王小杰，劉美曉，謝云鵬，毛曉霞，孫一嬋，陳志宏

·論著·

絲膠蛋白對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)胰島細(xì)胞株INS-1凋亡相關(guān)因子的影響研究

王小杰1，劉美曉1，謝云鵬2，毛曉霞3，孫一嬋1，陳志宏4*

目的 探討絲膠蛋白對鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)胰島細(xì)胞株INS-1凋亡相關(guān)因子B淋巴細(xì)胞瘤2(Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)的影響。方法 2015年6月—2016年3月，將大鼠胰島細(xì)胞株INS-1分為3組：正常組胰島細(xì)胞株INS-1不作任何處理，STZ組以STZ作用胰島細(xì)胞株INS-1，絲膠蛋白組以STZ和絲膠蛋白作用胰島細(xì)胞株INS-1。CCK-8法檢測各組細(xì)胞存活率；流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率；實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)法和Western blotting法檢測凋亡相關(guān)因子Bcl-2和Bax mRNA表達(dá)及其蛋白的表達(dá)。結(jié)果 STZ組胰島細(xì)胞株INS-1細(xì)胞存活率較正常組降低，絲膠蛋白組胰島細(xì)胞株INS-1細(xì)胞存活率較STZ組升高(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示， STZ組胰島細(xì)胞株INS-1細(xì)胞凋亡率較正常組升高，絲膠蛋白組胰島細(xì)胞株INS-1細(xì)胞凋亡率較STZ組降低(P<0.05)。STZ組胰島細(xì)胞株INS-1 Bcl-2 mRNA及其蛋白表達(dá)水平、Bcl-2 mRNA/Bax mRNA、Bcl-2/Bax較正常組降低，Bax mRNA及其蛋白表達(dá)水平較正常組升高(P<0.05)；絲膠蛋白組胰島細(xì)胞株INS-1 Bcl-2 mRNA及其蛋白表達(dá)水平、Bcl-2 mRNA/Bax mRNA、Bcl-2/Bax較STZ組升高，Bax mRNA及其蛋白表達(dá)水平較STZ組降低(P<0.05)。結(jié)論 絲膠蛋白可抑制STZ誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞株INS-1的凋亡，提高Bcl-2/Bax的比值。

絲膠蛋白質(zhì)類；鏈脲菌素；凋亡誘導(dǎo)因子；基因,Bcl-2；Bcl-2相關(guān)X蛋白質(zhì)

王小杰，劉美曉，謝云鵬，等.絲膠蛋白對鏈脲佐菌素誘導(dǎo)胰島細(xì)胞株INS-1凋亡相關(guān)因子的影響研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2017，20(14)：1697-1701.[www.chinagp.net]

WANG X J,LIU M X,XIE Y P,et al.Effect of sericin on apoptosis related factors in streptozotocin-induced INS-1 cells[J].Chinese General Practice，2017，20(14)：1697-1701.

有研究者預(yù)測，到2030年，全球糖尿病患者人數(shù)將增加至5.25億，其中90%的患者為2型糖尿病[1]，2型糖尿病嚴(yán)重影響著人類的健康并且已經(jīng)成為公共衛(wèi)生系統(tǒng)的沉重負(fù)擔(dān)[2]。有研究表明，2型糖尿病時細(xì)胞凋亡是造成胰島β細(xì)胞功能受損的重要原因，胰島β細(xì)胞凋亡可造成胰島結(jié)構(gòu)的破壞和功能降低，最終引起血糖控制上的惡化[3]。傳統(tǒng)西醫(yī)療法單一且不良反應(yīng)大，而中藥治療糖尿病因其不良反應(yīng)小在近年來備受關(guān)注。絲膠蛋白(sericin)是彩色蠶繭中的水溶性蛋白，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，絲膠水提物(主要成分是絲膠蛋白)能有效降低2型糖尿病大鼠的血糖水平[4]。而絲膠蛋白的降糖作用是否是通過保護(hù)胰島β細(xì)胞而實現(xiàn)的呢？為進(jìn)一步探討絲膠蛋白降低血糖的作用機(jī)制，本研究以鏈脲佐菌素(streptozocin，STZ)誘導(dǎo)胰島細(xì)胞株INS-1損傷，觀察絲膠蛋白對胰島細(xì)胞株INS-1凋亡相關(guān)因子B淋巴細(xì)胞瘤2(Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 2015年6月—2016年3月，大鼠胰島細(xì)胞株INS-1購于賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司；STZ購于美國Sigma公司；細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒(CCK-8)購于日本DOJINDO公司；細(xì)胞凋亡試劑盒、膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)/碘化丙啶(PI)購于美國BD公司；Trizol購于美國Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)試劑盒購于日本TaKaRa公司；小鼠抗大鼠Bcl-2和Bax單克隆抗體購于美國Abcam公司；二抗〔辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG〕購于美國KPL公司。絲膠蛋白由彩色蠶繭(由承德醫(yī)學(xué)院蠶業(yè)研究所提供)中提取，冷凍干燥成粉末備用，使用時用0.9%氯化鈉溶液溶解至所需濃度。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 大鼠胰島細(xì)胞株INS-1在37 ℃、5%CO2條件下，置于含10%胎牛血清、50 μmol/L β-巰基乙醇的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。分為3組：正常組、STZ組和絲膠蛋白組，其中正常組胰島細(xì)胞株INS-1不作任何處理；STZ組以10 mmol/L STZ作用胰島細(xì)胞株INS-1 24 h；絲膠蛋白組以10 mmol/L STZ和300 μg/ml絲膠蛋白作用胰島細(xì)胞株INS-1 24 h。

本研究背景：

目前，糖尿病已經(jīng)成為繼心血管疾病和腫瘤之后的第三大非傳染性疾病，在全球糖尿病患者中，90%以上屬于2型糖尿病。2型糖尿病主要以血糖水平升高、胰島素抵抗以及胰島β細(xì)胞功能受損等為主要特征。如何降低血糖水平，保護(hù)胰島，促進(jìn)胰島β細(xì)胞分泌胰島素是治療2型糖尿病的關(guān)鍵。當(dāng)前治療糖尿病的方法總體上以藥物治療為主。各類藥物雖能較好地控制血糖水平，但大多數(shù)藥物均有不同程度的不良反應(yīng)，有相當(dāng)一部分患者早期就出現(xiàn)肝腎功能損害，在短時間內(nèi)失去正常生活能力。在糖尿病治療方面，人們期望治療糖尿病的藥物有以下特點(diǎn)：安全無不良反應(yīng)，服用方便，療效顯著。因此，近年來國內(nèi)外研究者將目光轉(zhuǎn)向了具有降糖作用的天然物質(zhì)。絲膠蛋白是從蠶繭中提取的天然蛋白質(zhì)，為高分子水溶性蛋白，由18種氨基酸組成，具有生物相容性，可生物降解，對人體無毒性，可避免化學(xué)合成藥物帶給人體的不良反應(yīng)。本課題組前期研究采用鏈脲佐菌素(STZ)制備2型糖尿病大鼠模型，發(fā)現(xiàn)絲膠水提物可有效降低血糖、調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂、保護(hù)胰島β細(xì)胞、海馬、性腺及腎臟，并且絲膠水提物預(yù)處理亦有類似的作用。但絲膠水提物降低血糖、保護(hù)胰島β細(xì)胞的機(jī)制尚需進(jìn)一步的深入研究。為進(jìn)一步探討絲膠蛋白降低血糖的作用機(jī)制，本研究以STZ誘導(dǎo)大鼠胰島細(xì)胞株INS-1損傷，觀察絲膠蛋白對胰島細(xì)胞株INS-1凋亡相關(guān)因子B淋巴細(xì)胞瘤2(Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探討絲膠蛋白治療糖尿病的分子機(jī)制奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1.2.2 CCK-8法檢測各組細(xì)胞存活率 取3組對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板，5×103個/孔，每組設(shè)5個復(fù)孔，分別設(shè)空白組(只加培養(yǎng)基不加細(xì)胞)、正常組、藥物組(STZ組和絲膠蛋白組)。每孔加入5 mg/ml CCK-8，培養(yǎng)2 h，于酶標(biāo)儀450 nm波長處測定吸光度值(A值)，取平均值，計算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(藥物組A值-空白組A值)/(正常組A值-空白組A值)×100%。實驗重復(fù)4次，取平均值。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率 各組細(xì)胞用不含乙二胺四乙酸(EDTA)的胰酶消化后，每管取1×106個細(xì)胞，預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，將細(xì)胞重懸于500 μl Binding Buffer中，加入5 μl Annexin Ⅴ/PI，柔和混勻，避光孵育5 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.4 RT-PCR法檢測Bcl-2、Bax mRNA的表達(dá) Trizol法提取各組細(xì)胞總RNA，以1 μg RNA為模板反轉(zhuǎn)錄為cDNA，分別對目的基因Bcl-2、Bax和內(nèi)參基因β-actin進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。Bcl-2上游引物：5′-GACTGAGTACCTGAACCGGCATC-3′，下游引物：5′-CTGAGCAGCGTCTTCAGAGACA-3′，長度135 bp；Bax上游引物：5′- AGACACCTGAGCTGACCTTGGA-3′ ，下游引物：5′-TTGAAGTTGCCATCAGCAAACA-3′，長度196 bp；β-actin上游引物：5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′， 下游引物：5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′，長度186 bp。RT-PCR采用SYBR GreenⅠ法，于Agilent Mx3000P USA上檢測熒光超過背景熒光時的循環(huán)數(shù)定義為循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct值)。使用SYBR Premix Ex TaqTM試劑(日本TaKaRa 公司)進(jìn)行RT-PCR。反應(yīng)體系20 μl：2×SYBR Premix Ex TaqTM10 μl，50×ROX Reference Dye 0.4 μl，cDNA 2 μl，滅菌蒸餾水6 μl，10 μmol/L上游引物及下游引物各0.8 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循環(huán)40次，分析熔解曲線。反應(yīng)結(jié)束后Setup MxPro v4.10系統(tǒng)會自動出現(xiàn)Ct值，按照2-ΔΔCt法計算基因的相對量。實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.2.5 Western blotting法檢測Bcl-2和Bax的表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，蛋白變性后每孔加樣30 μg，12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，穩(wěn)壓電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗(Bcl-2、Bax、β-actin：1∶1 000)孵育2 h，二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，ECL發(fā)光，膠片感光。膠片掃描后，應(yīng)用Quntity One 4.6.2軟件測量條帶的灰度值，以Bcl-2、Bax條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值，作為Bcl-2、Bax的相對表達(dá)水平。實驗重復(fù)3次，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 絲膠蛋白對胰島細(xì)胞株INS-1細(xì)胞存活率的影響 3組胰島細(xì)胞株INS-1細(xì)胞存活率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中STZ組胰島細(xì)胞株INS-1細(xì)胞存活率較正常組降低，絲膠蛋白組胰島細(xì)胞株INS-1細(xì)胞存活率較STZ組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

表1 3組胰島細(xì)胞株INS-1細(xì)胞存活率比較

注：STZ=鏈脲佐菌素；與正常組比較，aP<0.05；與STZ組比較，bP<0.05

2.2 絲膠蛋白對胰島細(xì)胞株INS-1細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，3組胰島細(xì)胞株INS-1細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中STZ組胰島細(xì)胞株INS-1細(xì)胞凋亡率較正常組升高，絲膠蛋白組胰島細(xì)胞株INS-1細(xì)胞凋亡率較STZ組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表2、圖1)。

表2 3組胰島細(xì)胞株INS-1細(xì)胞凋亡率比較

注：與正常組比較，aP<0.05；與STZ組比較，bP<0.05

2.3 絲膠蛋白對胰島細(xì)胞株INS-1 Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響 3組胰島細(xì)胞株INS-1 Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)水平、Bcl-2 mRNA/Bax mRNA比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中STZ組胰島細(xì)胞株INS-1 Bcl-2 mRNA表達(dá)水平、Bcl-2 mRNA/Bax mRNA較正常組降低，Bax mRNA表達(dá)水平較正常組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；絲膠蛋白組胰島細(xì)胞株INS-1 Bcl-2 mRNA表達(dá)水平、Bcl-2 mRNA/Bax mRNA較STZ組升高，Bax mRNA表達(dá)水平較STZ組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

注：PI=碘化丙啶，STZ=鏈脲佐菌素

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測3組胰島細(xì)胞株INS-1細(xì)胞凋亡率

Figure 1 Apoptosis rate of INS-1 cells in three groups measured by flow cytometry

Table3ComparisonofBcl-2andBaxmRNAexpressionlevelsinINS-1cellsamongthreegroups

組別Bcl-2mRNABaxmRNABcl-2mRNA/BaxmRNA正常組1.001.001.00STZ組0.84±0.08a2.33±0.32a0.36±0.02a絲膠蛋白組0.92±0.03b1.10±0.11b0.85±0.11bF值6.70842.97578.236P值<0.05<0.01<0.01

注：Bcl-2=B淋巴細(xì)胞瘤2，Bax=Bcl-2相關(guān)X蛋白；與正常組比較，aP<0.05；與STZ組比較，bP<0.05

Table4ComparisonofBcl-2andBaxexpressionlevelsinINS-1cellsamongthreegroups

組別Bcl-2BaxBcl-2/Bax正常組0.070±0.0120.344±0.0062.020±0.009STZ組0.038±0.007a0.712±0.023a0.534±0.017a絲膠蛋白組0.527±0.012b0.377±0.021b1.402±0.110bF值1333.925379.975403.340P值<0.01<0.01<0.01

注：與正常組比較，aP<0.05；與STZ組比較，bP<0.05

2.4 絲膠蛋白對胰島細(xì)胞株INS-1 Bcl-2、Bax表達(dá)的影響 3組胰島細(xì)胞株INS-1 Bcl-2、Bax表達(dá)水平、Bcl-2/Bax比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；其中STZ組胰島細(xì)胞株INS-1 Bcl-2表達(dá)水平、Bcl-2/Bax較正常組降低，Bax表達(dá)水平較正常組升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；絲膠蛋白組胰島細(xì)胞株INS-1 Bcl-2表達(dá)水平、Bcl-2/Bax較STZ組升高，Bax表達(dá)水平較STZ組降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表4、圖2)。

注：Bcl-2=B淋巴細(xì)胞瘤2，Bax=Bcl-2相關(guān)X蛋白

圖2 Western blotting法檢測3組胰島細(xì)胞株INS-1 Bcl-2、Bax表達(dá)

Figure 2 Expressions of Bcl-2 and Bax in INS-1 cells in three groups detected by Western blotting

3 討論

除胰島素抵抗之外，胰島β細(xì)胞功能減退甚至缺陷是2型糖尿病另一個重要發(fā)病機(jī)制[5]，而胰島β細(xì)胞凋亡增加則是胰島功能減退的基礎(chǔ)[6]。因此，保護(hù)胰島β細(xì)胞、針對胰島β細(xì)胞功能減退是2型糖尿病治療的關(guān)鍵。糖尿病的治療目前沒有特效藥物，西醫(yī)主要通過口服降糖藥物或皮下注射胰島素治療糖尿病，以及輔以飲食控制、適量運(yùn)動，不良反應(yīng)時有出現(xiàn)[7]。而中藥具有多靶點(diǎn)整體調(diào)節(jié)優(yōu)勢，能夠有效緩解糖尿病癥狀，糾正糖代謝紊亂，且不良反應(yīng)小[8]。絲膠蛋白是從天然彩色蠶繭中提取的水溶性球蛋白，由18種氨基酸組成[9]，具有生物相溶性，可生物降解，對人體無毒性，可避免化學(xué)合成藥物帶給人體的不良反應(yīng)。本課題組前期以STZ腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型，并給予絲膠水提物(主要成分為絲膠蛋白)灌胃，發(fā)現(xiàn)絲膠水提物可明顯降低2型糖尿病模型大鼠的血糖水平[4]；另外，絲膠蛋白還可通過調(diào)節(jié)GH/IGF-1軸改善2型糖尿病大鼠的生殖功能[10]以及通過上調(diào)神經(jīng)微絲蛋白、下調(diào)神經(jīng)肽Y保護(hù)2型糖尿病所致的坐骨神經(jīng)和相關(guān)神經(jīng)元損傷[11]。但絲膠蛋白降血糖的機(jī)制尚不清楚。本研究建立了STZ誘導(dǎo)大鼠胰島細(xì)胞株INS-1損傷模型，同時給予絲膠蛋白干預(yù)，通過檢測胰島細(xì)胞株INS-1細(xì)胞凋亡及觀察凋亡相關(guān)因子Bcl-2、Bax表達(dá)的變化，探討絲膠蛋白是否對胰島細(xì)胞株INS-1的凋亡具有抑制作用。

Bcl-2家族蛋白可通過改變線粒體外膜的通透性而調(diào)控線粒體活化，在線粒體誘導(dǎo)的凋亡途徑中起重要作用[12]，該家族蛋白包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，其中Bcl-2屬于抗凋亡蛋白，與Bcl-2同源的Bax則屬于促凋亡蛋白。Bcl-2蛋白可通過調(diào)控細(xì)胞膜的通透性來阻止細(xì)胞色素C的釋放，從而阻止細(xì)胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)[13]，而Bax可在細(xì)胞遭受損傷時移位到線粒體膜而引發(fā)凋亡過程[14]，當(dāng)Bax大量表達(dá)時，細(xì)胞對凋亡信號的反應(yīng)增強(qiáng)，細(xì)胞凋亡增多[15]。 Bcl-2與Bax的作用互相拮抗，當(dāng)細(xì)胞受到促凋亡因素刺激時，二者的比率決定細(xì)胞的存亡[16]。

本研究結(jié)果顯示，絲膠蛋白組胰島細(xì)胞株INS-1細(xì)胞存活率升高，細(xì)胞凋亡率下降，Bcl-2 mRNA及其蛋白表達(dá)水平升高而Bax mRNA及其蛋白表達(dá)水平下降，Bcl-2 mRNA/Bax mRNA及Bcl-2/Bax升高，說明絲膠蛋白可以抑制STZ誘導(dǎo)的胰島細(xì)胞株INS-1細(xì)胞凋亡而具有細(xì)胞保護(hù)作用，推測本課題組前期研究的絲膠水提物的降糖作用可能通過抑制胰島β細(xì)胞凋亡實現(xiàn)，但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

作者貢獻(xiàn)：陳志宏進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計，研究的實施與可行性分析，論文的修訂，對文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理；王小杰、劉美曉、謝云鵬、毛曉霞、孫一嬋進(jìn)行數(shù)據(jù)收集；王小杰進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，統(tǒng)計學(xué)處理，撰寫論文，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校；王小杰、劉美曉、陳志宏進(jìn)行結(jié)果的分析與解釋。

本文無利益沖突。

[1]GUARIGUATA L,WHITING D R,HAMBLETON I,et al.Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035[J].Diabetes Res Clin Pract,2014,103(12):137-149.DOI:10.1016/j.diabres.2013.11.002.

[2]MA Y,WANG X,PENG Y,et al.Forkhead box O1 promotes INS-1 cell apoptosis by reducing the expression of CD24[J].Mol Med Rep,2016,13(4):2991-2998.DOI:10.3892/mmr.2016.4896.

[3]LI C,JONES P M,PERSAUD S J.Cannabinoid receptors are coupled to stimulation of insulin secretion from mouse MIN-6 beta cells[J].Cell Physiol Biochem,2010,26(2):187-196.DOI:10.1159/000320527.

[4] 付秀美,鐘美蓉,付文亮，等.絲膠對2型糖尿病大鼠血糖和血脂的影響[J].中國老年學(xué)雜志,2011,31(1):103-105.DOI:10.3969/j.issn.1005-9202.2011.01.044. FU X M,ZHONG M R,FU W L,et al.Effects of sericine on blood glucose and blood lipid in type 2 diabetes rats[J].Chinese Journal of Gerontology,2011,31(1):103-105.DOI:10.3969/j.issn.1005-9202.2011.01.044.

[5]CHEN L,MAGLIANO D J,ZIMMET P Z.The worldwide epidemiology of type 2 diabetes mellitus-present and future perspectives[J].Nat Rev Endocrinol,2012,8(4):228-236.DOI:10.1038/nrendo.2011.183.

[6]BUTLER A E,JANSON J,BONNER-WEIR S,et al.Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes[J].Diabetes,2003,52(1):102-110.

[7]TONG X L,DONG L,CHEN L,et al.Treatment of diabetes using traditional Chinese medicine:past,present and future[J].Am J Chin Med,2012,40(5):877-886.DOI:10.1142/S0192415X12500656.

[8]TZENG T F,LIOU S S,LIU I M.The selected traditional Chinese medicinal formulas for treating diabetic nephropathy:perspective of modern science[J].J Tradit Complement Med,2013,3(3):152-158.DOI:10.4103/2225-4110.114893.

[9] 盛家鏞,林紅,王磊,等.易溶性絲膠粉的微細(xì)結(jié)構(gòu)及理化性能研究[J].絲綢,2000,45(6):6-9.DOI:10.3969/j.issn.1001-7003.2000.06.003. SHENG J Y,LIN H,WANG L,et al.Studies on the microstructure and physico-chemical properties of diffluent sericin powder[J].Silk,2000,45(6):6-9.DOI:10.3969/j.issn.1001-7003.2000.06.003.

[10]SONG C J,YANG Z J,TANG Q F,et al.Effects of sericin on the testicular growth hormone/insulin-like growth factor-1 axis in a rat model of type 2 diabetes[J].Int J Clin Exp Med,2015,8(7):10411-10419.

[11]SONG C,YANG Z,ZHONG M,et al.Sericin protects against diabetes-induced injuries in sciatic nerve and related nerve cells[J].Neural Regen Res,2013,8(6):506-513.DOI:10.3969/j.issn.1673-5374.2013.06.003.

[12]PIRO F,LEONARDI L.Expression of Bcl-2 in canine osteosarcoma[J].Open Vet J,2015,5(1):27-29.

[13]GHONEUM M,MATSUURA M,BMGA M,et al.Cerevisiae induces apoptosis in human metastatic breast cancer cells by altering intracellular Ca2+and the ratio of Bax and Bcl-2[J].Int J Oncol,2008,33(3):533-539.

[14]COHEN H Y,MILLER C,BITTERMAN K J,et al.Calorie restriction promotes mammalian cell survival by inducing the SIRT1 deacetylase[J].Science,2004,305(5682):390-392.

[15]ANAGNOSTOU V K,LOWERY F J,ZOLOTA V,et al.High expression of Bcl-2 predicts favorable outcome in non-small cell lung cancer patients with non squamous histoloty[J].BMC Cancer,2010,10:186.DOI:10.1186/1471-2407-10-186.

[16]BARREZUETA L F,OSHIMA C T,LIMA F O,et al.The intrinsic apoptotic signaling pathway in gastric adenocarcinomas of Brazilian patients:immunoexpression of the Bcl-2 family(Bcl-2,Bcl-x,Bak,Bax,Bad) determined by tissue microarray analysis[J].Mol Med Report,2010,3(2):261-267.DOI:10.3892/mmr_00000249.

(本文編輯：陳素芳)

Effect of Sericin on Apoptosis Related Factors in Streptozotocin-induced INS-1 Cells

WANGXiao-jie1,LIUMei-xiao1,XIEYun-peng2,MAOXiao-xia3，SUNYi-chan1，CHENZhi-hong4*

1.InstituteofBasicMedicalSciences,ChengdeMedicalUniversity,Chengde067000,China2.DepartmentofNeurosurgery,AffiliatedHospitalofChengdeMedicalUniversity,Chengde067000,China3.InstituteofTraditionalChineseMedicine,ChengdeMedicalUniversity,Chengde067000,China4.DepartmentofHumanAnatomy,ChengdeMedicalUniversity,Chengde067000,China*Correspondingauthor：CHENZhi-hong，Professor；E-mail：czh1971@163.com

Objective To investigate the effect of sericin on apoptosis related factors Bcl-2 and Bax in Streptozotocin(STZ)-induced INS-1 cells.Methods This study was conducted from June 2015 to March 2016.INS-1 cells were divided into normal group(without any treatment),STZ group(STZ addition) and sericin group(STZ and sericin treatment).The survival rate of INS-1 cells was measured with CCK-8 assay.Apoptosis rate of INS-1 cells was detected with flow cytometry.The expression of apoptosis related factors Bcl-2 and Bax mRNA and protein were determined by RT-PCR and Western blotting,respectively.Results Compared with the STZ group,both the normal group and the sericin group had higher survival rate of INS-1 cells(P<0.05).Flow cytometry assay found that,both the normal group and sericin group had lower apoptosis rate of INS-1 cells than STZ group did(P<0.05).Compared with the normal group,the STZ group had lower expressions of Bcl-2 mRNA and protein,Bcl-2 mRNA/Bax mRNA and Bcl-2/Bax(P<0.05),but higher expressions of Bax mRNA and protein in INS-1 cells(P<0.05).Higher expressions of Bcl-2 mRNA and protein,Bcl-2 mRNA/Bax mRNA and Bcl-2/Bax and lower expressions of Bax mRNA and protein in INS-1 cells were observed in the sericin group compared with the STZ group(P<0.05).Conclusion Sericin could inhibit the apoptosis of STZ-induced INS-1 cells,and increase the Bcl-2/Bax ratio.

Sericins；Streptozocin；Apoptosis inducing factor；Genes,Bcl-2；Bcl-2-associated X protein

國家自然科學(xué)基金資助項目(81441133)；河北省自然科學(xué)基金資助項目(H2013406096)；河北省教育廳青年基金項目(QN20131089)

R 587.1

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.14.010

2017-01-03；

2017-03-21)

1.067000河北省承德市，承德醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所

2.067000河北省承德市，承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科

3.067000河北省承德市，承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所

4.067000河北省承德市，承德醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室

*通信作者：陳志宏，教授；E-mail：czh1971@163.com