張祎，孫凱

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

兔病毒性出血癥病毒YM 株衣殼蛋白基因的克隆和中國(guó)分離株的遺傳變異分析

張祎，孫凱

（哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司，哈爾濱 150069）

應(yīng)用RT-PCR的方法從某兔場(chǎng)病死兔肝臟組織中分離到RHDV，命名YM株。克隆出衣殼蛋白VP60并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示VP60全長(zhǎng)1 740 bp，編碼579個(gè)氨基酸。從GenBank下載包括EBHSV、RCV、RHDV共45條序列，運(yùn)用生物信息學(xué)軟件分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)和氨基酸同源性比較，世界不同地區(qū)RHDV分離株氨基酸保守性較高，可達(dá)94.1%～99.7%，EBHSV與RHDV氨基酸同源性約為75%，而RCV與RHDV的同源性＞90%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析顯示，所選的RHDV可分為兩個(gè)基因群，一組是包括WX-84的經(jīng)典RHDV群，另一組是抗原變異RHDVa群，包括了除WX/84其余所有的中國(guó)分離株。總的來(lái)說(shuō)RHDVa已經(jīng)替代經(jīng)典的RHDV在中國(guó)流行。

RHDV；RHDVa；VP60；系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)；序列分析

兔病毒性出血癥（RHD）俗稱“兔瘟”，該病引起了大量家兔的死亡，造成了毀滅性的經(jīng)濟(jì)損失，隨后世界多數(shù)國(guó)家均有該病的報(bào)道。引起RHD的病原體是兔出血癥病毒（RHDV），屬于杯狀病毒科兔病毒屬。與RHDV相似的病毒還有歐洲野兔綜合癥病毒（EBHSV），只感染歐洲野兔屬。而與RHDV親緣關(guān)系最近的是一種無(wú)病原性的杯狀病毒（RCV），RHDV、RCV、EBHSV三種病毒同屬于杯狀病毒科。盡管目前防治本病的唯一手段就是接種組織滅活苗，但是疫苗的質(zhì)量良莠不齊，缺乏科學(xué)的免疫程序，造成該病仍舊呈地方性流行。2016年，從病死兔肝臟中發(fā)現(xiàn)，癥狀疑似兔瘟，據(jù)悉該小型兔場(chǎng)使用了兔瘟-巴氏桿菌二聯(lián)滅活疫苗，為弄清發(fā)病原因，對(duì)病毒進(jìn)行分離鑒定，并進(jìn)行序列分析，以研究RHDV是否發(fā)生變異。

1 試驗(yàn)材料

1.1 病料及菌株

病料為某兔場(chǎng)病死兔肝臟，疑為兔瘟。質(zhì)粒與菌株：pMD18-T載體購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；大腸桿菌感受態(tài)JM109為哈藥疫苗自制，菌種由研究所保存。

1.2 主要試劑

LA Taq DNA聚合酶、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；T4 DNA連接酶購(gòu)自NEB公司；質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、Gel Extract Mini試劑盒購(gòu)自上海華舜生物工程公司；RNeasy plus Mini Kit購(gòu)自QIAGEN公司。人“O”型紅細(xì)胞由哈爾濱紅十字血液中心提供。兔源抗RHDV高免血清由哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心惠贈(zèng)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 病料的處理及病毒的分離鑒定2.1.1病料的處理

將病死兔肝臟稱量后，用滅菌的0.01 M PBS（pH 7.4，含EDTA 1 mM）1∶4（W/V）稀釋后研磨，將產(chǎn)物-20℃反復(fù)凍融3次，4℃4 000 r·min-1離心30 min，取上清用0.22 μm濾器過(guò)濾后作為待檢樣品，于-20℃冰箱保存。

2.1.2 病毒的鑒定

血凝試驗(yàn)（HA）和血凝抑制試驗(yàn)（HI）：取粗提病毒按文獻(xiàn)方法進(jìn)行HA和HI試驗(yàn)。1%人“O”型血紅細(xì)胞的制備：取2mL人“O”型抗凝血液，用滅菌生理鹽水洗滌，每次常溫2 000 r·min-1離心10 min，共洗滌3次，取最后一次紅細(xì)胞泥20μL懸于2mL生理鹽水中，混勻后4℃冰箱保存?zhèn)溆茫纱娣?d。

2.1.3 家兔接種實(shí)驗(yàn)

將體重約2 kg，6～8周齡的RHDV陰性健康家兔4只隨機(jī)分成兩組，3只攻毒，1只對(duì)照。取待檢樣品1 mL皮下注射攻毒組，38 h家兔死亡后無(wú)菌解剖，觀察病變，取兔肝臟，按照上述方法制備粗提病毒液，-80℃保存。

2.2 VP60基因的克隆及序列分析

2.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank已收錄的我國(guó)NJ/China/1985株（AY269825）RHDV的VP60基因序列進(jìn)行比對(duì)后，找到序列的保守區(qū)，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物P1、P2，P1：5'-gcagatcgtaagagagtcgt-3'，P2：5'-gcaa gtcccaatccgatgaa-3'。擴(kuò)增含VP60全長(zhǎng)的1 815 bp基因片段（相當(dāng)于全基因組5 251～7 065 nt，其中VP60基因相當(dāng)于全基因組5 305～7 044 nt共1 740 bp）送往上海英駿生物技術(shù)有限公司合成引物。

2.2.2 目的基因的擴(kuò)增

兔出血癥病毒RNA的提?。簾o(wú)菌研磨肝組織病料，收集漿液，4℃12 000 r·min-1離心10 min，吸取上清300 μL，按照RNeasy plus Mini Kit說(shuō)明書提取病毒RNA。-20℃保存。

兔出血癥病毒cDNA的合成與目的基因的PCR擴(kuò)增：以病毒RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為：（20 μL體系）RNA 10.5 μL，dNTP 2 μL，AMV 2 μL，5×AMV buffer 4 μL，抑制劑0.5 μL，引物1 μL，室溫作用10min，42℃作用1 h，70°C15 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，以此產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系為50 μL：去離子水34.5 μL，模板2μL、LA Taq DNA聚合酶0.5μL、10×PCR Buffer 5μL、2.5 mM dNTP4μL、P1引物2μL、P2引物2μL；反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：95℃5 min；94℃30 s，55℃40 s，72℃2 min，30個(gè)循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，切膠后用試劑盒純化回收。

2.2.3 PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定

將純化的PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體16℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞。提取質(zhì)粒，命名為YM-VP60。質(zhì)粒經(jīng)PCR鑒定正確后送往上海英駿公司測(cè)序。

2.2.4 VP60基因的生物信息學(xué)分析

參考RHDV、EBHSV、RCV毒株序列資料見(jiàn)附表。

從GenBank上下載包括RHDV、EBHSV、RCV共46條RHDV基因序列（包括RHDV全基因組序列和本次試驗(yàn)分離株YM），用DNAStar軟件截取所有序列的VP60完整閱讀框。利用DNAStar、Clustal X和Mega 4個(gè)軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的繪制和氨基酸變異分析。

附表參考RHDV、EBHSV、RCV毒株序列資料

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 兔出血癥病毒的分離鑒定

3.1.1 敏感兔接種試驗(yàn)

結(jié)果表明，攻毒組3只兔體溫均升高至41℃以上，于24～38 h內(nèi)全部死亡，死兔肛門松弛，流出少量淡黃色的粘性稀便。剖檢后可見(jiàn)各臟器有不同程度的出血及水腫，胃黏膜脫落，出血斑明顯。對(duì)照兔健康存活。

3.1.2 HA和HI試驗(yàn)

HA試驗(yàn)測(cè)得粗提病毒液的血凝價(jià)為1∶1 024，該樣品能夠凝集人的“O”型紅細(xì)胞，該血凝特性能被兔病毒性出血癥高免血清所抑制，初步判斷該病毒為兔病毒性出血癥病毒。

3.2 兔出血癥病毒cDNA的合成與目的基因的PCR擴(kuò)增

目的基因片段RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果凝膠電泳圖見(jiàn)圖1。

圖1 目的基因片段RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果凝膠電泳

以RHDV cDNA為模板，P1、P2為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在約1 800 bp位置有DNA條帶，與目的基因1 815 bp條帶大小相符。PCR產(chǎn)物通過(guò)切膠試劑盒純化與pMD18-T載體連接轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)。經(jīng)PCR鑒定在1 700 bp位置有DNA條帶。

3.3 YM株VP60基因的序列測(cè)定及生物信息學(xué)分析

YM株VP60基因的序列測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，YM株VP60基因完整閱讀框長(zhǎng)1 740 bp，編碼579個(gè)氨基酸。

為了分析中國(guó)毒株的流行特性，選取所有可獲得的12株中國(guó)分離株VP60基因部分及國(guó)外的29株RHDV、2株EBHSV和1株RCV的VP60部分。經(jīng)過(guò)氨基酸同源性比較后發(fā)現(xiàn)，RHDV與EBHSV的氨基酸同源性約75%，而RCV與RHDV的同源性＞90%。中外RHDV分離株的衣殼蛋白的核苷酸同源性在89.1%～98.7%，氨基酸同源性在94.0%～99.8%。中國(guó)RHDV各分離株之間的核苷酸同源性在92.2%～99.4%，其中WX/84與其余11株分離株的氨基酸同源性僅約為95%，而其余毒株之間的氨基酸同源性很高均＞98%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果顯示，EBHSV處于獨(dú)立的分支，RCV進(jìn)化地位則更接近于RHDV。值得注意的是N11株，是2011年由G. Le-Recule等在西班牙檢測(cè)到一株非典型性的兔瘟病毒，被歸為RHDV2，獨(dú)立于傳統(tǒng)的RHDV毒株，卻可以引起幼兔和野兔兔瘟大面積流行。43株RH?DV參考毒株可被分為2個(gè)明顯的基因群：A亞群和B亞群。其中A亞群為經(jīng)典的RHDV，各分離株之間沒(méi)有明顯的地域與時(shí)間的關(guān)聯(lián)，中國(guó)的第1株分離株WX/84就包含在A群中。而中國(guó)另外11個(gè)RHDV分離株則處在B亞群，即RHDVa亞群，提示中國(guó)各RHDV分離株之間有較近的親緣關(guān)系。

4 討論

RHDV由于保守度較高，認(rèn)為只有一種血清型，然而1997年Capucci等分離到一種新的抗原變異株命名為RHDVa。在意大利，RHDVa已經(jīng)替代了傳統(tǒng)的RHDV在田間流行。2003年法國(guó)鑒定的兩株病毒也均為RHDVa[1]。2004年末OIE首次報(bào)道了RHDVa在烏拉圭的流行，同年在荷蘭的野兔中分離到RHDVa[2]。古巴于2004—2005年曾大面積的爆發(fā)兔瘟，采集病料后經(jīng)競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)，同樣證明是由變異株RHDVa引起的[3]。2011年，G. Le-Recule等在西班牙檢測(cè)到一株非典型性的兔瘟病毒，被命名為RHDV2，將該變異株進(jìn)行測(cè)序，命名為RHDV-N11，該病毒能夠?qū)е碌腿正g的幼兔發(fā)病[7]。隨后該病在意大利、德國(guó)等歐洲范圍內(nèi)迅速傳播，目前中國(guó)還并未有RHDV2流行的報(bào)道，但應(yīng)引起關(guān)注[8-10]。

RHD首次報(bào)道于中國(guó)，但是一些學(xué)者經(jīng)過(guò)血清學(xué)研究認(rèn)為，RHDV并不是第一次出現(xiàn)在中國(guó)，也不是從中國(guó)傳播到其他國(guó)家而引起世界范圍的流行[11]。歐洲對(duì)1984年前保存的兔血清進(jìn)行回顧性分析，數(shù)據(jù)表明在1975—1987年，英國(guó)、新西蘭和澳大利亞的野兔和家兔分離的血清中都存在RHD的抗體，表明該病毒在歐洲的兔群中已經(jīng)存在多年，但當(dāng)時(shí)歐洲的兔群中并沒(méi)有爆發(fā)RHD[4-5]。在另一項(xiàng)調(diào)查中指出，英國(guó)在1955年的兔血清中就存在與RHDV相關(guān)的RNA粒子，其序列與RHDV中部分衣殼蛋白序列十分相似，推測(cè)這種無(wú)病原性的毒株是由野兔攜帶的，更加表明了歐洲在很早就存在RHDV樣病毒[6]。中國(guó)在20世紀(jì)80年代初從德國(guó)大量引進(jìn)長(zhǎng)毛兔，有人推測(cè)1984年在國(guó)內(nèi)爆發(fā)的RHD很有可能是存在于歐洲但無(wú)致病性的野兔和家兔中的RCV突變或同源重組成高致病性的RHDV引起了疫病的爆發(fā)。由此推斷，RHDV可能以無(wú)病原性的毒株在其他國(guó)家流行很多年，最終經(jīng)過(guò)基因同源重組形成具有高致病性的病毒。

圖2 YM株VP60基因的序列測(cè)定

盡管一些研究者已對(duì)中國(guó)部分RHDV分離株做過(guò)生物信息學(xué)上的研究，但沒(méi)有明確提出中國(guó)RH?DVa變異株的流行現(xiàn)狀[12-13]。本文將試驗(yàn)分離株YM及GenBank上可獲得的全部11株中國(guó)的RHDV VP60基因和篩選其他國(guó)家不同時(shí)段的29株毒株進(jìn)行基因比對(duì)，探討中國(guó)RHDV的生物學(xué)特性和遺傳變異分析。從RHDV系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，RHDVa群主要包含了中國(guó)、韓國(guó)、日本這些亞洲國(guó)家的分離株，以及美國(guó)、古巴和法國(guó)的00-Reu、99-05兩株分離株。韓國(guó)的學(xué)者已證明1985年在韓國(guó)流行的RHDVa與中國(guó)的兔毛皮輸入有關(guān)，由此可推測(cè)亞洲的這些分離株可能來(lái)源于同一毒株。對(duì)于中國(guó)來(lái)說(shuō)，1984年首次報(bào)道RHDV的流行，次年NJ/ China/1985株就已經(jīng)是RHDVa變異株了，隨后所有的分離株均屬于RHDVa群，因此RHDVa已經(jīng)在中國(guó)流行很多年。

VP60氨基酸序列可被分為6個(gè)區(qū)域，分別為A（1～21aa）、B（22～300aa）、C（301～328aa）、D（329～343aa）、E（344～434aa）、F（435～580aa）。本次試驗(yàn)分離株YM株在A區(qū)的變化主要體現(xiàn)在第7位氨基酸上，RHDV經(jīng)典株在2000年前，此位點(diǎn)主要為Ala，而后變?yōu)門hr，澳大利亞與新西蘭的分離株此位點(diǎn)也為Ala，可能與島國(guó)環(huán)境較封閉有關(guān)。B區(qū)有4處主要變化，分別位于37aa、50aa、207aa和219aa。C區(qū)和E區(qū)變異率較高，主要體現(xiàn)在的305～309aa、346～386aa和412～434aa區(qū)域有較大的變異，F(xiàn)區(qū)的476～480aa。這種氨基酸的變異呈現(xiàn)出明顯的規(guī)律性變化，其區(qū)分的依據(jù)就是RHDV和RHD?Va兩個(gè)亞群的不同。在對(duì)VP60的抗原結(jié)構(gòu)進(jìn)行了詳細(xì)研究中發(fā)現(xiàn)，VP60蛋白上有兩個(gè)主要抗原區(qū)域，分別位于VP60蛋白N端的31～250aa和C端的477～579aa，但最主要的抗原區(qū)可能位于VP60蛋白N端的前175個(gè)氨基酸。在變異株RHDVa中，可看出在前200個(gè)氨基酸中只發(fā)生了3個(gè)氨基酸點(diǎn)的突變，因此抗原性沒(méi)有發(fā)生明顯的變化。這也可以解釋傳統(tǒng)的組織滅活苗仍舊可以起到很好的保護(hù)作用。

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Cloning and Sequence Analyzing of the Capsid Protein Gene of Rabbit Hemorrhagic Disease Virus Strain YM

ZHANG Yi,SUN Kai

（Biological Vaccine of Harbin Pharmaceutical Group Co.,Ltd.,Harbin 150069,China）

The rabbit hemorrhagic disease virus was obtained in the liver sample from a dead rabbit and named strain YM.The sequenceanalysis showedthat the nucleotidesequenceof VP60 gene of YM was 1 740 bp long and en?coded a protein of 579 amino acids.We downloaded 45 published RHDV,RCV,RHDV VP60 gene isolated sequences from GenBank and then constructed phylogenetic tree and drawn homology and divergence form by bioinformatics soft?ware.Sequence comparison with other published RHDV VP60 genes showed that the homology of the amino acids was between 94.1%and 99.7%.The result showed that the RHDV VP60 gene was highly conserved.The amino acids ho?mology between the RHDV and EBHSV groups was about 75%,but the rate between the RHDV and RCV groups was above 90%.It showed that RHDV and RCV were more closely related to each other than any other calicivirus.These strains could be divided into 2 gene groups,one group was a classic RHDV including the strain WX-84,the other group was a antigenic variation RHDVa and it included all the Chinese isolates except WX-84.Overall RHDVa had replacedtheclassicRHDVwhichpopularinChina.

RHDV;RHDVa;VP60;phylogenetic tree;sequence analysis

S829.1；S852.65

A

1001-0084（2017）04-0024-06

2017-03-22

張祎（1984-），女，黑龍江哈爾濱人，碩士研究生，研究方向?yàn)楂F醫(yī)微生物與免疫。