唐 湖 郝心愿 王 璐 肖 斌 王新超,* 楊亞軍,,*

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茶樹越冬芽在休眠與萌發(fā)時期的物質(zhì)交流變化及其分子調(diào)控

唐 湖1,2,**郝心愿2,**王 璐2肖 斌1王新超2,*楊亞軍1,2,*

1西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院, 陜西楊凌712100;2中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所 / 國家茶樹改良中心/ 農(nóng)業(yè)部茶樹生物學(xué)與資源利用重點實驗室, 浙江杭州310008

為揭示不同萌發(fā)物候型茶樹的休眠機(jī)制, 以特早生茶樹品種龍井43和中生茶樹品種碧云為材料, 利用鈣黃素處理茶樹莖段, 檢測越冬芽在休眠與萌發(fā)時期與其他器官的物質(zhì)交流情況。利用同源比對鑒定胼胝質(zhì)水解相關(guān)基因, 并分析其序列特征及在冬季不同時期的表達(dá)模式。結(jié)果表明, 越冬芽在茶樹生長階段和休眠階段都存在著與著生莖段和母葉間的物質(zhì)交流; 從茶樹越冬芽休眠形成到解除的不同時期, 其物質(zhì)交流存在“強(qiáng)-弱-強(qiáng)”的變化規(guī)律, 但龍井43的與碧云相比存在較短的物質(zhì)交流減弱時期; 兩種茶樹的物質(zhì)交流變化模式與鑒定到的茶樹胼胝質(zhì)水解正向調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)模式密切相關(guān); 啟動子序列分析進(jìn)一步證實啟動子區(qū)有多個與激素信號以及低溫和休眠響應(yīng)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的保守序列。茶樹越冬芽在休眠和非休眠狀態(tài)下都存在與莖和母葉之間的物質(zhì)交流, 且物質(zhì)交流強(qiáng)弱與茶樹越冬芽休眠狀態(tài)改變密切相關(guān)。可能是參與胼胝質(zhì)水解調(diào)控, 改變茶樹越冬芽物質(zhì)交流水平, 進(jìn)而影響茶樹休眠狀態(tài)的關(guān)鍵基因。這對明確茶樹越冬芽休眠狀態(tài)變化和深入揭示不同萌發(fā)物候型茶樹休眠機(jī)理有重要意義。

茶樹; 越冬芽休眠; 物質(zhì)交流; 鈣黃素

植物特別是多年生植物的整個生命周期中, 常常會遭遇惡劣環(huán)境條件, 植物的活躍生長器官或組織進(jìn)入休眠狀態(tài)來增加對逆境的抵御能力, 安全度過不利的時期, 并在環(huán)境適宜時解除休眠, 重新恢復(fù)生長。休眠是指含有分生組織的植物結(jié)構(gòu)可見生長的暫時停止[1]。芽休眠是多年生木本植物最為常見的休眠方式, 其影響因素主要分為環(huán)境因素和生理因素; 包括日照、溫度、水分、激素、糖、胼胝質(zhì)的形成等[2]。在植物休眠與解除休眠過程中, 涉及到芽及其生長部位以及其他器官之間的物質(zhì)交流, 包括水分、營養(yǎng)物質(zhì)、植物激素及生長調(diào)節(jié)物質(zhì)等等[1]。也有研究表明, 在植物休眠與解除休眠過程中, 物質(zhì)運輸?shù)臅匙枰蚕鄳?yīng)變化[3-4]。van der Schoot和Rinne[5]發(fā)現(xiàn), 糖作為信號和營養(yǎng)物質(zhì), 會從葉片運輸?shù)窖? 影響芽休眠的形成和解除。胞間連絲是細(xì)胞間物質(zhì)交流的通道, 胼胝質(zhì)的形成和消解則是調(diào)控胞間連絲開閉的重要途徑[6]。Rinne等[7-8]證實芽從休眠解除到處于可增生的活躍狀態(tài)是與1,3-b-D-葡聚糖在胞間連絲的活動密不可分的。在植物芽休眠的不同階段, 休眠芽與其他器官的物質(zhì)交流狀態(tài)會發(fā)生明顯的變化, Rinne等[8]據(jù)此將芽休眠分為3個時期?；钴S期, 細(xì)胞間信號與物質(zhì)交流強(qiáng)度大; 休眠期, 胞間連絲被胼胝質(zhì)填充而關(guān)閉共質(zhì)體途徑, 交流被阻; 休眠解除期, 胼胝質(zhì)從胞間連絲括約肌和通道撤離, 共質(zhì)體組織活性恢復(fù)。

茶樹作為葉用為主的經(jīng)濟(jì)林木, 其芽葉的生長與休止, 不僅關(guān)系到其對環(huán)境的適應(yīng), 且關(guān)系到其經(jīng)濟(jì)價值[9], 因此, 研究茶樹芽休眠形成與解除的機(jī)制具有重要的意義。前人對于茶樹越冬芽的研究, 主要集中在外界環(huán)境和激素動態(tài)變化及相應(yīng)分子機(jī)制上。如錢利生等[10]、黃亞輝等[11]和禹利君等[12]研究了茶樹內(nèi)源激素GA3、ABA、IAA、ZT等對茶樹芽休眠和萌發(fā)的影響。王新超等[13-15]通過分子手段研究了相應(yīng)的分子機(jī)理, 如構(gòu)建茶樹休眠芽與萌動芽的正、反向抑制消減雜交文庫, 克隆細(xì)胞周期蛋白基因()、細(xì)胞周期素依賴激酶基因()等, 并分析它們在不同休眠階段的表達(dá)變化和表達(dá), 初步揭示了茶樹越冬芽休眠與解除的分子機(jī)理。但是在茶樹休眠形成和解除過程中, 對越冬芽如何與其他器官進(jìn)行物質(zhì)和信號交流的研究鮮有報道。另外, 茶樹為常綠木本植物, 冬季休眠階段成熟老葉并不脫落。成熟葉片中的物質(zhì)成分是否會影響相鄰腋芽的休眠仍未可知。

為明確冬季不同階段茶樹越冬芽與其他器官物質(zhì)交流的動態(tài)變化及其分子調(diào)控機(jī)制, 本試驗以不同萌發(fā)物候期茶樹為研究對象, 采用鈣黃素?zé)晒夥▉硌芯坎铇湓蕉吭诓煌菝唠A段與其他器官物質(zhì)交流的動態(tài)變化, 通過鑒定葡聚糖酶基因及其表達(dá)模式, 驗證胼胝質(zhì)在調(diào)控茶樹越冬芽與其他器官物質(zhì)交流中的作用, 初步揭示調(diào)控茶樹越冬芽休眠形成與解除的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

材料為20年生國家級茶樹品種龍井43和碧云, 種植于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所試驗茶園。其中龍井43為特早生品種, 碧云為中生品種。

1.2 樣品采集

從2015年9月23日到2016年3月15日, 每間隔一段時間進(jìn)行采樣, 分別采集2個品種健康生長的當(dāng)年生枝條, 立即帶回實驗室進(jìn)行后繼的鈣黃素處理, 同時采集同一時期2個品種的頂芽, 直接投入液氮, 隨后放入–80℃冰箱保存, 用于RNA提取。每次采樣設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)。

1.3 鈣黃素處理及熒光觀察

參考Rinne等[7]的方法, 配制0.1%鈣黃素(Sigma, C0875)并于4℃避光保存。采集枝條, 剪成一葉一芽的莖段, 隨后放入加有鈣黃素染液的50 mL離心管中, 染液以剛淹沒剪口為宜, 管口用脫脂棉封堵。將處理莖段置室溫24 h。之后除去母葉, 在熒光顯微鏡(尼康80i)下用4倍物鏡觀察腋芽熒光情況, 并使用Axio Vision Rel.4.6軟件照相。在照相時將鈣黃素染液處理樣品和對照樣品一起放在顯微鏡下, 分別在綠光和紫外光下觀察激發(fā)熒光。綠光通道下, 植物組織呈現(xiàn)紅色自發(fā)熒光, 紫外光下, 組織內(nèi)的鈣黃素受激發(fā)后發(fā)出綠色熒光。

每個品種每次采樣所得莖段, 一半將莖底端沒入鈣黃素染液, 用于檢測“莖-芽”的物質(zhì)交流情況; 一半剪掉一半葉片后, 將葉片剪口端沒入染液, 檢測“葉-芽”的物質(zhì)交流情況。每種處理設(shè)3個生物學(xué)重復(fù), 每個生物學(xué)重復(fù)至少處理5個莖段。以清水處理為對照。

1.4 胼胝質(zhì)水解相關(guān)基因的鑒定及序列分析

依據(jù)擬南芥及楊樹糖基水解酶17家族(Glycosyl hydrolase family 17)序列信息(https://www.arabidopsis. org/)[16-17], 通過與本實驗室建立的茶樹核酸序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源比對, 篩選目的基因。利用MEGA5建立基因編碼蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹; 并利用Plant PAN2.0預(yù)測基因啟動子區(qū)可能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列(http://plantpan2.itps.ncku.edu.tw/)。

1.5 RNA提取及qRT-PCR檢測

采用CTAB法[18]提取總RNA。分別利用NanoDrop ND-100微量核酸蛋白測定儀(Pittsburgh, PA, USA)和1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA濃度和完整性。取每個樣品5mg總RNA用于cDNA合成。cDNA采用SuperScript III第一鏈合成系統(tǒng)(Invitrogen, CA, USA)合成, 用超純水稀釋獲得產(chǎn)物20倍后作為qRT-PCR檢測模板。利用PrimerSelect (Lasergene 8, DNASTAR) 進(jìn)行的qRT-PCR引物設(shè)計(FP: 5￠-TGGTGGTGGTTCGGTTATTATT CTGC-3￠, RP: 5￠-GGATCGCCGGCCTATTCACTCG -3￠),作為內(nèi)參基因[19]。在ABI PRISM7500實時定量PCR儀上進(jìn)行qPCR, 反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min; 95℃ 5 s, 62℃ 34 s, 40個循環(huán)。反應(yīng)體系為10mL, 含5mLSYBR Green Master Mix+0.5mL FP引物+0.5mL RP引物+4mL cDNA模板。每個反應(yīng)3個技術(shù)重復(fù)。采用2–ΔΔCT法分析, GraphPad Prism 5繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹“莖-芽”與“葉-芽”的物質(zhì)交流

從圖1可以看出, 2個品種在2個不同時期(活躍/休眠), “莖-芽”與“葉-芽”的都存在著一定程度的物質(zhì)交流, 只是物質(zhì)交流的強(qiáng)度不同, 在休眠階段, 無論是“莖-芽”還是“葉-芽”, 熒光反應(yīng)較弱, 表明休眠時茶樹芽與母葉以及著生部位節(jié)間的物質(zhì)交流不太活躍。而進(jìn)入活躍生長期后, “莖-芽”和“葉-芽”的熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng), 說明此時芽與母葉以及節(jié)間活躍的物質(zhì)交流為芽的生長提供了必要的物質(zhì)營養(yǎng)。

“莖-芽”處理越冬芽, A和B為活躍生長期(2015-10-31)樣品, E和F為休眠期(2016-01-16)樣品; “葉-芽”處理越冬芽, C和D為活躍生長期(2015-10-31)樣品, G和H為休眠期(2016-01-16)樣品。4倍物鏡觀察, 綠色熒光為鈣黃素在紫外光激發(fā)下的熒光信號, 紅色熒光為越冬芽在綠光通道下的自發(fā)熒光。CTB: 鈣黃素處理; CK: 水處理對照。

In stem to bud treatment, samples A and B were active-growing buds (2015-10-31) and samples E and F were dormant buds (2016-01-16). In leaf to bud treatment, samples C and D were active-growing buds (2015-10-31) and samples G and H were dormant buds (2016-01-16). Pictures were taken under 4′objective lens. The green signals show fluorescence produced by calcein under UV light stimulation and the red signals show autofluorescence of bud under green light stimulation. CTB: calcein treatment; CK: control (H2O).

2.2 冬季不同時期的茶樹越冬芽與其他器官物質(zhì)交流動態(tài)變化

從圖2看出, 在10月底到11月初, 茶樹芽感知外界信號的變化, 生長發(fā)育逐漸從活躍轉(zhuǎn)入休眠狀態(tài), 物質(zhì)交流的強(qiáng)度由強(qiáng)變?nèi)?。隨著時間的推移, 芽的休眠程度加深, 進(jìn)入了深度休眠狀態(tài), 此時的熒光反應(yīng)強(qiáng)度很弱, 說明物質(zhì)交流極不活躍。進(jìn)入第2年春季以后, 隨著氣溫回升和光照時間增加, 芽的生長發(fā)育也逐漸恢復(fù), 熒光強(qiáng)度逐漸增加, 說明芽與著生部位之間的物質(zhì)交流強(qiáng)度提高, 為芽的萌發(fā)提供足夠的營養(yǎng)物質(zhì)。

中生種碧云和特早生種龍井43春季萌發(fā)物候期存在明顯差異。雖然二者在冬季休眠形成到第2年春季萌發(fā)過程中, 越冬芽與其他器官物質(zhì)交流都存在“強(qiáng)-弱-強(qiáng)”的變化規(guī)律, 但是二者越冬芽與其他器官物質(zhì)交流強(qiáng)弱變化的時間和程度都存在明顯的不同。其中, 龍井43腋芽的熒光信號在12月份開始逐漸減弱, 1月份最弱, 2月初開始迅速加強(qiáng); 而碧云處理腋芽的熒光信號在11月份開始減弱, 1月份和2月初最弱, 且熒光強(qiáng)度明顯弱于龍井43同時期腋芽, 2月底才逐漸加強(qiáng)。物質(zhì)交流變化的差異可能是影響茶樹春季萌發(fā)早晚的重要因素, 是反映越冬芽休眠狀態(tài)的重要指標(biāo)。

2.3 葡聚糖酶基因的鑒定及表達(dá)分析

通過同源比對, 從茶樹核酸序列數(shù)據(jù)庫中篩選了一條β-1,3-葡聚糖酶同源基因, 命名為茶樹β-1,3-葡聚糖酶基因1 (β-1,3-glucanase gene 1,), 基因序列已上傳至GenBank (KX982263)。因葡聚糖酶基因家族成員較多, 不同亞家族的基因成員的功能不同。為鑒定基因可能的功能, 利用該基因編碼氨基端序列, 與擬南芥葡聚糖酶基因家族成員及楊樹中已經(jīng)鑒定出的葡聚糖酶同源基因編碼蛋白一起構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。結(jié)果顯示CsGLU1為α亞家族成員, 與擬南芥中的AT5G42100.1蛋白同源性較高, 與楊樹中鑒定的GH17-33和GH17-65的同源性最高。為分析基因可能的調(diào)控因子, 對該基因啟動子區(qū)1500 bp長度序列中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列進(jìn)行了分析(表1)。結(jié)果顯示, 該基因的啟動子區(qū)有密集的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列分布, 可以被多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控, 如bZIP、bHLH、dehydrin、AP2/ERF、Myb、B3/ARF/RAV、ARR、MADS/MIKC、WRKY及Homeodomain等。

為明確基因表達(dá)與物質(zhì)交流變化的關(guān)系, 檢測了基因在2個品種冬季不同時期的表達(dá)模式(圖4)。在龍井4中,表達(dá)水平在12月底前存在波動, 之后持續(xù)降低, 在第2年1月達(dá)到最低, 在3月初迅速上調(diào)。在碧云中,表達(dá)自11月底迅速下調(diào), 在12月中旬至第2年2月都保持較低的水平, 在3月初逐漸升高, 但是升高速率較慢?？傊? 該基因在2個茶樹品種中都有一個表達(dá)水平較低的時期。我們將前面物質(zhì)交流檢測中, 越冬芽與其他器官物質(zhì)交流減弱的時期在圖4中標(biāo)出后, 發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)顯著下調(diào)的時期與物質(zhì)交流減弱的時期幾乎完全吻合。

3 討論

茶樹芽的休眠與解除是一個復(fù)雜的生理過程, 涉及基因表達(dá)、物質(zhì)代謝等變化, 同時受到多種內(nèi)外因素影響, 且與物質(zhì)的交流密切相關(guān)。Jian等[20]通過研究楊樹休眠芽細(xì)胞壁中胞間連絲的收縮和阻斷探索休眠時的物質(zhì)交流情況; 劉芳等[21]研究細(xì)葉百合鱗莖打破休眠時的形態(tài)及莖尖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化發(fā)現(xiàn), 當(dāng)休眠解除時, 胞間連絲變粗, 細(xì)胞新陳代謝加強(qiáng), 胞間物質(zhì)交流經(jīng)多種途徑重新建立; Ruonala等[22]進(jìn)一步表明楊樹側(cè)芽與莖之間的物質(zhì)交流對于莖生長和進(jìn)入休眠有重要作用。本試驗證實, 茶樹越冬芽的生長狀態(tài)與其他器官的物質(zhì)交流水平密切相關(guān)。每年1~2月份為一年中溫度最低的時期, 此時茶樹處于深休眠時期, 芽與其他器官物質(zhì)交流明顯減弱。當(dāng)休眠芽與其他器官物質(zhì)交流加強(qiáng)后, 茶樹開始萌動。而且茶樹休眠及活躍生長階段, “莖-芽”、“葉-芽”之間的物質(zhì)交流并無差異, 作為常綠木本植物, 母葉對腋芽休眠的影響還有待進(jìn)一步研究。

Rinne等[7]用赤霉素處理楊樹休眠芽, 發(fā)現(xiàn)有解除休眠的作用。通過進(jìn)一步的鈣黃素處理和組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn), 在用赤霉素處理休眠芽后, 休眠芽與其他器官的物質(zhì)交流的通道被打開, 胞間的胼胝質(zhì)被水解。說明胞間胼胝質(zhì)的形成和水解是調(diào)控植物芽休眠形成和解除的重要機(jī)制。近來, Rinne等[17]證實β-1,3-葡聚糖酶基因是響應(yīng)赤霉素信號的下游基因。β-1,3-葡聚糖酶是一個復(fù)雜的多基因家族, 參與抗病、細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)重塑等多種生理和發(fā)育過程, 具有水解胼胝質(zhì)的活性[16]。擬南芥中被鑒定的葡聚糖酶基因有50個, 被分為α、β和γ亞家族。該基因家族成員都含有一個N端信號肽和一個糖基水解酶17家族的保守域, 只有α亞家族成員可以定位到胞間連絲[23]。在楊樹中已鑒定到的葡聚糖酶基因約100個, α和γ亞家族成員都可以定位到胞間連絲[24]。但是在赤霉素信號誘導(dǎo)下, α亞家族基因表達(dá)會被顯著上調(diào), 相反γ亞家族基因表達(dá)被顯著下調(diào)[17]。Nagar等[25]檢測了茶樹多種內(nèi)源激素從休眠形成到休眠解除過程中的含量變化, 結(jié)果表明自由態(tài)的赤霉素濃度在茶樹休眠形成和深休眠階段都處于較低的水平,而在休眠解除前快速升高。本研究中鑒定到的β-1,3-葡聚糖酶基因為α亞家族基因, 在赤霉素信號誘導(dǎo)下應(yīng)上調(diào)表達(dá)[17]。表達(dá)結(jié)果顯示, 該基因在茶樹越冬芽休眠解除階段表達(dá)顯著上調(diào)。表明該基因可能通過改變胞間連絲周圍胼胝質(zhì)的水解速率來調(diào)控越冬芽與其他器官的物質(zhì)交流通道, 進(jìn)而影響茶樹越冬芽休眠的解除。

采樣日期為2015-10-31 (A和B)、2015-11-16 (C和D)、2015-12-17 (E和F)、2016-01-06 (G和H)、2016-02-02 (I和J)、2016-02-25 (K和L)及2016-03-09 (M和N)。4倍物鏡觀察, 綠色熒光為鈣黃素在紫外光激發(fā)下的熒光信號, 紅色熒光為越冬芽在綠光通道下的自發(fā)熒光。CTB: 鈣黃素處理; CK: 水處理對照。

The sampling dates were 2015-10-31 (A and B), 2015-11-16 (C and D), 2015-12-17 (E and F), 2016-01-06 (G and H), 2016-02-02 (I and J), 2016-02-25 (K and L), and 2016-03-09 (M and N). Pictures were taken under 4′objective lens. The green signals show fluorescence produced by calcein under UV light stimulation and the red signals show autofluorescence of bud under green light stimulation. CTB: calcein treatment; CK: control (H2O).

藍(lán)色、紅色和紫色字體分別顯示α、β和γ亞家族基因。■擬南芥葡聚糖酶基因家族; ▼楊樹葡聚糖酶基因家族; ●茶樹CsGUL1。

α-, β-, and γ-clade genes are in blue, red, and purple font, respectively. ■ Genes from; ▼ Genes from; ● CsGLU1.

表1 CsGLU1啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點信息

(續(xù)表1)

模型編碼Matrix ID轉(zhuǎn)錄因子家族Family結(jié)合位點Position to ATG方向Strand匹配度Similar score匹配序列Hit sequence TF_motif_seq_0255AP2; RAV; B3–138–1.00TGTTG TFmatrixID_0461WRKY–140–0.98aatgTTGACg TFmatrixID_0154AT-Hook–189+1.00aAAATAat TFmatrixID_0099Myb/SANT; trp; MYB–199+0.87agcTCAGCcca TFmatrixID_0508MADS box; MIKC–225+0.88cCAAAAtagca TF_motif_seq_0252Myb/SANT; MYB; ARR-B–244+1.00GGATT TFmatrixID_0051LOB; LBD–248+0.96atCCGGAttc TFmatrixID_0486Myb/SANT; ARR-B–250–1.00AGATCcgg TFmatrixID_0156B3; ARF–259+0.96tgCGACAga TFmatrixID_0605B3–503–0.86aaaTACACgg TFmatrixID_0047bZIP; Homeodomain; HD-ZIP–670+0.92ccaATTATta TFmatrixID_0392NAC; NAM–713–1.00gatcACGCAa TFmatrixID_0302Homeodomain–763–0.98gGACTAagct TF_motif_seq_0251TCP–826+1.00GCCCG TF_motif_seq_0072HD-ZIP–835–0.82gcaatgAATGC TFmatrixID_0089AP2;B3;RAV–974+0.96cggCAACAggat TF_motif_seq_0331TCP–1023+1.00tCGGGT TFmatrixID_0283Homeodomain; HD-ZIP–1072+0.96aggTGATTga TFmatrixID_0589MYB–1090–0.93ggtTGGTTca TFmatrixID_0495BES1–1109–0.97cggacACGTGgcgc TFmatrixID_0636C2H2–1116+0.94atCAGCTcgg TFmatrixID_0050Myb/SANT; MYB;G2-like–1225+0.92gacTATTCtc TFmatrixID_0359Myb/SANT; G2-like–1285+0.99caaGAATCtt TFmatrixID_0057AP2; RAV–1303+0.94aCAACAtt TFmatrixID_0256EIN3; EIL–1358–0.99cgaTGCATga

的表達(dá)模式分析表明, 該基因的表達(dá)水平與茶樹越冬芽與其他器官物質(zhì)交流的強(qiáng)弱變化密切相關(guān), 而且在不同萌發(fā)物候期的茶樹品種中的表達(dá)模式不同。該試驗結(jié)果不但揭示了胼胝質(zhì)在調(diào)控物質(zhì)交流中的重要作用, 同時對于快速鑒定茶樹越冬芽休眠狀態(tài)有重要意義。為進(jìn)一步了解該基因可能的調(diào)控機(jī)制, 我們分析了該基因的啟動子序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在該基因啟動子區(qū)有多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合序列, 這些轉(zhuǎn)錄因子家族基因參與植物多種的激素反應(yīng)、抗逆及生理發(fā)育過程。在茶樹抗寒研究中已證實, bZIP基因家族部分成員參與茶樹低溫響應(yīng)的調(diào)控[26]。激素及脫水蛋白等相關(guān)基因在茶樹冷馴化過程中存在顯著表達(dá)差異[27]。生長素調(diào)控相關(guān)的ARF家族基因也參與了茶樹的休眠調(diào)控[28]。MADS家族的基因被認(rèn)為是參與植物休眠調(diào)控的關(guān)鍵基因[2, 29]。推測基因可能是茶樹休眠調(diào)控的下游基因, 受多個休眠相關(guān)的信號途徑共同調(diào)控。植物休眠是受光周期、溫度等多種環(huán)境因素共同作用的結(jié)果, 多種激素及光周期、溫度感受基因參與這一過程[2]。對單個信號的研究很難檢測植物的休眠狀態(tài), 深入研究基因的作用機(jī)制, 對于準(zhǔn)確鑒定越冬芽的休眠狀態(tài)有重要的指導(dǎo)意義。

4 結(jié)論

茶樹芽與莖及其母葉都有著相似強(qiáng)度的的物質(zhì)交流; 茶樹芽從活躍期到休眠再到活躍時的生長狀態(tài)可以通過熒光反應(yīng)的強(qiáng)弱來反映; 2個茶樹品種休眠解除時間及休眠期的長短與越冬芽物質(zhì)交流強(qiáng)弱密切相關(guān)。茶樹基因是參與胼胝質(zhì)水解正向調(diào)控的基因, 其冬季不同時期的表達(dá)模式與物質(zhì)交流強(qiáng)弱變化存在一致性。胼胝質(zhì)水解調(diào)控可能是影響物質(zhì)交流變化的必要機(jī)制。

References

[1] Ruttink T, Arend M, Morreel K, Storme V, Rombaut sS, Fromm J, Bhalerao R, Boerjan W, Rohde A. A molecular timetable for apical bud formation and dormancy induction in poplar., 2007, 19: 2370–2390

在本次調(diào)查期間，參與口語報告檢測的學(xué)生共有45名，其中學(xué)習(xí)質(zhì)量相對較好、學(xué)習(xí)質(zhì)量中等、學(xué)困生各15名。

[2] Cooke J E, Eriksson M E, Junttila O. The dynamic nature of bud dormancy in trees: environmental control and molecular mechanisms., 2012, 35: 1707–1728

[3] Rinne P L, van der Schoot C. Symplasmic fields in the tunica of the shoot apical meristem coordinate morphogenetic events., 1998. 125: 1477–1485

[4] Nathalie D, Annika J, Baba K, Schrader J, Sj?din A, Bhalerao R R, Resman L, Trygg J, Moritz T, Bhalerao R P. Environmental and hormonal regulation of the activity–dormancy cycle in the cambial meristem involves stage-specific modulation of transcriptional and metabolic networks., 2007, 50: 557–573

[5] van der Schoot C, Rinne P L. Dormancy cycling at the shoot apical meristem: transitioning between self-organization and self-arrest., 2011, 180: 120–131

[6] Low H P, Gréco B, Tanahashi Y, Gallant J, Jones S N, Billings- Gagliardi S, Recht L D, Schwartz W J. Plasmodesmata at the crossroads between development, dormancy, and defense., 2004, 81: 1182–1197

[7] Rinne P L, Welling A, Vahala J, Ripel L, Ruonala R, Kangasjarvi J, van der Schoot C. Chilling of dormant buds hyperinduces FLOWERING LOCUS T and recruits GA-inducible 1, 3-beta-glucanases to reopen signal conduits and release dormancy in., 2011, 23: 130–146

[8] Rinne P L, Kaikuranta P M, van der Schoot C. The shoot apical meristem restores its symplasmic organization during chilling- induced release from dormancy., 2001, 26: 249–264

[9] 晏嫦妤, 李家賢, 黃華林, 何雨媚. 茶樹休眠的研究進(jìn)展. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40: 10387–10389 Yan C Y, Li J X, Huang H L, He Y M. Research progress of tea plant dormancy., 2012, 40: 10387–10389 (in Chinese with English abstract)

[11] 黃亞輝, 粟本文, 鄭紅發(fā), 曾貞, 劉霞林. 茶樹春梢萌動期間內(nèi)源激素含量的變化. 植物生理學(xué)通訊, 2001, 37: 306–307 Huang Y H, Su B W, Zheng H F, Zeng Z, Liu X L. Changes of endohormone in prouting shoot of tea plant., 2001, 37: 306–307 (in Chinese with English abstract)

[12] 禹利君, 史云峰, 肖海云, 劉富知, 劉仲華. 不同物候型茶樹內(nèi)源GA3和ABA的變化及其對腋芽萌發(fā)調(diào)控的影響. 作物學(xué)報, 2008, 34: 277–283 Yu L J, Shi Y F, Xiao H Y, Liu F Z, Liu Z H. Dynamic changes of endogenous GA3and ABA contents in tea culticars with different phenological characters and their impact on the regulation axillary buds sprouting., 2008, 34: 277–283 (in Chinese with English abstract)

[13] Wang X, Hao X, Ma C, Cao H, Yue C, Wang L, Zeng J, Yang Y. Identification of differential gene expression profiles between winter dormant and sprouting axillary buds in tea plant () by suppression subtractive hybridization., 2014, 10: 1149–1159

[14] 王新超, 楊亞軍, 馬春雷, 金基強(qiáng), 曹紅利. 茶樹細(xì)胞周期蛋白基因的克隆與表達(dá). 西北植物學(xué)報, 2011, 31: 2365–2372 Wang X C, Yang Y J, Ma C L, Jin J Q, Cao H L. Cloning and expression analysis of cyclin gene () of tea plant., 2011, 31: 2365–2372 (in Chinese with English abstract)

[15] 王新超, 馬春雷, 楊亞軍, 金基強(qiáng), 馬建強(qiáng), 曹紅利. 茶樹細(xì)胞周期蛋白依賴激酶()基因cDNA全長克隆與分析. 園藝學(xué)報, 2012, 39: 333–342 Wang X C, Ma C L, Yang Y J, Jin J Q, Ma J Q, Cao H L. cDNA cloning and expression analysis of cyclin-dependent kinase () gene in tea plant., 2012, 39: 333–342 (in Chinese with English abstract)

[16] Doxey A C, Yaish M W, Moffatt B A, Griffith M, McConkey B J. Functional divergence in thebeta-1,3-glucanase gene family inferred by phylogenetic reconstruction of expression states., 2007, 24: 1045–1055

[17] Rinne P L, Paul L K, Vahala J, Kangasjarvi J, van der Schoot C. Axillary buds are dwarfed shoots that tightly regulate GA pathway and GA-inducible 1,3-beta-glucanase genes during branching in hybrid aspen., 2016, 67: 5975–5991

[18] Chang S, Puryear J, Cairney J. A simple and efficient method for isolating RNA from pine trees., 1993, 11: 113–116

[19] Hao X, Horvath D P, Chao W S, Yang Y, Wang X, Xiao B. Identification and evaluation of reliable reference genes for quantitative real-time PCR analysis in tea plant ((L.) O. Kuntze)., 2014, 15: 22155–22172

[20] Jian L C, Li P H, Sun L H, Chen T H H. Alterations in ultrastructure and subcellular localization of Ca2+in poplar apical bud cells during the induction of dormancy., 1997, 48: 1195–1207

[21] 劉芳, 王家艷, 王曉麗, 周蘊薇. 細(xì)葉百合鱗莖在低溫解除休眠過程中莖尖細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化. 園藝學(xué)報, 2013, 40: 1110–1118 Liu F, Wang J Y, Wang X L, Zhou Y W. The apical bud cell ultra-structure changes ofbulbs during breaking dormancy under refrigerated condition., 2013, 40: 1110–1118 (in Chinese with English abstract)

[22] Ruonala R, Rinne P L, Kangasj?rvi J, van der Schoot C.expression in the rib meristem affects stem elongation and the transition to dormancy in., 2008, 20: 59–74

[23] Knox J P, Benitez-Alfonso Y. Roles and regulation of plant cell walls surrounding plasmodesmata., 2014, 22: 93–100

[24] Paul L K, Rinne P L, van der Schoot C. Refurbishing the plasmodesmal chamber: a role for lipid bodies?, 2014. 5: 40

[25] Nagar P K, Kumar A. Changes in endogenous gibberellin activity during winter dormancy in tea ((L.) O. Kuntze)., 2000, 22: 439–443

[26] Cao H, Wang L, Yue C, Hao X, Wang X, Yang Y. Isolation and expression analysis of 18genes implicated in abiotic stress responses in the tea plant ()., 2015, 97: 432–442

[27] Wang X C, Zhao Q Y, Ma C L, Zhang Z H, Cao H L, Kong Y M, Yue C, Hao X Y, Chen L, Ma J Q, Jin J Q, Li X, Yang Y J. Global transcriptome profiles ofduring cold acclimation., 2013, 14: 415

[28] 郝心愿, 曹紅利, 楊亞軍, 王新超, 馬春雷, 肖斌. 茶樹生長素響應(yīng)因子基因的克隆與表達(dá)分析. 作物學(xué)報, 2013, 39: 389–397 Hao H X, Cao C H, Yang Y J, Wang X C, Ma C L, Xiao B. Cloning and expression analysis of auxin response factor gene () in tea plant ([L.] O. Kuntze)., 2013, 39: 389–397 (in Chinese with English abstract)

[29] Jimenez S, Lawton-Rauh A L, Reighard G L, Abbott A G, Bielenberg D G. Phylogenetic analysis and molecular evolution of the dormancy associated MADS-box genes from peach., 2009, 9: 81

Molecular Regulation and Substance Exchange Dynamics at Dormancy and Budbreak Stages in Overwintering Buds of Tea Plant

TANG Hu1,2,**, HAO Xin-Yuan2,**, WANG Lu2, XIAO Bin1, WANG Xin-Chao2,*, and YANG Ya-Jun1,2,*

1College of Horticulture, Northwest A&F University, Yangling 712100, China;2Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Center for Tea Improvement / Key Laboratory of Tea Plant Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Hangzhou 310008, China

Early-sprouting cultivar Longjing 43 and late-sprouting cultivar Biyun were employed in this study to disclose the dormancy mechanism in tea plant with different sprouting phenophases. The levels of substance exchange were monitored by detecting the fluorescence signal in calcein treated overwintering buds. The glucanase related genes were identified by sequence homology analysis. Their characteristics and expression patterns during different time of winter were further analyzed. The substance exchanges were detected either in stem-bud unit or mother leaf-stem unit. From the initial formation to release in dormancy, the substance exchange in overwintering buds showed strong-weak-strong variation patterns in both cultivars, however, the duration of weak exchange stage was much shorter in Longjing 43 than in Biyun. Moreover, there was a close correlation between substance exchange variation pattern and the expression pattern of, a gene identified in tea plant with positive callose hydrolyzation activity. On the basis of promoter sequence analysis, plenty of transcription factor binding sequences related to hormone signaling, cold stimulation and dormancy regulation were found inpromoter region, which validates its putative functions in dormancy regulation. In conclusion, overwintering buds of tea plant have substance exchange with stem and mother leaf both in dormancy and non-dormancy status, furthermore, the variation of substance exchange level was consistent to the changes of dormancy status.is a callose hydrolyzation related gene, which is supposed to be a key gene regulating tea plant dormancy transition through affecting the substance exchange in overwintering buds. The study provides meaningful results for understanding the changes of dormancy statuses in overwintering buds and deeply exploring the regulation mechanism in tea plant with different sprouting phenophase.

Tea plant; Overwinter bud dormancy; Substances exchange; Calcein

10.3724/SP.J.1006.2017.00669

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(31370690), 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-23)和中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程(CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31370690), the China Agriculture Research System (CARS-23), and the Agricultural Science and Technology Innovation Program of CAAS (CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS).

(Corresponding authors): 王新超, E-mail: xcw75@tricaas.com, Tel: 0571-86653162 ; 楊亞軍: Email: yjyang@tricaas.com

唐湖, E-mail: tanghu@tricaas.com; 郝心愿, E-mail: haoxy@tricaas.com, Tel: 0571-86653162

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

(收稿日期): 2016-10-17; Accepted(接受日期): 2017-01-21; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2017-02-17.

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170217.1020.030.html