)胞形成期Pollen mother cell formation；B：?jiǎn)魏嘶ǚ哿Ｆ贛ononuclear pollen；C：花粉粒成熟期Mature pollen；Ep：外表皮Epidermis；En：藥室內(nèi)壁Endothecium；MMC：花粉母細(xì)胞Pollen mother cell；T：絨氈層Tapetum；Msp：小孢子Microspore;PG：成熟花粉粒Mature pollen grain.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)花椰菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系09-R9的育性不受溫度的影響，始終都保持不育的特性；而溫敏核雄性不育系GS-19的育性受溫度控制，高溫(20 ℃)條件下表現(xiàn)為不育，低溫(15 ℃)條件下育性恢復(fù)。這一結(jié)果與甘藍(lán)型油菜溫敏核不育系SP2S[13]和TE5A[14]、細(xì)胞質(zhì)雄性不育系392A[12]的育性轉(zhuǎn)換結(jié)果一致，都表現(xiàn)為高溫不育、低溫育性恢復(fù)。但油菜溫敏核雄性不育系Hui you50S的育性轉(zhuǎn)換研究結(jié)果表現(xiàn)出低溫不育、高溫可育的現(xiàn)象[19]。為進(jìn)一步對(duì)溫敏核雄性不育系GS-19利用，在制種過程中要注意溫度條件，避免影響種子的純度。

花器形態(tài)特征是雄性不育和可育區(qū)別的直接表型，研究表明雄性不育的花明顯小于可育株，不育花器形態(tài)有花冠退化型、雄蕊萎縮型、花粉敗育型3種[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)雄性不育系09-R9和高溫下溫敏核不育系GS-19的花顯著小于保持系09-24和低溫下溫敏核不育系GS-19，尤其是花的發(fā)育后期，2種不育株的雄蕊萎縮于雌蕊基部，柱頭外露，花期看不到雄蕊，花藥干癟，不能形成花粉，屬于前人研究中的雄蕊萎縮型。童旭宏等[22]觀察了陸地棉(Gossypiumhirsutum)的G22A，H109A和1793A三個(gè)不育系均表現(xiàn)花瓣小，花絲短，柱頭明顯外露，敗育徹底，無花粉；張?bào)w德等[23]發(fā)現(xiàn)芝麻(Sesamumindicum)細(xì)胞核雄性不育系ms86-1的花器也是不育株小于可育株，本研究結(jié)果與此完全相同。

隨著花椰菜不同雄性不育系的發(fā)現(xiàn)，花藥發(fā)育的細(xì)胞學(xué)研究也顯得非常重要。目前，雄性不育敗育研究主要集中在油菜、小麥、水稻等大田作物中，主要有無花粉囊型、花粉母細(xì)胞敗育型和單核敗育型3種。本研究發(fā)現(xiàn)，在花蕾發(fā)育早期(≤1 mm)時(shí)，育性正常的保持系09-24和低溫條件下的溫敏核雄性不育系GS-19處于孢原時(shí)期和造孢時(shí)期，能分化形成造孢細(xì)胞和壁細(xì)胞，該時(shí)期細(xì)胞質(zhì)雄性不育系09-R9和高溫條件下的GS-19的花藥發(fā)育也正常。隨著花蕾的繼續(xù)發(fā)育(>1 mm)，細(xì)胞質(zhì)雄性不育系09-R9在花粉母細(xì)胞早期，細(xì)胞質(zhì)開始濃縮解體，大部分不能進(jìn)行減數(shù)分裂，只能形成少量染色較淺的四分體，花粉囊也逐步解體，無花粉粒形成，屬于無花粉囊敗育類型，已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)的典型無花粉囊型油菜不育系有533S[24]、宜3A[25]、212A[26]、Shaan-GMS[27]、9012[28]、BnaC.Tic40[29]、BnMs3[30]等。高溫條件下溫敏核雄性不育系GS-19的花粉母細(xì)胞雖然也能進(jìn)行正常減數(shù)分裂，形成四分體，但是四分體的細(xì)胞質(zhì)不濃，染色淺，只有個(gè)別能形成單核花粉粒，屬于花粉母細(xì)胞敗育類型，與溫敏核不育系小麥 BNS[11]和BNS366[31]、甘藍(lán) Ogura CMS[32]的敗育類型一致，此外，在水稻[30]、小麥[33]、高粱(Sorghumbicolor)[34]、大豆(Glycinemax)[35]、紅菜薹(Brassicacompestrisvar.purpurea)[36]等農(nóng)作物的雄性不育系也是因?yàn)闇p數(shù)分裂過程出現(xiàn)問題，導(dǎo)致花粉母細(xì)胞不能形成四分體，本試驗(yàn)結(jié)果與此一致。也存在一些其他的溫敏核雄性不育水稻、小麥、甘藍(lán)型油菜的花藥發(fā)育的敗育類型屬于單核敗育型[9,19,37]，也進(jìn)一步證實(shí)了余鳳群等[38]關(guān)于細(xì)胞核雄性不育系屬花粉母細(xì)胞敗育型的結(jié)論。

我國(guó)雖然是世界上花椰菜種植面積最大的國(guó)家，但對(duì)花椰菜的利用僅限于食用花球，導(dǎo)致大量莖葉均被拋棄，造成了嚴(yán)重的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。因此，本研究通過對(duì)菜飼兼用型花椰菜溫敏核雄性不育系的研究，培育出花球性狀優(yōu)良，葉片生長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)的花椰菜新品種，既保障了我國(guó)高原夏菜產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展，又可以推動(dòng)畜牧業(yè)的發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了花椰菜綜合利用，對(duì)我國(guó)大部分農(nóng)村正處于由傳統(tǒng)農(nóng)耕模式向“種草養(yǎng)畜”模式的轉(zhuǎn)型過程中存在飼料來源嚴(yán)重缺乏等問題解決具有重要的研究意義。

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Flower and anther characteristics of two male sterile lines of cauliflower, a dual-purpose vegetable and forage crop

TAO Xing-Lin1,2,3, XIE Zhi-Jun2,3, ZHU Hui-Xia2,3, LIU Ming-Xia2,3, ZHANG Jin-Wen1*, HU Li-Min2,3

1.GansuKeyLabofCropImprovement&GermplasmEnhancement,GansuAgriculturalUniversity,Lanzhou730070,China； 2.InstituteofVegetable,GansuAcademyofAgriculturalScience,Lanzhou730070,China； 3.LanzhouResearchStationofHorticulturalCropBiologyandGermplasmEnhancement,Lanzhou730070,China

The aim of this study was to analyze the morphological characteristics and cytological characteristics of anther development in two male sterile lines of cauliflower (Brassicaoleraceavar.botrytis). The cauliflower cytoplasmic male sterile line 09-R9, the maintainer line 09-24, and the temperature-sensitive genetic male sterile line GS-19 were used as the test materials, and morphological and cytological techniques were used to study anther development. There were differences between the two male sterile lines in fertility transition, flower morphology, and anther development. The three lines showed variations in fertility under different temperature treatments. The sterility of 09-R9 and 09-24 was not affected by temperature; 09-R9 was always sterile, and 09-24 was completely fertile. GS-19 was affected by temperature, and was sterile at high temperature (20 ℃) but fertile at a lower temperature (15 ℃). The buds and anthers were smaller in GS-19 than in 09-R9. Sterile plants differed from fertile plants, and there were significantly fewer flowers on sterile plants than on fertile plants. Microstructural observations showed that the anthers abortive stages and types differed between the two male sterile lines. 09-R9 formed a normal-shaped pollen sac at the early anther stage, but the materials within pollen sacs gradually disintegrated as buds developed, and the pollen sacs finally disappeared. The development of anthers was blocked before the formation of the pollen mother cell, so this line showed an abortive-type sterility without pollen sacs. The anther development of GS-19 showed differentiation of the pollen mother cell and normal pollen sac formation, but this line produced very small amounts of non-viable pollen and no viable pollen. In this line, the pollen mother cells did not undergo meiosis to form tetrads, but formed pseudo microspores with abnormal pollen exines. As the anthers developed, the pseudo microspores gradually decayed until only the empty shells remained. The anther development of GS-19 was blocked between the pollen mother cell stage and the tetrad stage, and so it was an abortive-type sterility of the pollen mother cell. These ultrastructural observations revealed the similarities and differences in anther abortion between the male sterile lines 09-R9 and GS-19 under high-temperature conditions.

cauliflower (Brassicaoleraceavar.botrytis); male sterility line; flower characteristics; anther development; cytology

10.11686/cyxb2016439

http://cyxb.lzu.edu.cn

2016-11-22；改回日期：2017-03-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31460519)，農(nóng)業(yè)部園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制西北地區(qū)科學(xué)觀測(cè)試驗(yàn)站項(xiàng)目(2015-A2621-620321-G1203-066)和甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程學(xué)科團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2014GAAS07)資助。

陶興林(1977-)，男，甘肅華池人，副研究員，在讀博士。 E-mail：taoxinglin77@126.com*通信作者Corresponding author. E-mail: jwzhang305@163.com

陶興林, 謝志軍, 朱惠霞, 劉明霞, 張金文, 胡立敏. 花椰菜2種雄性不育系花器特征及花藥發(fā)育的細(xì)胞學(xué)研究. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(5): 144-154.

TAO Xing-Lin, XIE Zhi-Jun, ZHU Hui-Xia, LIU Ming-Xia, ZHANG Jin-Wen, HU Li-Min. Flower and anther characteristics of two male sterile lines of cauliflower, a dual-purpose vegetable and forage crop. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(5): 144-154.