吳艷婷，陳 云，劉海亭，吳瑩瑩，吳 偉，劉新燦

·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)論著/研究·

參松養(yǎng)心膠囊和穩(wěn)心顆粒對大鼠心肌纖維化的影響及其抗心律失常的機制研究

吳艷婷，陳 云，劉海亭，吳瑩瑩，吳 偉，劉新燦

目的 探討參松養(yǎng)心膠囊和穩(wěn)心顆粒對大鼠心肌纖維化的影響及其抗心律失常的機制。方法 選取自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)40只隨機分為4組，每組10只，對照組(C組，正常飼料喂養(yǎng))，纈沙坦組(VAL組，纈沙坦膠囊內(nèi)容物混合飼料喂養(yǎng))，參松養(yǎng)心膠囊組(SHEN組，參松養(yǎng)心膠囊內(nèi)容物混合飼料喂養(yǎng))，穩(wěn)心顆粒組(WEN組，穩(wěn)心顆?；旌巷暳衔桂B(yǎng))。喂養(yǎng)2個月后，進(jìn)行心室內(nèi)快速刺激，記錄心律失常發(fā)生。之后處死大鼠，進(jìn)行左心室組織切片，染色處理，觀察各組切片纖維化程度，并采用免疫組化測定心肌細(xì)胞縫隙連接蛋白(Cx43)及基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)表達(dá)程度，進(jìn)行比較。結(jié)果 喂養(yǎng)2個月后，VAL組、SHEN組及WEN組心律失常誘發(fā)次數(shù)均較C組明顯減少(P<0.05)；圖像定量分析顯示VAL組、SHEN組及WEN組Cx43增高，MMP-2和組織金屬蛋白酶抑制因子-2(TIMP-2)和熒光信號的面積百分比及積分光密度值較C組明顯降低(P<0.05)，且排列相對清晰。結(jié)論 參松養(yǎng)心膠囊及穩(wěn)心顆粒具有改善心肌重構(gòu)的作用，能延緩心肌纖維化發(fā)展，降低致命性心律失常的發(fā)生率；其機制可能與增加Cx43及MMP-2的表達(dá)有關(guān)。

室性心律失常；參松養(yǎng)心膠囊；穩(wěn)心顆粒；心肌纖維化；縫隙連接蛋白；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；組織金屬蛋白酶抑制因子-2

心律失常是臨床上一種常見病、多發(fā)病，隨著對心律失常認(rèn)識的加深，發(fā)現(xiàn)其發(fā)病機制主要是心肌電活動紊亂，并與心肌纖維化程度呈正相關(guān)[1]。心肌纖維化增加和心肌組織電興奮的離散度，導(dǎo)致心律失常發(fā)生。

隨著心肌纖維化程度的增加，伴隨縫隙連接蛋白(connexin43，Cx43)表達(dá)減弱[2]、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)表達(dá)增多和組織金屬蛋白酶抑制因子-2(tissue inhibitor matrix metauoproteinase-2，TIMP-2)表達(dá)減少，心律失常發(fā)病率明顯增高，并增加病人猝死風(fēng)險[3]。

目前，臨床上常用的抗心律失常藥物主要有鈉通道阻滯劑、β受體阻滯劑、鈣通道阻滯劑，這些藥物通過阻斷相關(guān)離子通道以減少心律失常發(fā)生，但這些藥物有嚴(yán)重致心律失常作用。有研究發(fā)現(xiàn)，血管緊張素抑制劑[4]、血管緊張素受體拮抗劑[5]類抗高血壓藥，可延緩高血壓病人心肌重構(gòu)，改善病人心衰癥狀，病人相應(yīng)的致命性心律失常發(fā)病率明顯下降，預(yù)后明顯改善。解剖上，中層心肌與心外膜下心肌及心內(nèi)膜下心肌之間交界面處存在心肌結(jié)構(gòu)差異性，使三層心肌之間的單相動作電位復(fù)極速度和傳導(dǎo)速度均有差別，這為左心室心肌壁內(nèi)心電折返形成提供重要的解剖基礎(chǔ)[6]。研究表明，改善心肌重構(gòu)作用藥物可適當(dāng)延緩心肌纖維化的發(fā)展，從而降低致命性心律失常的發(fā)生率[7-8]。

中藥治療疾病具有多環(huán)節(jié)，多靶點作用機制的特點，本研究通過觀察中藥參松養(yǎng)心顆粒[9]和穩(wěn)心顆粒[10]對心肌纖維化的影響，以探討中藥抗心律失常的作用機制。為中醫(yī)藥治療心律失常的研究開辟新的研究途徑，進(jìn)一步發(fā)展中醫(yī)藥事業(yè)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 自發(fā)性高血壓(SHR)大鼠40只，雌雄各半，體重250 g～370 g，SPF級，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗。

1.2 藥品、試劑和儀器 纈沙坦膠囊為北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)，參松養(yǎng)心膠囊為石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，穩(wěn)心顆粒為山東步長制藥有限公司生產(chǎn)；抗Cx43單克隆抗體，產(chǎn)品編號為MAB3067，Millipore公司生產(chǎn)；抗MMP-2抗體購自晶美公司，產(chǎn)品編號為JMA0816；抗TIMP-2抗體購自晶美公司，產(chǎn)品編號為JXC5273。ViVi7型彩色多普勒超聲診斷儀(美國GE公司)、Power Lab30血流動力學(xué)數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)(AD instruments)、無創(chuàng)尾動脈血壓測定儀(Visitech Systems，BP-2000)，激光掃描共聚焦顯微鏡(Olympus，F(xiàn)V1000-IX81)、熒光顯微鏡(Olympus，BX41)。

1.3 方法 將40只SHR大鼠隨機分為對照組(正常飼料喂養(yǎng)，C組)、纈沙坦組(纈沙坦膠囊內(nèi)容物混合飼料喂養(yǎng)，VAL組)、參松養(yǎng)心膠囊組(參松養(yǎng)心膠囊內(nèi)容物混合飼料喂養(yǎng)，SHEN組)、穩(wěn)心顆粒組(穩(wěn)心顆?；旌巷暳衔桂B(yǎng)，WEN組)，每組10只。適應(yīng)性給予正常飲食1周后，開始2個月不同飼料喂養(yǎng)。

1.4 指標(biāo)測定

1.4.1 心律失常誘發(fā)次數(shù) 將大鼠進(jìn)行腹腔麻醉后固定、行氣管插管。連接肢體導(dǎo)聯(lián)心電圖后，描記正常狀態(tài)下的心電活動情況，之后經(jīng)左前胸第3肋、4肋間開

胸并暴露心臟，以雙極針刺入左室心尖部作為刺激電極，進(jìn)行程序電刺激以誘發(fā)室性心律失常并記錄心電活動情況，電生理參數(shù)采用BL-420生物信號采集與處理系統(tǒng)記錄。程序電刺激S1S1周長為100 ms，波寬2 ms，電壓5 mV，脈沖數(shù)為8個；S2強度為5 mV，波寬為2 ms，脈沖數(shù)為1個，步長為-2 ms，直至S2后不再出現(xiàn)R2，即不應(yīng)期或誘發(fā)出室性心律失常。若未能誘發(fā)室性心律失常，將S1S2間期設(shè)為不應(yīng)期加10 ms，并加用期前刺激S3，以2 ms遞減刺激直到不應(yīng)期或誘發(fā)出室性心律失常。此處室性心律失常特指連續(xù)出現(xiàn)6個及6個以上寬QRS波的室性心動過速(室速)或心室顫動(室顫)。

1.4.2 心臟重量指數(shù) 所有大鼠于心臟電刺激誘發(fā)室性心律失常后取出心臟，以冰生理鹽水反復(fù)沖洗，再用濾紙吸干水分，電子天平稱全心重量和左心室重量，心臟重量與體重比值即為心臟重量指數(shù)；左心室重量與體重比值即為左心室重量指數(shù)。

1.4.3 膠原容積分?jǐn)?shù) 取近心尖部左心室組織，中性甲醛常規(guī)固定、梯度乙醇脫水、石蠟包埋和切片，進(jìn)行Masson染色，采用圖像分析軟件隨機選取5個視野，測定心肌間質(zhì)膠原容積分?jǐn)?shù)(膠原面積/心肌總面積)，取其均值。1.4.4 免疫組化法分析檢測Cx43，MMP-2及TIMP-2 將心肌組織固定，脫水，石蠟包埋，制成5 μm切片，每個心肌蠟塊制備5張切片。隨后按照說明書步驟進(jìn)行操作，其中分別以抗Cx43單克隆抗體，抗MMP-2抗體及抗TIMP-2抗體以1∶100稀釋，顯微鏡下滴加DAB顯色，陰性對照用PBS代替一抗。每張切片取4個視野，逐層掃描獲取圖像，將獲取的厚圖像去除背景，留下真正熒光染色部分以供分析。采用Image Pro Plus 6.0軟件分析熒光強度，計算當(dāng)前視野下Cx43、MMP-2及TIMP-2面積百分比及積分光密度。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠心律失常誘發(fā)次數(shù)比較 VAL組、SHEN組及WEN組心律失常誘發(fā)次數(shù)均較C組明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SHEN組即WEN組心律失常誘發(fā)次數(shù)與VAL組比較，差異無統(tǒng)

計學(xué)意義(P>0.05)。詳見圖1、表1。

注：A為室速；B為室顫。圖1 程序電刺激誘發(fā)的室性心律失常表1 各組大鼠心律失常誘發(fā)次數(shù)比較

2.2 各組大鼠心臟重量指數(shù)和左心室重量指數(shù)比較 VAL組、SHEN組及WEN組心臟重量指數(shù)、左心室重量指數(shù)均小于C組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與VAL組比較，SHEN組及WEN組心臟重量指數(shù)、左心室重量指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組大鼠心臟重量指數(shù)和 左心室重量指數(shù)比較(±s) mg/g

2.3 各組大鼠心肌細(xì)胞Cx43(面積)比較 正常心肌細(xì)胞的Cx43線性規(guī)律分布于心肌細(xì)胞閏盤處，免疫組化染色陽性呈棕黃色。大鼠心肌細(xì)胞中Cx43含量，VAL組、SHEN組、WEN組與C組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SHEN組、WEN組與VAL組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

2.4 大鼠心肌細(xì)胞MMP-2含量(面積)比較 VAL組、SHEN組、WEN組與C組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；SHEN組、WEN組與VAL組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

2.5 大鼠心肌細(xì)胞TIMP-2含量(面積)比較 VAL組、SHEN組與C組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；WEN組、SHEN組與VAL組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 各組大鼠Cx43、MMP-2、 TIMP-2含量(面積)比較(±s) %

3 討 論

高血壓病引起的心室重塑是慢性心力衰竭的重要環(huán)節(jié)，而心肌纖維化和Cx43、MMP-2及TIMP-2表達(dá)改變是心室重塑的重要表現(xiàn)形式。心肌纖維化可導(dǎo)致心臟舒張、收縮功能障礙，還可導(dǎo)致心律失常發(fā)生[11-13]。Cx43表達(dá)量減少、非均勻化及側(cè)面化認(rèn)為是Cx43重構(gòu)的表現(xiàn)形式。Cx43表達(dá)量減少和非均勻化可改變電傳導(dǎo)同向性，使電傳導(dǎo)速率降低，且易形成折返，導(dǎo)致心律失常；而其側(cè)面化，可引起延遲后去極化[14-15]。而MMP-2是膠原降解成小分子多肽的關(guān)鍵酶，在生理狀態(tài)下與其特異性抑制劑TIMP-2處于相對平衡狀態(tài)，使細(xì)胞外基質(zhì)降解與合成達(dá)到動態(tài)平衡。心肌纖維化發(fā)生時可見MMP-2表達(dá)增多和TIMP-2表達(dá)減少。病理條件下心肌CX43、MMP-2及TIMP-2重塑構(gòu)成心律失常的部分基礎(chǔ)。

參松養(yǎng)心膠囊及穩(wěn)心顆粒是祖國醫(yī)學(xué)的產(chǎn)物，是心律失常治療的重要補充手段，但其作用機制尚不明確。參松養(yǎng)心膠囊是依據(jù)絡(luò)病學(xué)理論，由人參、麥冬、山茱萸、丹參、酸棗仁、桑寄生、赤芍、土鱉蟲、甘松、黃連、五味子、龍骨研制而成的一種復(fù)方制劑。既往研究表明，參松養(yǎng)心膠囊具有減輕糖尿病大鼠心室電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)并抑制室性心律失常的作用[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以參松養(yǎng)心膠囊喂養(yǎng)SHR大鼠可增強Cx43表達(dá)，改善心肌纖維化從而減少室性心律失常發(fā)生。穩(wěn)心顆粒是由黨參、黃精、三七、甘松、琥珀等制成，具有益氣養(yǎng)陰、定悸復(fù)脈、活血化瘀的功效，具有很好抗心律失常作用[17]。郭繼鴻等[18-20]研究證實穩(wěn)心顆粒中的纈草酮具有膜穩(wěn)定作用，能延長動作電位時程，抑制折返形成與維持。美國Main Line Health Heart中心嚴(yán)干新教授進(jìn)行穩(wěn)心顆粒阻斷多種離子通道作用，再次證實穩(wěn)心顆粒具有多種離子通道的阻斷作用。而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)表明，小檗堿、苦參堿等一些中藥成分可明顯改善心臟離子通道功能紊亂，具有明顯的多個離子通道靶點作用特點[21]。通過本研究驗證穩(wěn)心

顆?？赏ㄟ^抑制MMP-2表達(dá)和增強TIMP-2表達(dá)而改善心肌纖維化，從而減少室性心律失常發(fā)生。

張衛(wèi)澤等[22]研究已證明纈沙坦有誘導(dǎo)大鼠心肌Cx43表達(dá)，減少MMP-2表達(dá)和增強TIMP-2表達(dá)。本研究通過與纈沙坦組用藥比較，表明參松養(yǎng)心膠囊及穩(wěn)心顆粒均通過誘導(dǎo)Cx43表達(dá)，減少XMMP-2表達(dá)和增強TIMP-2表達(dá)而減輕心肌纖維化、延緩心室重塑，從而降低室性心律失常發(fā)生率。參松養(yǎng)心膠囊主要通過增強Cx43表達(dá)而改善心肌纖維化從而減少室性心律失常的發(fā)生；穩(wěn)心顆粒主要通過抑制MMP-2表達(dá)和增強TIMP-2表達(dá)而改善心肌纖維化，從而減少室性心律失常發(fā)生。進(jìn)一步闡明二者治療心律失常的作用機制，并驗證中藥治療心肌纖維化所致室性心律失常的多離子通道靶點作用。

本研究存在一定的局限性，由于研究中應(yīng)用復(fù)方制劑作為干預(yù)手段，未能明確藥物具體作用成分，因此，還需要更多相關(guān)研究以進(jìn)一步證實中藥有效成分對改善心肌纖維化從而減少室性心律失常發(fā)生的作用機制。

[1] De JS，van Veen TA，van Rijen HV，et al.Fibrosis and cardiac arrhythmias[J].Journal of Cardiovascular Pharmacology，2011，57(6)：630-638.

[2] John AJ，Toon AB，Sanne DE，et al.Reduced Cx43 expression triggers increased fibrosis due to enhanced fibroblast activity[J].Circulation，2012，5(2)：380-390.

[3] Jeffrey JG，Alfred EB，Michael C，et al.Risk stratification for arrhythmic audden cardiac death identifying the road blocks[J].Circulation，2011，123(21)：2423-2430.

[4] Ernesto LS.Vascular remodeling in hypertension mechanisms and treatment[J].Hypertension，2012，59(2)：367-374.

[5] Hiroshi A，Chizuru Y，Masamichi Y，et al.ARB and cardioprotection[J].Cardiovascular Drugs and Therapy，2012，27(2)：155-160.

[6] Gonzalez MI.Arterial hypertension，left ventricular hypertrophy and arrhythmia[J].Rev Esp Cardiol，1991，44(5)：586.

[7] 蔡輝，李箏，焦東東，等.美托洛爾對充血性心力衰竭大鼠血漿醛固酮濃度、心肌纖維化和心室重構(gòu)的影響[J].微循環(huán)學(xué)雜志，2010，20(1)：13-15；76.

[8] Li XY，Rui L，Wen Y，et al.Characteristics of coronary microvascular lesions in autopsied elderly with hypertensive left ventricular hypertrophy[J].Chin J Med，2002，115(5)：658-663.

[9] Zou JG，Zhang J，Jia ZH，et al.Evaluation of the traditional Chinese medicine Shensongyangxin capsule on treating premature ventricular contractions：a randomized，double-blind，controlled multicenter trial[J].Chinese Medical Journal，2011，124(1)：76-83.

[10] Alexander B，Alyssa P，Hu D，et al.Atrial-selective inhibition of sodium-channel current by Wenxin Keli is effective in suppressing atrial fibrillation[J].Heart Ryhthm，2012，9(1)：125-131.

[11] 姜鐵超，鄒穎剛，于曉艷.大鼠心肌缺血性纖維化后NF-κB的表達(dá)及其意義[J].吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版)，2010，36(5)：879-881.

[12] González GE，Seropian IM，Krieger ML，et al.Effect of early versuslate AT1 receptor blockade with losartan on postmyocardial infarction ventricular remodeling in rabbits[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol，2009，297(1)：H375-H386.

[13] 張召才，楊英珍，陳灝珠.心肌纖維化的研究進(jìn)展[J].臨床心血管病雜志，2004，20(1)：58-60.

[14] 余志斌，圣娟娟.心肌細(xì)胞縫隙連接重塑與心律失常[J].生理學(xué)報，2011，63(6)：586-592.

[15] 張衛(wèi)澤，王方正.心肌細(xì)胞縫隙連接與心律失常的關(guān)系[J].中國循環(huán)雜志，2001，16(6)：480-481.

[16] 陳世健，胡建華，劉韜.參松養(yǎng)心膠囊對糖尿病大鼠心室電生理特性及結(jié)構(gòu)功能變化的影響[J].中國病理生理雜志，2014，30(8)：1439-1444.

[17] 郭繼鴻，劉元偉.步長穩(wěn)心顆粒甘松提取物對大鼠心室肌細(xì)胞離子通道激活動力學(xué)的影響[J].醫(yī)師報，2008，10(1)：20.

[18] 唐其柱，黃崢嶸，史錫騰，等.甘松提取物對家兔心室肌細(xì)胞鈉、鈣通道的影響[J].中華心血管病雜志，2004，32(2)：267.

[19] 許曉瓊，孫明.穩(wěn)心顆粒對室性早搏病人心率及主要癥狀改善的觀察[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2007，5(9)：800-801.

[20] 楊杰孚，劉德平，佟佳賓.穩(wěn)心顆粒治療室性早搏的療效及安全性[J].中國社區(qū)醫(yī)師，2007，23(13)：39-40.

[21] Splaws Kil，Timothy KW，Sharpe LM，et al.Ca(V)1.2 calcium channel dysfunction causes a multisystem disorder in eluding arrhythmia and autism[J].Cell，2004，119(1)：19-31.

[22] 張衛(wèi)澤，王智剛，陳永清，等.纈沙坦與 U0126 對大鼠心肌纖維化和縫隙連接蛋白40的影響[J].中華心血管病雜志，2011，39(2)：1129-1134.

(本文編輯薛妮)

Effects of Shensong Yangxin Capsule and Wenxin Granule on Myocardial Fibrosis in Rats and Its Antiarrhythmic Mechanism

Wu Yanting， Chen Yun， Liu Haiting， Wu Yingying，Wu Wei， Liu Xincan

The First Affiliated Hospital，Henan University of Traditional Chinese Medicine，Zhengzhou 450000， Henan，China

Objective To study the effect of Shensong Yangxin capsule (SYC) and Wenxin granule (WXG) on myocardial fibrosis in rats and its antiarrhythmic mechanism.Methods Forty spontaneously hypertensive rats (SHR) were randomly divided into 4 groups: control group (n= 10) fed with normal feed， valsartan group (n= 10) fed with valsartan capsule content mixed feed， SYC group (n= 10) fed with SYC contents mixed feed， WXG group (n= 10) fed with WXG contents mixed feed for 2 months. After 2 months of feeding， rapid ventricular stimulation was performed， and the occurrence of arrhythmia was recorded.After the rats were killed， the left ventricular tissue sections were stained， the degree of fibrosis was observed.The expression of connexin 43 (Cx43)， matrix metalloproteinase-2 (MMP-2) and tissue inhibitor of matrix-metalloproteinase-2 (TIMP-2) in cardiac muscle cells was measured by immunohistochemistry. Results After feeding for 2 months， the occurrence of arrhythmia in valsartan group，SYC group，and WXG group were significantly less than that in control group (P<0.05). Quantitative image analysis showed that the expressions of Cx43 in valsartan group，SYC group，and WXG group were higher than that in control group (P<0.05) ，while the expressions of MMP-2 and TIMP-2 in valsartan group，SYC group，and WXG group were lower than that in control group (P<0.05). Conclusion SYC and WXG has the effects on myocardial remodeling， can delay the development of myocardial fibrosis， thereby reducing the incidence of fatal arrhythmia.The mechanism may be related to the increased expression of Cx43 and MMP-2.

ventricular arrhythmia；Shensong Yangxin capsule；Wenxin granule；myocardial fibrosis；connexin 43；matrix metalloproteinase-2；tissue inhibitor of matrix-metalloproteinase-2

河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院(鄭州 450000)，E-mail：15093362768@163.com

引用信息：吳艷婷，陳云，劉海亭，等.參松養(yǎng)心膠囊和穩(wěn)心顆粒對大鼠心肌纖維化的影響及其抗心律失常的機制研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2017，15(8)：924-927.

R541.7 R289.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2017.08.007

1672-1349(2017)08-0924-04

2016-08-11)