喬菊霞,王偉

(山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所,化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點實驗室,山西 太原 030006)

高遷移率蛋白 HmgB3和組蛋白Mlh1維持了四膜蟲小核穩(wěn)定性

喬菊霞,王偉*

(山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所,化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點實驗室,山西 太原 030006)

高遷移率族蛋白(High Mobility Group protein,HMG)和組蛋白H1結(jié)合染色質(zhì) DNA,在維持染色質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)、基因組基因表達調(diào)控以及DNA修復(fù)等方面發(fā)揮重要作用。嗜熱四膜蟲細胞含有一個體細胞系的大核和一個生殖系的小核,小核特異定位的高遷移率蛋白HmgB3或組蛋白Mlh1的缺失并未引起生長期細胞的異常表型。本研究通過同源重組的方法構(gòu)建了HMGB3和MLH1的雙敲除細胞突變株ΔHMGB3ΔMLH1。突變細胞在營養(yǎng)生長期能夠正常增殖,但對甲基磺酸甲酯較為敏感。缺對PCR檢測發(fā)現(xiàn)突變株中小核染色體有缺失現(xiàn)象,并且不能完成有性生殖。有性生殖過程中,減數(shù)分裂后的小核異常降解。結(jié)果表明高遷移率蛋白HmgB3和小核組蛋白Mlh1共同維持了四膜蟲小核的穩(wěn)定性,并可能具有功能上的冗余性。

嗜熱四膜蟲;高遷移率蛋白HmgB3;組蛋白Mlh1;小核穩(wěn)定性

0 引言

真核生物細胞中染色質(zhì)主要由DNA、組蛋白、非組蛋白以及少量的RNA構(gòu)成,其中組蛋白家族和高遷移率蛋白(High Mobility Group protein,HMG)家族是兩類最豐富和最重要的染色質(zhì)組分。組蛋白H1和HMG蛋白在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)、染色質(zhì)重塑等方面發(fā)揮著重要的作用[1]。HMG蛋白不僅調(diào)控基因組功能,而且調(diào)節(jié)特定基因的表達[2]。組蛋白H1可以與核小體二分體附近的DNA 或者鄰近的連接 DNA 結(jié)合,促進DNA纏繞在組蛋白八聚體上,保證核小體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[3]。HMG蛋白與組蛋白H1在染色體上有不同的分布,同時在核小體二分體附近占位重疊[4]。哺乳動物細胞中HMGB蛋白可以取代染色質(zhì)上的組蛋白H1,競爭性結(jié)合特異的DNA位點,影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu),調(diào)節(jié)基因組轉(zhuǎn)錄活性[5]。

嗜熱四膜蟲(Tetrahymenathermophila)具有核的二態(tài)性:營養(yǎng)生長期轉(zhuǎn)錄活躍的多倍體大核(MAC)和營養(yǎng)生長期轉(zhuǎn)錄沉默的二倍體小核(MIC)。嗜熱四膜蟲HMG蛋白家族中的HmgB3(TTHERM-00155590)在生長期和饑餓期特異定位在小核上,有性生殖時期定位于減數(shù)分裂和有絲分裂有功能的小核上。然而敲除HMGB3之后,沒有明顯的細胞學(xué)缺陷[6]。小核特異的組蛋白基因MLH1(TTHERM-00471820)敲除后,嗜熱四膜蟲的小核增大,大核保持不變,但MLH1的缺失并不影響嗜熱四膜蟲的營養(yǎng)生長期小核有絲分裂以及細胞增殖[7]。HMG家族蛋白與組蛋白H1在維持染色質(zhì)高級結(jié)構(gòu)和表觀遺傳學(xué)調(diào)控方面相互影響,然而嗜熱四膜蟲Mlh1與HmgB3是否存在功能上的補償,目前并不清楚。本研究首次獲得HMGB3和MLH1的雙敲除突變株,分析了組蛋白H1和高遷移率蛋白對四膜蟲細胞核的穩(wěn)定性和有性生殖發(fā)育的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜熱四膜蟲野生型細胞株B2086和CU428由美國康奈爾大學(xué)Peter J. Bruns博士惠贈。ΔHMGB3-5和ΔHMGB3-7突變體,pBsr由本實驗室保存。氨芐青霉素、巴龍霉素(上海生工),鏈霉素、兩性霉素、葡萄糖、DAPI(北京索萊寶科技有限公司)。pMD?18-T克隆試劑盒(TaKaRa公司)。限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶和TaqDNA聚合酶(Thermo公司);胰蛋白胨、酵母提取物(英國OXOID公司)。引物合成(上海生工);質(zhì)粒抽提試劑(北京天根生化公司),質(zhì)粒回收試劑盒(OMEGA公司)。

1.2 四膜蟲細胞培養(yǎng)

嗜熱四膜蟲于SPP 培養(yǎng)基 (質(zhì)量濃度為1% 胰蛋白胨,0.2% 葡萄糖,0.1% 酵母提取物,0.003% EDTA鐵鹽)中30℃、170 r/min搖床培養(yǎng)[8]。兩種不同交配型四膜蟲生長至濃度為3.0～3.5×105cells/mL后,于10 mmol/L Tris(pH 7.4)中饑餓18～24 h。將濃度為2.5×105cells/mL的兩種不同交配型四膜蟲等量混合,30℃靜置培養(yǎng),細胞進行有性生殖[9]。

1.3MLH1和HMGB3基因的序列和表達分析

MLH1和HMGB3基因的DNA序列、mRNA序列和表達譜由四膜蟲基因組數(shù)據(jù)庫(http:∥www.ciliate.org)和四膜蟲功能基因組數(shù)據(jù)庫(http:∥tfgd.ihb.ac.cn)獲得[10-11]。HmgB3和Mlh1的HMG-box氨基酸序列比對使用DNAMAN軟件。

1.4 pBsr4-MLH1重組敲除載體的構(gòu)建

以嗜熱四膜蟲基因組為模板,通過引物KO-MLH1-5-F(5’-TGAGCTCCTTTAGTTAAACTTACTGATTAAATTTTC-3’,下橫線為SacI酶切點)/KO-MLH1-5-R(5’-TGCGGCCGCGCAAATCTTTCATAAGTATTGTCAAATC-3’,下劃線為NotⅠ酶切位點)和KO-MLH1-3-F (5’-TCTCGAGGTTAATTAATTACAAAATAGTTGGATGG-3’,下劃線為XhoⅠ酶切位點)/KO-MLH1-3-R(5’-TGGTACCGGCAAATATTATATCATAAAGCTTATCC-3’,下劃線為KpnⅠ酶切位點)分別擴增MLH1基因的上游序列1 054 bp和下游序列571 bp,分別構(gòu)建到pMD?18-T載體上,得到重組質(zhì)粒pMD 18-T-5’和pMD 18-T-3’。限制性內(nèi)切酶SacⅠ和NotⅠ分別酶切質(zhì)粒pMD18-T-5’和pBsr并回收目的片段。目的片段用T4 DNA連接酶連接(16℃過夜),轉(zhuǎn)化并篩選得到重組質(zhì)粒pBsr-5’。限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和XhoⅠ分別酶切質(zhì)粒pMD 18-T-3’和pBsr-5’,膠回收目的片段并連接轉(zhuǎn)化,篩選得到重組質(zhì)粒pBsr-MLH1(圖 1B)。

1.5 基因槍轉(zhuǎn)化以及突變株篩選

將構(gòu)建成功的重組敲除載體質(zhì)粒pBsr-MLH1用限制性內(nèi)切酶SacⅠ和KpnⅠ酶切線性化,濃縮后濃度達到1～1.5 μg/μL。使用高壓氣體基因槍(GJ-1000,寧波新芝科技有限公司)將線性化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到不同交配型的已經(jīng)敲除HMGB3基因的四膜蟲細胞ΔHMGB3-5和ΔHMGB3-7。通過同源重組的方法(圖1)，利用殺稻瘟菌素梯度濃度篩選,PCR鑒定(鑒定引物為5’-CGCTTAATGCTGCAGCTTTTCCC-3’和5’-CATAATGGTGAATATTTGTTAAAATACC-3’),得到穩(wěn)定的敲減突變株ΔHMGB3ΔMLH1-5和完全敲除突變株ΔHMGB3ΔMLH1-7(圖 1C)。

A. 基因MLH1的敲除同源重組示意圖。 B. 重組質(zhì)粒pBsr-MLH1的鑒定。 M, DNA Marker。 1, pBsr-MLH1。 2,4: 以pBsr-MLH1為模板,分別以MLH1的3’ 和5’ 側(cè)翼序列引物擴增的PCR產(chǎn)物。3,5: pBsr-MLH1的Xho Ⅰ/Kpn Ⅰ 和Sac Ⅰ/Not Ⅰ的雙酶切產(chǎn)物。 C. 雙敲除突變株ΔHMGB3ΔMLH1的鑒定。 M, DNA Marker。W, 野生型條帶,大約2.4 kb。 箭頭所指為重組條帶,大約1.4 kbFig.1 Identification of ΔHMGB3ΔMLH1 mutants圖1 雙敲除突變株ΔHMGB3ΔMLH1的鑒定

1.6 小核染色體完整性檢測

四膜蟲五對小核染色體含有小核特異染色體斷裂序列(chromosome breakage sequence,Cbs)。利用分別來自五對染色體的特異斷裂片段側(cè)翼序列引物,以基因組為模板,進行缺對PCR檢測小核的完整性分析[12]。使用的引物分別來自染色體1L-4,2R-1,3L-2,4L-2,5-1。 反應(yīng)條件為94℃，5 min,以及40個循環(huán)的變性94℃，30 s,退火50℃，30 s(引物Ⅱ[12]) 或者54℃，30 s (引物Ⅰ,Ⅲ,Ⅳ,和Ⅴ[12]), 延伸條件為68℃，2 min。 后延伸條件為68℃，10 min。

1.7 細胞核染色觀察

將20 μL的10 ng/mL的DAPI加入樣品,置于室溫15 min,封片,使用Olympus激光共聚焦顯微鏡觀察細胞有性生殖。

2 實驗結(jié)果

2.1 嗜熱四膜蟲HMGB3和MLH1基因分析

四膜蟲功能基因組數(shù)據(jù)庫顯示,MLH1在生長期有著較低的表達量,在有性生殖時期有著較高的表達量,有性生殖6 h達到最大值(圖2A)。HMGB3在生長期有較低的表達量,有性生殖時期有著較高的表達量,有性生殖2～4 h達到最大值(圖 2B)。MLH1和HMGB3具有相似的表達圖譜且在有性生殖過程中表達顯著上調(diào)。Mlh1和HmgB3的HMG-box有著35%的一致性(圖2C),且HmgB3和Mlh1有著相似的氨基酸電荷性分布特征[6],暗示兩個基因可能具有功能上的冗余性。

A.MLH1基因的微陣列表達譜。B.HMGB3基因的微陣列表達譜。圖A和圖B均引自四膜蟲功能基因組數(shù)據(jù)庫(http:∥tfgd.ihb.ac.cn)。L-1,L-2,L-3分別表示營養(yǎng)生長期細胞濃度為1×105 cells/mL,3.5×105 cells/mL和1×106 cells/mL;S0-S24表示饑餓期0-24 h的細胞;C0-C24表示有性生殖時期0-24 h的細胞。 C. Mlh1和HmgB3的HMG-box氨基酸序列比對,方框中表示比對一致的氨基酸,使用的軟件為DNAMAN。Fig.2 Sequence analysis of MLH1 and HMGB3圖2 MLH1和HMGB3基因序列分析

2.2 雙敲除細胞株在甲基磺酸甲酯的脅迫下生長受到抑制

甲基磺酸甲酯(methylmercuric sulfate,MMS)是一種單功能烷化劑,修飾后的DNA分子將產(chǎn)生一些非編碼堿基,如3-甲基腺嘌呤和7-甲基鳥嘌呤,從而引起堿基錯配、暫?；蜃钄郉NA復(fù)制,進而造成DNA損傷。HMG蛋白和組蛋白H1均可以參與DNA損傷修復(fù)。先前的研究表明敲除MLH1之后,發(fā)現(xiàn)突變株和野生型相比沒有明顯區(qū)別。雙敲除細胞株ΔHMGB3ΔMLH1和野生型細胞株生長速率沒有明顯的區(qū)別(圖3A)。但是雙敲除細胞株較野生型細胞株對甲基磺酸甲酯(MMS)敏感(圖3B),表明HmgB3與Mlh1缺失的細胞對外源脅迫更為敏感,可能直接參與了染色質(zhì)的修復(fù)過程。

A.野生型四膜蟲和雙敲除突變株ΔHMGB3ΔMLH1-7的生長曲線。 B.野生型四膜蟲和雙敲除突變株ΔHMGB3ΔMLH1-5/7在2 mM MMS藥物處理下的生長曲線。 四膜蟲均于30℃條件下靜置培養(yǎng), 每隔4 h取樣計數(shù)細胞濃度。 每個樣均有3次重復(fù), 試驗數(shù)據(jù)為三組數(shù)據(jù)的平均值±標準偏差。Fig.3 Prolifiration of T. thermophila during vegetative growing stage圖3 嗜熱四膜蟲細胞在營養(yǎng)生長期的增殖

2.3 雙敲除突變體導(dǎo)致小核染色體缺失

雙敲除突變株對MMS更為敏感,我們進一步分析了突變株小核基因組DNA的完整性。利用分別來自小核五對染色體的五對特異的斷裂片段側(cè)翼序列引物,進行五對染色體的缺對PCR檢測，發(fā)現(xiàn)完全敲除細胞株ΔHMGB3ΔMLH1-7的5條染色體均有缺失(圖4A),而敲減細胞株ΔHMGB3ΔMLH1-5的第3對染色體有缺失(圖4B)。

A. 分別以四膜蟲5條染色體的5對引物, 野生型四膜蟲和雙敲除突變株ΔHMGB3ΔMLH1-7的基因組為模板,PCR擴增的產(chǎn)物。 Ⅰ,Ⅱ,Ⅱ,Ⅳ,Ⅴ分別對應(yīng)五條不同的染色體;B. 分別以四膜蟲5條染色體的5對引物,野生型四膜蟲和雙敲除突變株ΔHMGB3ΔMLH1-5的基因組為模板,PCR擴增的產(chǎn)物。 Ⅰ,Ⅱ,Ⅱ,Ⅳ,Ⅴ分別對應(yīng)五條不同的染色體。Fig.4 Loss of micronuclear chromosome in ΔHMGB3ΔMLH1圖4 ΔHMGB3ΔMLH1突變體中小核染色體的缺失

2.4 ΔHMGB3ΔMLH1突變細胞株進行異常的有性生殖

將雙敲除突變株ΔHMGB3ΔMLH1-7和雙敲減突變株ΔHMGB3ΔMLH1-5饑餓20 h等數(shù)量混合,進行有性生殖。DAPI染色后,發(fā)現(xiàn)野生型細胞株配對后,經(jīng)過兩次減數(shù)分裂形成配子核(圖5c),配子核進行有絲分裂(圖5d)以及交換融合后形成合子核,合子核進行兩次有絲分裂,分化發(fā)育形成2個新大核和2個新小核(圖5f)。突變株配對細胞中有一個細胞在配對形成時期的小核(圖5h)和Crescent時期(圖5i) DNA著色較淺,之后不能進行正常的減數(shù)分裂(圖5j and 5k);另一個突變株進行正常的減數(shù)分裂 (圖5j) 和合子核前有絲分裂 (圖5k),但是之后由于單倍體配子核不能和另一個細胞的配子進行融合,導(dǎo)致配子降解 (圖5l)。最終細胞發(fā)育為只有大核的異常細胞 (圖5m,5n)。

a,h:配對細胞形成; b,i:Crescent時期,突變株細胞中一個小核DNA著色較弱;c,j:減數(shù)第二次分裂; d,k:單倍體配子進行有絲分裂;e:合子核第二次有絲分裂;l:突變株中配子開始降解; f:anlagen時期;m,只有舊大核的配對細胞;g:2個大核和1個小核的細胞;n,只有一個舊大核的異常細胞。標尺,10 μmFig.5 Abnormal micronuclear development of ΔHMGB3ΔMLH1 cells圖5 ΔHMGB3ΔMLH1突變株的異常小核發(fā)育

3 討論

組蛋白H1和HMG蛋白在調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能方面都起著重要的作用。組蛋白H1進化上存在多種變體,但多數(shù)H1含有三個結(jié)構(gòu)域:中間保守的球形結(jié)構(gòu)域,較短的N端結(jié)構(gòu)域以及較長的C端結(jié)構(gòu)域[13-14]。四膜蟲Mlh1不同于多細胞真核生物的H1,包含有一個HMG-box,且在不同的發(fā)育階段存在水解過程[15]。哺乳動物細胞內(nèi)HMGB蛋白含有兩個HMG-box,植物細胞內(nèi)HMGB蛋白含有1個HMG-box[16]。四膜蟲HmgB3含有一個HMG-box。四膜蟲細胞內(nèi)HmgB3和Mlh1蛋白N端的HMG-box有著35 %的一致性,兩個蛋白都沒有半胱氨酸,含有幾乎相同數(shù)目的帶同種電荷的氨基酸和相同數(shù)目的疏水性氨基酸[6]。HMGB3和MLH1在四膜蟲細胞內(nèi)有著相似的表達圖譜,而且具有保守的HMG-box結(jié)構(gòu),它們在四膜蟲細胞中可能存在相互作用或功能的冗余性。

先前我們的研究發(fā)現(xiàn)嗜熱四膜蟲HMGB3的敲除細胞株沒有明顯的細胞學(xué)缺陷,然而HMGB3的過表達細胞株不能產(chǎn)生后代[6]。敲除四膜蟲小核組蛋白基因MLH1,發(fā)現(xiàn)小核變大,但并不影響四膜蟲的營養(yǎng)生長[7]。我們在構(gòu)建了HMGB3和MLH1的雙敲除突變株后,發(fā)現(xiàn)突變株的小核染色體會有丟失現(xiàn)象,而且完全敲除突變株比敲減突變株的小核受損嚴重。嗜熱四膜蟲小核的缺損對其營養(yǎng)生長的影響并不顯著，然而MMS的脅迫影響了突變體細胞株的生長。先前我們的研究結(jié)果表明HmgB3在生長、饑餓和有性生殖時期特異定位在小核,因此我們推測在MMS脅迫下,HmgB3和組蛋白H1的功能可能會發(fā)生改變,從而參與大核的損傷修復(fù)。組蛋白H1可以在DNA損傷之后,起始和擴大泛素化信號,它的泛素化標記為RNF168提供結(jié)合位點,進而招募修復(fù)因子到DNA雙鏈斷裂位點進行DNA損傷修復(fù)[17]。在 DT40 細胞中,HMGNs 在紫外照射引起的DNA損傷修復(fù)和維持基因組完整性方面發(fā)揮著一定的作用[18]。HMGB1/2對化學(xué)藥物順鉑造成的損傷的DNA有著較高的親和性[19]。四膜蟲HmgB3在生長期和饑餓期特異定位在小核,敲除突變體在有性生殖時期沒有明顯的細胞學(xué)缺陷,而雙敲除突變株對MMS敏感性升高。哺乳動物細胞中HMGB蛋白可以取代染色體上的組蛋白H1或者通過和H1相互作用調(diào)節(jié)DNA的結(jié)構(gòu)[5]。Mlh1的缺失會造成四膜蟲小核染色質(zhì)的松散[7],但不影響細胞在營養(yǎng)生長期的有絲分裂。HmgB3和Mlh1的同時缺失影響了有性生殖的進程。在小核減數(shù)分裂時期,突變細胞株小核DNA著色很淺,隨著減數(shù)分裂的進行,小核降解。我們推測HmgB3和Mlh1的缺失使得染色質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)不能維持,DNA復(fù)制和修復(fù)異常導(dǎo)致有性生殖異常。 HmgB3和Mlh1在四膜蟲中可能存在功能的冗余性或者存在相互調(diào)節(jié),它們共同參與維持了染色質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)。真核生物組蛋白H1和高遷移蛋白的相互作用及對染色質(zhì)的分子調(diào)控機制需進一步深入研究。

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High Mobility Group Protein HmgB3 and Linker Histone Mlh1 Maintain Micronuclear Stability inTetrahymenathermophila

QIAO Juxia,WANG Wei*

(Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education,Institute of Biotechnology,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

High mobility group protein (HMG) and linker histone H1 bind to linker DNA in chromatin and play important roles in establishing chromatin higher structure, regulating gene transcription and DNA repair.Tetrahymenathermophilacontains one somatic macronucleus (MAC) and one germ line micronucleus (MIC), disruption of micronuclear specific HmgB3 or Mlh1 has no significant cytological defects during vegetative growing stage.HMGB3 andMLH1 double knockout strains were constructed by homologous recombination.ΔHMGB3ΔMLH1 mutants normally proliferate during vegetative growing stage, but are sensitive to methylmercuric sulfate treatment. Loss of micronuclear chromosomes was found in ΔHMGB3ΔMLH1 mutants by the nullisomic-based PCR. Furthermore, abnormal conjugation progress and degradation of micronuclei occurred in ΔHMGB3ΔMLH1 mutants.The results show that HmgB3 and Mlh1 were required for micronuclear stability and could had redundant function inT.thermophila.

Tetrahymenathermophila;high mobility group protein (HmgB3);histone H1 (Mlh1);micronuclear stability

10.13451/j.cnki.shanxi.univ(nat.sci.).2017.02.025

2017-02-26；

2017-03-20

國家自然科學(xué)基金(31471999);山西省自然科學(xué)基金 (2015011078);山西省回國留學(xué)人員科研資助項目(2015008)

喬菊霞(1991-),女,碩士研究生,研究方向為細胞分子生物學(xué)。

*通信作者：王偉(WANG Wei)，E-mail:gene@sxu.edu.cn

Q75

A

0253-2395(2017)02-0358-07