劉會(huì)云 王婉晴 李 欣 王 軻 王 龍 杜麗璞 晏月明 葉興國(guó),*

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小麥突變體AS208中位點(diǎn)缺失對(duì)籽粒中蛋白體形成和儲(chǔ)藏蛋白合成與加工相關(guān)基因表達(dá)的影響

劉會(huì)云1,**王婉晴2,**李 欣1王 軻1王 龍3杜麗璞1晏月明2,*葉興國(guó)1,*

1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所/ 國(guó)家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學(xué)工程, 北京 100081;2首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 北京 100048;3中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所/ 植物細(xì)胞與染色體工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100101

高分子量谷蛋白亞基(HMW-GS)是小麥籽粒貯藏蛋白的重要成分, 其組成、表達(dá)和含量決定面團(tuán)彈性和加工品質(zhì)。本研究以位點(diǎn)上1Bx20和1By20雙亞基沉默的小麥無(wú)性系變異體AS208為材料, 以AS208的來(lái)源親本輪選987作為對(duì)照, 對(duì)AS208中位點(diǎn)的沉默機(jī)制和1Bx20、1By20亞基沉默對(duì)種子中蛋白體融合以及合成加工相關(guān)基因表達(dá)的影響進(jìn)行了研究。Southern blot分析發(fā)現(xiàn)AS208比輪選987少2條特異帶, 染色體原位雜交(FISH)結(jié)果顯示輪選987中有6條染色體出現(xiàn)雜交信號(hào), 而在AS208中有4條染色體出現(xiàn)雜交信號(hào), 表明AS208基因組中缺失位點(diǎn)。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn), 與輪選987相比, AS208的籽粒蛋白體形成過(guò)程, 以及蛋白體大小和形狀基本一致。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn), 在12個(gè)與籽粒蛋白質(zhì)合成與加工相關(guān)基因中, 有7個(gè)的表達(dá)模式兩品種相似, 有8個(gè)的表達(dá)量在AS208中高于在輪選987中, 特別是、和基因(高1.5~2.0倍)。本研究結(jié)果表明, 小麥位點(diǎn)的基因?qū)ΨN子中蛋白體的形成沒(méi)有明顯影響, 但一定程度上刺激了多數(shù)蛋白質(zhì)合成和加工相關(guān)基因的表達(dá), 保證了種子內(nèi)蛋白含量、蛋白體外形和大小基本不變, 表現(xiàn)負(fù)反饋調(diào)節(jié)效應(yīng)。

小麥; 高分子量谷蛋白亞基; 蛋白體; 轉(zhuǎn)錄因子; 分子伴侶

小麥(L.)是全球約35%人口的主食, 其產(chǎn)量關(guān)系到糧食安全供給, 品質(zhì)關(guān)系到人類(lèi)健康營(yíng)養(yǎng), 產(chǎn)量和加工品質(zhì)主要取決于籽粒中蛋白質(zhì)的組成和含量。小麥籽粒貯藏蛋白的種類(lèi)和特性對(duì)面粉加工品質(zhì)起決定作用[1], 如麥醇溶蛋白主要影響面團(tuán)的延展性[2], 麥谷蛋白主要決定面團(tuán)的彈性[3]。麥谷蛋白分為高分子量麥谷蛋白亞基(high molecular weight glutenin subunit, HMW-GS)和低分子量麥谷蛋白亞基(low molecular weight glutenin subunit, LMW-GS), 分別占胚乳總蛋白含量的10%和40%左右[4]。研究表明, HMW-GS可以解釋約三分之二的面包烘烤參數(shù)變異[5], 所以HMW-GS一直是小麥加工品質(zhì)性狀研究的熱點(diǎn)。

HMW-GS由A1、B1和D1染色體長(zhǎng)臂上的位點(diǎn)編碼, 每個(gè)位點(diǎn)包括2個(gè)緊密連鎖的基因,分別編碼x型和y型HMW-GS[6]。面包小麥理論上應(yīng)該包含6個(gè)HMW-GS, 但由于等位基因沉默, 通常只有3~5個(gè)HMW-GS基因表達(dá)[6]。在大多數(shù)小麥品種中, 1BL和1DL上的4個(gè)HMW-GS基因都能表達(dá), 而1AL上的2個(gè)HMW-GS基因經(jīng)常沉默。為了在相同遺傳背景下準(zhǔn)確研究每個(gè)HMW-GS亞基對(duì)面包加工特性的影響, 利用離子束方法誘導(dǎo)了3個(gè)分別缺失和的品系, 發(fā)現(xiàn)缺失系中LMW-GS亞基含量降低, 醇溶蛋白的含量增加, 面筋功能的遺傳效應(yīng)為>>, 證實(shí)位點(diǎn)的HMW-GS通過(guò)促進(jìn)谷蛋白大聚合體(glutenin macropolymer, GMP)的形成, 保持HMW-GS、LMW-GS和醇溶蛋白之間的平衡, 進(jìn)而對(duì)面筋功能產(chǎn)生影響[7]。Li等[8]用甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate, EMS)處理小偃54, 獲得了1Ax1、1Bx14、1By15、1Dx2和1Dy12敲除或錯(cuò)義突變的突變體, 發(fā)現(xiàn)1Ax1和1Bx14亞基對(duì)面團(tuán)功能和面粉品質(zhì)的作用有很大差異。利用組織培養(yǎng)也可以誘導(dǎo)小麥貯藏蛋白等位基因的變異[9], 如位點(diǎn)1Bx7和1By9亞基的缺失[10]。

面包加工品質(zhì)主要由HMW-GS組成和含量決定, 但還受LMW-GS和醇溶蛋白的組成以及與HMW-GS的聯(lián)合影響。小麥開(kāi)花授粉后隨著儲(chǔ)藏蛋白的合成和積累, 寡含半胱氨酸的HMW-GS與富含半胱氨酸的LMW-GS、醇溶蛋白通過(guò)分子間和分子內(nèi)二硫鍵形成網(wǎng)狀大聚合物, 逐步形成更大聚合物并聚集在蛋白體上(protein body, PB)[11]。蛋白體形成涉及到兩條不同的途徑, 一是醇溶蛋白從高爾基氏復(fù)合體沉積到液泡中, 二是谷蛋白通過(guò)吞噬作用從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)沉積到液泡中[12]。蛋白體具有保護(hù)儲(chǔ)藏蛋白在成熟前被降解的作用。在HMW-GS編碼基因表達(dá)調(diào)控、蛋白質(zhì)合成、聚合物和PB形成及轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程中, 有很多轉(zhuǎn)錄因子和分子伴侶發(fā)揮重要作用, 主要包括Dof (DNA binding with one finger)、SPA (storage protein activator)、BiP (binding protein)和PDI (protein disulfide isomerase)[13-14]。Dof是一類(lèi)植物特有的轉(zhuǎn)錄因子, 參與蛋白合成等植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程, 調(diào)控植物醇溶蛋白基因的轉(zhuǎn)錄激活[15]。儲(chǔ)藏蛋白激活子SPA屬于bZIP類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子, 對(duì)貯藏蛋白基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)具有重要作用, 不同等位基因與面團(tuán)黏彈性和籽粒硬度顯著相關(guān)[11]; BiP和PDI屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶, BiP具有在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔參與種子貯藏蛋白等分泌蛋白的折疊等功能, PDI參與二硫鍵的形成、蛋白折疊以及蛋白體在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的裝配等功能[13-14]。小麥中3個(gè)基因在籽粒灌漿期的表達(dá)模式與HMW-GS基因的表達(dá)模式基本一致[16]?；蛟诨ê?~14 d的籽粒中表達(dá)量很高, 之后表達(dá)水平逐步降低[13]。其中、、和在籽粒發(fā)育早期表達(dá)量較高, 可能與儲(chǔ)藏蛋白合成有關(guān); 而和在后期表達(dá)水平較高, 可能與GMP折疊、蛋白體和淀粉顆粒發(fā)育有關(guān)[17]。

AS208是本課題組從輪選987幼胚培養(yǎng)的后代中選擇的無(wú)性系變異體, 其位點(diǎn)上的1Bx20和1By20亞基發(fā)生了沉默[18]。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn), 在突變體中基因沒(méi)有表達(dá), 因此可以排除轉(zhuǎn)錄后基因沉默[19]。AS208的主要農(nóng)藝性狀和籽粒性狀, 以及清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和LMW-GS的含量與輪選987沒(méi)有差別, 但1Bx20和1By20亞基沉默顯著影響了AS208的粉質(zhì)性狀和面包品質(zhì)[18]。AS208中位點(diǎn)基因沉默的機(jī)制對(duì)小麥籽粒中蛋白體形成和加工相關(guān)基因表達(dá)等的影響還不清楚。本研究利用基因組Southern blot、染色體原位雜交(FISH)、透射電鏡和qRT-PCR技術(shù), 試圖解釋AS208中沉默的機(jī)制, 以及沉默對(duì)蛋白體融合過(guò)程和蛋白體加工相關(guān)基因表達(dá)的影響, 為更好解析小麥谷蛋白品質(zhì)性狀形成的分子機(jī)制提供有價(jià)值的資料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

普通小麥(L., AABBDD)輪選987由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所周陽(yáng)研究員提供; 小麥無(wú)性系變異體AS208由本課題組從輪選987的幼胚培養(yǎng)后代中選育, 其位點(diǎn)上的1Bx20和1By20亞基發(fā)生了沉默[18]。2013年9月28日將兩品種種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所中圃場(chǎng)(北京海淀), 開(kāi)花后連續(xù)對(duì)兩品種未成熟籽粒取樣, 花后第5至第23天, 每2 d取樣一次, 其中在花后第22、25、26、27和29天分別再取樣。樣品經(jīng)液氮速凍后在-80℃冰箱中保存。

1.2 基因組提取和Southern blot檢測(cè)

用CTAB法[20]從AS208和輪選987葉片中提取基因組DNA, 選擇HMW-GS編碼基因內(nèi)部沒(méi)有的4個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶(H I、d III、II和I)對(duì)基因組DNA進(jìn)行消化, 然后進(jìn)行電泳、變性、轉(zhuǎn)膜和預(yù)雜交。以PCR擴(kuò)增的基因1.8 kb的保守序列 (F: 5′-ACCAGGACAATGGCAACAAT CA-3′; R: 5′-TGTTGCCCTCGTCCTGGTTGTT-3′)為探針, 利用地高辛標(biāo)記Southern blotting試劑盒(Roche)檢測(cè)AS208中基因的存在狀態(tài)。

1.3 染色體FISH雜交檢測(cè)

室溫下在無(wú)菌水浸潤(rùn)的濾紙上萌發(fā)種子3~4 d, 取1.5 cm左右生長(zhǎng)旺盛的根尖, 用N2O處理2 h, 加入90%冰醋酸固定10 min。切取根尖生長(zhǎng)點(diǎn)加入1%果膠酶和2%纖維素酶的酶解混合液(溶于1×檸檬酸緩沖液中), 在37℃下酶解54 min。生長(zhǎng)點(diǎn)組織用70%酒精清洗后用解剖針搗碎, 離心后棄去酒精, 再加入30~50 μL冰醋酸, 取7 μL滴在載玻片上制備染色體分裂相。用PCR擴(kuò)增的HMW-GS基因1.8 kb的保守序列作為探針, 采用切口平移法標(biāo)記探針, 向載玻片上標(biāo)記細(xì)胞的區(qū)域滴加8 μL探針, 經(jīng)變性、雜交和染色后顯微觀察[21], 分析AS208中攜帶位點(diǎn)的染色體。

1.4 RNA提取和qRT-PCR分析

在小麥籽粒發(fā)育過(guò)程中涉及到很多轉(zhuǎn)錄因子和分子伴侶的表達(dá), 這些基因的表達(dá)影響著小麥籽粒儲(chǔ)藏蛋白的合成和加工, 進(jìn)而影響小麥品質(zhì)。為了明確AS208中和基因沉默對(duì)小麥種子蛋白合成和加工相關(guān)基因表達(dá)的影響, 選取了4類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子和分子伴侶、、和的12個(gè)基因(、、、、、、、、、、和), 分析它們?cè)贏S208和輪選987籽粒發(fā)育不同時(shí)期的轉(zhuǎn)錄表達(dá)模式。

取-80℃超低溫冰箱中保存的小麥未成熟籽粒, 稱(chēng)取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品60 mg。利用TRIzol Reagent試劑盒(Invitrogen, USA), 根據(jù)說(shuō)明書(shū)提取總RNA, 利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)合成cDNA。對(duì)每品種每樣品進(jìn)行3次qRT-PCR分析, 以作為內(nèi)參基因(NCBI登錄號(hào)為AB050957), 13個(gè)基因的引物信息見(jiàn)表1。采用SYBR PrimeScript RT-PCR Kit (TaKaRa)進(jìn)行qRT-PCR分析, 20 μL反應(yīng)體系中包括10 μL 2× SYBR Premix Ex、2 μL cDNA、0.3 μL混合引物 (10 μmol L-1)、0.4 μL ROX Reference DyeII和7.3 μL ddH2O。用ABI PRISM 7500 (ABI, Los Angeles, CA, USA)進(jìn)行擴(kuò)增, 擴(kuò)增程序?yàn)?5 °C預(yù)變性5 min, 然后95 °C 5 s, 58~63 °C 20 s, 72 °C 20 s, 共40個(gè)循環(huán)。用Bio-Rad CFX Manager軟件分析qRT-PCR結(jié)果。

1.5 透射電鏡樣品制備和蛋白體觀察

為了明確無(wú)性系變異體AS208中1Bx20和1By20缺失對(duì)種子蛋白體融合的影響, 利用透射電鏡觀察AS208開(kāi)花后不同時(shí)間胚乳中蛋白體的融合過(guò)程, 并測(cè)量蛋白體的直徑, 以輪選987未成熟籽粒作為對(duì)照。即將小麥胚乳的中間部分切成2 mm厚的薄片, 置2 mL離心管中, 加入多聚甲醛溶液固定液(含4%多聚甲醛和0.5%戊二醛固定液), 超聲波處理后放于4℃冰箱過(guò)夜固定; 用0.2 mol L-1磷酸緩沖液PBS清洗3次, 每次15 min; 然后依次用30%、50%、70%、80%、85%、90%、95%和100%乙醇梯度脫水各2次, 再用1/3、1/2、2/3樹(shù)脂溶液4℃過(guò)夜?jié)B透, 純樹(shù)脂梯度4℃滲透過(guò)夜2次; 最后將樣品置模具中, 在密閉真空條件下紫外交聯(lián)聚合2 d, 用LKB-800III型超薄切片機(jī)(Sweden)切片, 然后用醋酸鈾?檸檬酸鉛進(jìn)行雙染色, 于H-7500型透射電鏡(Hitachi, Japan)下觀察蛋白體形成過(guò)程, 測(cè)量蛋白體直徑。該實(shí)驗(yàn)在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所完成。

表1 小麥籽粒蛋白體加工相關(guān)基因表達(dá)分析所用引物

2 結(jié)果與分析

2.1 AS208中HMW-GS編碼基因的拷貝數(shù)和編碼位點(diǎn)

分別以AS208和輪選987基因組DNA為模板, 用4種限制性?xún)?nèi)切酶酶切, 并利用基因作為探針進(jìn)行Southern blot分析, 結(jié)果兩品種的Southern blot雜交條帶有明顯差異。AS208經(jīng)H I、d III和II酶切后分別比輪選987少2、1和1條帶(圖1); 而I酶切后, 雖然在兩品種中都顯示特異帶的存在, 但輪選987中的第2條帶明顯比AS208深(圖1), 可能出現(xiàn)了2條雜交帶的重疊現(xiàn)象。Southern blot證據(jù)表明, AS208中1Bx20和1By20亞基沉默由位點(diǎn)丟失導(dǎo)致。

FISH結(jié)果顯示, 輪選987中有3對(duì)染色體出現(xiàn)了雜交信號(hào), 分別在1A、1B和1D染色體上(圖2-A); 而AS208中只有1A和1D染色體上出現(xiàn)了雜交信號(hào), 1B染色體上沒(méi)有檢測(cè)到雜交信號(hào)(圖2-B)。

FISH和Southern blot分析一致表明, AS208的1B染色體上丟失了位點(diǎn)。這一結(jié)果直接印證了AS208丟失位點(diǎn)的推測(cè)[18]。

1~4: 分別用H I、dIII、II和I酶切。箭頭指示輪選987和AS208的差異雜交帶。

1–4: digested withH I,d III,II, andI, respectively. Arrows show the differential hybridizing bands between Lunxuan 987 and AS208.

2.2 1Bx20和1By20亞基缺失對(duì)小麥籽粒中蛋白體融合的影響

利用透射電鏡觀察兩個(gè)品種胚乳中蛋白體在花后籽粒不同發(fā)育階段的融合過(guò)程, 發(fā)現(xiàn)AS208和輪選987的蛋白體融合過(guò)程基本一致, 花后第11天蛋白體開(kāi)始聚合, 花后13~15 d觀察到明顯的融合現(xiàn)象, AS208和輪選987蛋白體直徑分別從2.8 μm和2.6 μm增加到5.2 μm和5.6 μm, 呈圓球形狀; 花后第17天, 兩品種的蛋白體直徑都增大到10 μm以上, 呈橢圓球狀, 花后第19天時(shí)分別達(dá)15.8 μm和15.9 μm; 花后第23天時(shí)整個(gè)胚乳細(xì)胞內(nèi)的蛋白體融合過(guò)程基本完成, 幾乎看不到圓球和橢圓球狀的蛋白單體, 細(xì)胞內(nèi)蛋白體呈現(xiàn)片狀或塊狀(圖3)。由此可見(jiàn), AS208缺失2個(gè)HMW-GS沒(méi)有顯著影響胚乳內(nèi)蛋白體的融合。

紅色箭頭示1A和1D染色體上的FISH信號(hào), 兩品種有相同信號(hào); 白色箭頭示1B染色體上的FISH信號(hào), 僅在輪選987中存在。

The red arrows show the FISH signals on chromosomes 1A and 1D, which were identified in both genotypes. The write arrows show the FISH signals on chromosomes 1B, which were identified only in Luxuan 987.

2.3和缺失對(duì)小麥種子蛋白合成和加工相關(guān)基因表達(dá)的影響

3個(gè)基因在AS208和輪選987中的表達(dá)模式近似倒U形。具體而言, AS208中的表達(dá)模式呈典型的倒U形, 籽粒發(fā)育第15天時(shí)表達(dá)水平最高, 而輪選987中該基因一直處于較高的表達(dá)水平, 直到花后第19天才出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì); 兩品種基因的表達(dá)模式基本一致, 即前期較低, 花后第22天達(dá)到高峰, 之后呈下降趨勢(shì), 但AS208下降較輪選987緩慢;基因在兩品種中表達(dá)趨勢(shì)相近, 其中在AS208中的表達(dá)量呈典型的Λ字型, 在花后第15天時(shí)的表達(dá)量是輪選987中的2倍(圖4)。

3個(gè)基因在兩品種中的表達(dá)模式基本呈遞降趨勢(shì),和尤為明顯, 它們?cè)贏S208中的表達(dá)在開(kāi)花后第9天就達(dá)到較高水平, 而此時(shí)在輪選987中的表達(dá)水平還比較低, 直到花后第11天時(shí)才達(dá)到較高水平, 隨后逐漸下降;在籽粒發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)水平一直較高, 表達(dá)量變化不大, 花后17~19 d表達(dá)量沒(méi)有顯著下降, 而輪選987中在花后第19天的表達(dá)水平已經(jīng)明顯下降。此外,在AS208中的表達(dá)水平較在輪選987中下降慢, 花后第19天時(shí)在AS208中還維持較高水平, 而在輪選987中已經(jīng)顯著下降(圖4)。

3個(gè)基因的表達(dá)模式在AS208中都呈階梯上升模式, 開(kāi)花后的前13 d均處于較低的表達(dá)水平, 17 d后開(kāi)始上升, 25 d時(shí)達(dá)到最高表達(dá)水平; 在輪選987中這3個(gè)基因的表達(dá)水平比AS208中低1.5~2.0倍, 開(kāi)花后17 d后尤為明顯。3個(gè)基因的表達(dá)模式在AS208和輪選987中大體呈現(xiàn)倒U形。在表達(dá)水平方面,基因在AS208和輪選987中基本相近, 而AS208中和基因總體明顯高于輪選987, 特別是開(kāi)花 15 d和17 d時(shí)基因的表達(dá)量在2個(gè)材料中相差約1.0~1.5倍(圖4)。

DPA: 開(kāi)花后天數(shù); PB: 蛋白體; TEM: 透射電鏡。

DPA: days post anthesis; PB: protein body; TEM: transmission electron microscope.

3 討論

小麥中存在3個(gè)編碼HMW-GS的位點(diǎn), 即、和, 分別位于1A、1B和1D染色體長(zhǎng)臂上。小麥無(wú)性系變異體AS208是本課題組從輪選987的幼胚培養(yǎng)后代中鑒定的, 發(fā)現(xiàn)其位點(diǎn)緊密連鎖的和基因沒(méi)有表達(dá)。通過(guò)設(shè)計(jì)特異PCR引物, 沒(méi)有從AS208中擴(kuò)增到和基因的編碼序列和調(diào)控序列, 而輪選987中能擴(kuò)增出這2個(gè)基因的編碼序列和調(diào)控序列, 推測(cè)位點(diǎn)在AS208中發(fā)生了丟失[18]。一般認(rèn)為, 分子雜交可檢測(cè)到與探針序列相似度高于70%的信號(hào),基因高度保守、序列相似度很高, 符合分子雜交檢測(cè)的范圍, 因此利用基因的隨機(jī)擴(kuò)增產(chǎn)物就可以與基因組中所有的基因雜交, 從而檢測(cè)到雜交信號(hào)。本研究進(jìn)一步利用基因的保守序列作為探針, 對(duì)AS208進(jìn)行了Southern blot分析和染色體FISH鑒定, 證明AS208中確實(shí)丟失了和基因的位點(diǎn)。位點(diǎn)的缺失在一定程度影響了小麥籽粒中貯藏蛋白的合成和加工。

小麥貯藏蛋白主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中合成、折疊, 然后貯存在PB中[22]。ER的一個(gè)重要功能是通過(guò)分子伴侶PDI和BiP的作用保證新合成蛋白質(zhì)的質(zhì)量。BiP作為ER的一個(gè)重要分子伴侶在蛋白合成、折疊和組裝中起重要作用[23]。玉米、水稻、擬南芥、南瓜和其他植物中的基因具有高度保守性, 尤其是在一些親緣關(guān)系比較相近的物種中[24]。研究證明, BiP參與高分子量貯藏蛋白合成和應(yīng)激反應(yīng)[25], 它在多聚核糖體中參與形成醇溶蛋白初期鏈的配合物, 使醇溶蛋白保留在內(nèi)腔中, 并促進(jìn)他們折疊和組裝到PB上[26]。各種環(huán)境因素能夠引起ER的應(yīng)激反應(yīng), 包括溫度、光強(qiáng)、干旱、鹽脅迫等, BiP的表達(dá)與ER的應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)。例如, 光強(qiáng)度的改變能夠引起擬南芥特殊組織中BiP表達(dá)水平發(fā)生改變, 進(jìn)而調(diào)節(jié)分泌蛋白的積累水平[27]。利用等位特異PCR (allele-specific PCR, AS-PCR), Johnson和Bhave[28]將小麥中的基因定位在6AS、6BS和6DS染色體上。Zhu等[16]從小麥中克隆了的3個(gè)同源基因, 發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)水平與HMW-GS合成和耐旱性密切相關(guān), 其表達(dá)產(chǎn)物TaBiP主要分布在蛋白體上; 3個(gè)基因隨著HMW-GS亞基表達(dá)的終止表現(xiàn)為明顯的下調(diào)表達(dá)模式, 但干旱脅迫誘導(dǎo)該基因上調(diào)表達(dá);基因在小麥根、莖、葉和籽粒中都有表達(dá), 但在籽粒中表達(dá)量最高。

基因家族編碼許多蛋白二硫鍵異構(gòu)酶和類(lèi)似蛋白二硫鍵異構(gòu)酶的蛋白, 它們包含硫氧還蛋白結(jié)構(gòu)域, 使其可以參與二硫鍵的形成、蛋白折疊和蛋白體的裝配[13-14]。發(fā)現(xiàn)大部分PDI家族主要定位在ER上, 也在其他亞細(xì)胞中檢測(cè)到PDI, 但PDI在這些位置的功能還不清楚[29]。小麥中基因存在3個(gè)拷貝, 分別位于4AL、4BS和4DS染色體上[13]。D’Aloisio等[14]獲得了9個(gè)PDI和PDI類(lèi)似序列, 將PDI家族分為8個(gè)類(lèi)群, 即、、、、、、和。其中,是小麥中典型的PDI, 與一起參與調(diào)節(jié)貯藏蛋白、蛋白體的形成和淀粉合成。高粱中的PDI家族I、II、IV和V與貯藏蛋白折疊有關(guān)[30], 這4類(lèi)家族與小麥中、、和同源, 推測(cè)這4類(lèi)PDI家族也參與了貯藏蛋白折疊。另外,也和葉片組織中的淀粉合成有關(guān),參與種子的建成和胚珠發(fā)育。小麥開(kāi)花授粉6~14 d,基因在發(fā)育的籽粒中組成型高表達(dá), 18~34 d表達(dá)量逐步降低, 并滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中介導(dǎo)二硫鍵的形成[13]。Wang等[17]發(fā)現(xiàn), 在小麥籽粒發(fā)育早期高表達(dá)的、、和, 以及后期高表達(dá)的和可促進(jìn)GMP的正確折疊, 同時(shí)也參與調(diào)節(jié)蛋白體和淀粉顆粒發(fā)育。在短柄草中,基因在不同器官中都表達(dá), 但不同基因在不同器官中的表達(dá)量不同,和在發(fā)育籽粒中的表達(dá)尤其豐富, 說(shuō)明這2個(gè)基因?qū)ΨN子儲(chǔ)藏蛋白的合成和積累非常重要[31]。

是植物所特有的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子, 在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著重要作用。它含有一個(gè)獨(dú)特的Cys殘基的單鋅指保守結(jié)構(gòu)域, 命名為Dof結(jié)構(gòu)域[32]。與其他鋅指蛋白一樣, Dof蛋白也是一個(gè)雙功能結(jié)構(gòu)域。它不僅可以與植物基因啟動(dòng)子DNA結(jié)合, 而且還具有蛋白與蛋白相互作用的功能。Dof蛋白首次被提出只是作為一個(gè)與DNA結(jié)合的蛋白, 但后來(lái)發(fā)現(xiàn)它可以與其他蛋白相互作用[32]。目前, 在多種植物中發(fā)現(xiàn)了Dof蛋白, 它們?cè)诟叩戎参锘虮磉_(dá)調(diào)控中參與醇溶蛋白基因的轉(zhuǎn)錄激活[15]。水稻的轉(zhuǎn)錄因子家族包括30個(gè)基因, 定名為至, 分為4個(gè)亞家族(a、b、c和d亞家族)。擬南芥轉(zhuǎn)錄因子家族包括37個(gè)基因; 體內(nèi)和體外試驗(yàn)結(jié)果表明, Dof蛋白中的Dof結(jié)構(gòu)域與不同植物基因啟動(dòng)子的DNA結(jié)合具有特異性[33]。到目前為止, 除在南瓜中發(fā)現(xiàn)Dof蛋白AOBP (ascorbate oxidase binding protein)特異識(shí)別AGTA序列外, 其他的Dof蛋白都只識(shí)別AAAG或它的互補(bǔ)序列CTTT基序作為核心序列元件[34]。

貯藏蛋白激活因子SPA屬于bZIP類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子, 對(duì)貯藏蛋白基因的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)具有重要調(diào)控作用。Guillaumie 等[35]發(fā)現(xiàn)在位點(diǎn)有2個(gè)位于1BL染色體上的候選基因, 分別是和, 并證明SPA參與HMW-GS的合成, 同時(shí)也參與激活基因的轉(zhuǎn)錄。對(duì)六倍體小麥中的3個(gè)具有部分同源性的基因進(jìn)行序列多態(tài)性分析, 發(fā)現(xiàn)啟動(dòng)區(qū)域多態(tài)性較高, 拷貝數(shù)分別為9個(gè)、7個(gè)和6個(gè), 導(dǎo)致了基因內(nèi)的連鎖不平衡; 但小麥SPA的氨基酸序列高度保守,等位基因與面團(tuán)黏彈性和籽粒硬度顯著相關(guān)[11]。研究還發(fā)現(xiàn),等位變異對(duì)小麥籽粒中醇溶蛋白的分配有重要影響, 并且影響醇溶蛋白和麥谷蛋白的比率[36]。

本研究通過(guò)透射電鏡觀察, 發(fā)現(xiàn)在缺失了1Bx20和1By20的AS208籽粒中, 蛋白體直徑及其變化過(guò)程與對(duì)照品種輪選987非常一致(圖3)。這一現(xiàn)象的原因可能是, AS208中2個(gè)HMW-GS亞基1Bx20和1By20的沉默可能刺激了其他貯藏蛋白基因的表達(dá)與分泌, 即通過(guò)其他貯藏蛋白的替代/互補(bǔ)作用, 保證了胚乳中蛋白體的融合。AS208中籽粒蛋白總量略高于輪選987是這一假設(shè)的有力佐證[18]。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn),、、和的表達(dá)模式在兩品種中基本一致, 但是除、、和外, 其他基因在AS208中的表達(dá)量都比在輪選987中高(圖4)。結(jié)合透射電鏡觀察結(jié)果, 我們認(rèn)為AS208中2個(gè)基因沉默沒(méi)有影響種子內(nèi)蛋白體的形成與融合(圖3), 可能是因?yàn)槠渲?個(gè)基因沉默刺激了上述4類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子和分子伴侶在籽粒灌漿期的表達(dá), 即通過(guò)其他貯藏蛋白的替代/互補(bǔ)作用, 保證了種子內(nèi)蛋白含量、蛋白體外形和大小基本不變, 表現(xiàn)為負(fù)反饋調(diào)節(jié)效應(yīng)。

4 結(jié)論

AS208中1Bx20、1By20亞基的沉默由于組織培養(yǎng)過(guò)程中位點(diǎn)的丟失導(dǎo)致, Southern blot和FISH技術(shù)可用于鑒定小麥基因組中拷貝數(shù)較少的內(nèi)源基因。與籽粒蛋白質(zhì)合成與加工相關(guān)的12個(gè)基因在小麥籽粒灌漿過(guò)程中, 7個(gè)表達(dá)模式在AS208和輪選987中一致, 8個(gè)表達(dá)水平在AS208中比輪選987高, 表明小麥位點(diǎn)的基因缺失對(duì)種子中蛋白體的形成沒(méi)有明顯影響, 但促進(jìn)了儲(chǔ)藏蛋白合成與加工相關(guān)基因的表達(dá)。

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Silencing Influences Protein Body Formation and Expression of Genes Regulating Synthesis and Processing of Seed-Storage Protein in Somatic Mutant Wheat AS208

LIU Hui-Yun1,**, WANG Wan-Qing2,**, LI Xin1, WANG Ke1, WANG Long3, DU Li-Pu1, YANG Yue-Ming2,*, and YE Xing-Guo1,*

1Institute of Crop Science, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Beijing 100081, China;2College of Life Science, Capital Normal University, Beijing 100048, China;3Institute of Genetics and Developmental Biology, Chinese Academy of Sciences / State Key Laboratory of Plant Cell and Chromosome Engineering, Beijing 100101, China

High-molecular-weight-glutenin subunits (HMW-GSs) are important components of seed storage proteins in grains of wheat (L.), which determine wheat dough elasticity and processing quality. Using AS208, a wheat somatic variation line with silencedandatlocus, and its originating cultivar Lunxuan 987, we studied the present status of, protein body (PB) formation progress, and expression trends of four kinds of genes (,,, and) related to glutenin synthesis and accumulation at different stages of grain development. Southern blotting analysis revealed that AS208 had two specific bands less than its control parent Lunxuan 987. The fluorescencehybridization (FISH) assay showed six and four chromosomes with signals in Lunxuan 987 and AS208, respectively. These results indicate that thelocus has been deleted from the genome of AS208. Compared to Lunxuan 987, AS208 showed similar size and shape of seed PB during PB formation under a transmission electron microscope (TEM). A total of 12 transcription-factor or molecular-chaperone genes were subjected to qRT-PCR assay. These genes were related to glutenin coding genes expression, storage proteins accumulation and processing, PB assembling and transportation. Seven out of 12 genes had simialr expression patterns in AS208 and Lunxuan 987, and eight geneswere expressed more in AS208 than in Lunxuan 987, especially the expression levels of,,andwere 1.5–2.0 folds higher in AS208 than in Lunxuan 987. These results suggested thatsilencing had no significant effect on the formation of PB during wheat grain development, but partially spurred the expression of some genes regulating the synthesis and processing of seed-storage proteins. As a result, via a negative feedback regulation pathway, the protein content in seed and the shape and size of PB remain in similar levels between AS208 and its originating cultivar.

Wheat; High molecular weight glutenin subunits; Protein body; Transcription factor; Molecular chaperones

10.3724/SP.J.1006.2017.00691

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371621)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31371621).

(Corresponding authors): 晏月明, E-mail: yanym2004@163.com; 葉興國(guó), E-mail: yexingguo@caas.cn

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equality to this work)

(收稿日期): 2016-04-24; Accepted(接受日期): 2016-11-03; Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2016-12-02.

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20161202.1437.002.html