趙雪梅,宋建英,王茜,王軟林,楊斌盛,梁愛華*

(1.山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所,化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,太原 030006;2.山西大學(xué) 分子科學(xué)研究所,化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,太原 030006)

八肋游仆蟲ARF1蛋白的表達(dá)純化及其與嘌呤核苷酸的相互作用

趙雪梅1,宋建英1,王茜1,王軟林1,楊斌盛2,梁愛華1*

(1.山西大學(xué) 生物技術(shù)研究所,化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,太原 030006;2.山西大學(xué) 分子科學(xué)研究所,化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,太原 030006)

ADP核糖基化因子1(ARF1)是Ras超家族的成員,調(diào)控細(xì)胞內(nèi)囊泡運(yùn)輸,進(jìn)而影響細(xì)胞的生長發(fā)育。為了研究單細(xì)胞真核生物八肋游仆蟲ARF1的功能,構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-ARF1,在大腸桿菌BL21中進(jìn)行了表達(dá)純化,獲得高純度的八肋游仆蟲腺苷酸核糖基化因子1蛋白EoARF1,隨后通過熒光光譜法檢測了其與嘌呤核苷酸的相互作用。結(jié)果表明,表達(dá)純化的EoARF1蛋白能與嘌呤核苷酸發(fā)生相互作用,其結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n約等于1,且與鳥嘌呤核苷酸作用強(qiáng)弱順序?yàn)镚TP>GDP>GMP,與GDP的結(jié)合強(qiáng)度明顯大于與ADP的結(jié)合強(qiáng)度。

ADP核糖基化因子1;八肋游仆蟲;表達(dá)純化;熒光光譜法

細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)對于細(xì)胞的生存和生長至關(guān)重要,真核細(xì)胞大分子與顆粒性物質(zhì)的跨膜運(yùn)輸是通過將它們包裹在脂雙層膜圍繞的囊泡中進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)[1]。囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)受多種調(diào)節(jié)分子控制,其中就有ADP核糖基化因子1(ADP ribosylation factor 1, 簡稱ARF1)[2]。ARF1蛋白是肉豆蔻酰基化的小鳥嘌呤核苷結(jié)合蛋白家族中的一員,是霍亂毒素的變構(gòu)激活劑,主要參與網(wǎng)格狀蛋白和無網(wǎng)格狀蛋白兩種囊泡被膜的形成,并進(jìn)一步調(diào)控囊泡運(yùn)輸,參與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸[3-4]。與其他GTPase一樣,當(dāng)它結(jié)合GDP成為失活態(tài),結(jié)合GTP時(shí)被激活成活化態(tài),活化后的ARF1與下游效應(yīng)分子相互作用形成運(yùn)輸囊泡,主要是通過調(diào)節(jié)鳥嘌呤核苷置換因子(GEFs)、BFA和GTP酶活化蛋白(GAPs)來進(jìn)行調(diào)節(jié)[5-10]。而GAP 能水解ARF1上的GTP,促使這兩種囊泡的被膜和膜解離,從而囊泡和目的細(xì)胞器的膜最終融合[11]。這樣囊泡可在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基復(fù)合體之間運(yùn)輸多種細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)。人的 ARF1(hARF1)由181個(gè)氨基酸組成,含有ARF家族中與GTP結(jié)合與水解的結(jié)構(gòu)域(GX4GK, DVGG, NKQD, CAT)和N末端作為十四烷基化位點(diǎn)高度保守的第二位甘氨酸[12-13]。有文獻(xiàn)報(bào)道,利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)獲得的重組hARF1能夠在體外與GDP/ADP相互作用,與GDP的結(jié)合強(qiáng)度大于與ADP的結(jié)合[14]。

纖毛蟲是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的單細(xì)胞原生動物,有兩種大小不同的核,一種是二倍體的小核,負(fù)責(zé)基因重組,另一種是多倍體的大核,負(fù)責(zé)調(diào)控細(xì)胞生長發(fā)育。這類生物體內(nèi)各細(xì)胞器之間囊泡運(yùn)輸系統(tǒng)極為完善。本課題組前期對八肋游仆蟲(Euplotesoctocarinatus)的小分子GTP酶Rab蛋白家族進(jìn)行了基因克隆,并在體內(nèi)研究了部分Rab蛋白的定位和功能[15]，然而對游仆蟲中ARF家族成員在膜泡運(yùn)輸過程中的功能了解甚少。為了研究游仆蟲ARF1的性質(zhì)與功能,克隆了八肋游仆蟲的ARF1基因,構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-ARF1,在大腸桿菌中進(jìn)行了表達(dá)純化,獲得了高純度的八肋游仆蟲ARF1(EoARF1),表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)Western blot檢測為陽性,通過熒光光譜技術(shù)檢測了EoARF1蛋白與嘌呤核苷酸之間的相互作用,為進(jìn)一步研究EoARF1蛋白的功能奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

1.1.2 菌株和質(zhì)粒

八肋游仆蟲由本課題組通過綠藻培養(yǎng);菌株E.coliDH5α,E.coliBL21(DE3) 由本實(shí)驗(yàn)室保存;表達(dá)載體pET-28a(+)購于Novagen公司,其中含有T7啟動子和6×His標(biāo)簽,帶有卡那霉素(Kanamycin)抗性;PCR引物由Sangon Biotech公司合成;DNA測序由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.1.3 試劑

質(zhì)粒小量提取試劑盒,膠回收試劑盒購于TIANGEN公司,DNA Taq聚合酶、Trans2k PlusⅡ DNA Marker購于全式金生物技術(shù)有限公司;限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購于TaKara公司;GDP-2Na和ADP-2Na、GTP-3Na、GMP-2Na購于Sangon Biotech公司,HisTrap FF 5 mL預(yù)裝柱和SuperdexTM75 凝膠層析柱購于GE Healthcare公司;其他常用試劑均購于Sangon Biotech公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1EoARF1基因的克隆

根據(jù)八肋游仆蟲的基因組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),設(shè)計(jì)EoARF1基因特異性引物,上游引物:5’-CGGGATCCATGGGATTTGTGTTTTC-3’;下游引物:5’-ACGCGTCGACTTTCAAGAATTTACTTT-3’;分別以游仆蟲基因組和cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增(95℃變性5 min;95℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸45 s,30循環(huán)后72℃延伸5 min, 得到EoARF1擴(kuò)增產(chǎn)物。與克隆載體pMD?18-T過夜連接后,轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中,篩選獲得陽性克隆,提取pMD?18-EoARF1質(zhì)粒后交由公司測序鑒定。

1.2.2 pET28a-ARF1-T重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以質(zhì)粒pMD?18-EoARF1為模板,利用上述EoARF1特異性引物進(jìn)行PCR,將純化的PCR產(chǎn)物與表達(dá)載體pET28a均用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ分別進(jìn)行酶切并進(jìn)行膠回收,然后利用T4 DNA連接酶16℃過夜連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,涂在含35 μg/mL 卡那抗性的LB平板上。次日選取陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌液PCR初步篩選,隨后進(jìn)行質(zhì)粒提取,用BamHⅠ和SalⅠ對質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定后,送北京華大基因公司測序驗(yàn)證獲得pET28a-ARF1。

為使EoARF1基因能在大腸桿菌中表達(dá),設(shè)計(jì)了定點(diǎn)突變引物將328位的苯丙氨酸(T)刪除使其能夠順利通讀,上游引物:5’-GTTAGTCAACTAGAATTCTTTAACCTTATCCTT-3’;下游引物:TTCAGAATTAAGGATAAGGTTAAAGAATTC;以質(zhì)粒pET28a-ARF1為模板,進(jìn)行PCR突變,取8 μL PCR產(chǎn)物加入0.5 μLDpnⅠ和2 μL Buffer,37℃過夜消化后,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,在含有卡那抗性的LB固體平板培養(yǎng)基上37℃倒置培養(yǎng)約16 h,挑取單菌落于5 mL LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng),提取質(zhì)粒pET28a-ARF1-T,交由公司測序鑒定。

1.2.3 EoARF1重組蛋白的表達(dá)純化

將測序正確的重組質(zhì)粒pET28a-ARF1-T轉(zhuǎn)化于大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中,涂布在含有卡那抗性的LB平板上,37℃恒溫過夜培養(yǎng)。挑取單菌落至5 mL含卡那抗性的LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng),次日將菌液按1∶100的比例擴(kuò)大接種至500 mL含有卡那抗性的LB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.4-0.6,加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L,37℃誘導(dǎo)5 h后,8 000 r/mim,4℃離心10 min收集菌體。然后用40 mL緩沖液(20 mmol/L Tris,500 mmol/L NaCl,10 mmol/L 咪唑,pH 8.0)進(jìn)行懸洗,置于冰浴中進(jìn)行超聲破碎至無明顯菌體,13 000 r/min離心20 min,收集上清,將上清蛋白加入已用平衡緩沖液 (20 mmol/L Tris,500 mmol/L NaCl,10 mmol/L 咪唑,pH 8.0)平衡好的鎳柱中,置于4℃搖床結(jié)合 2 h;利用洗滌緩沖液 (20 mmol/L Tris,500 mmol/L NaCl,20 mmol/L 咪唑,pH 8.0)對非特異結(jié)合的蛋白進(jìn)行洗滌;最后再用洗脫緩沖液 (濃度梯度咪唑,pH 8.0) 將目的蛋白進(jìn)行洗脫;合并洗脫液,利用10 kD 的濃縮管將目的蛋白通過4℃,3 000 r/mim條件進(jìn)行濃縮至1 mL,將濃縮蛋白利用0.22 μm濾膜進(jìn)行過濾后,上樣于用緩沖液 (50 mmol/L Tris-HCl, 50 mmol/L NaCl, pH 7.4)平衡好的 SuperdexTM75 凝膠層析柱, 以達(dá)到進(jìn)一步純化的目的。將純化的目的蛋白經(jīng) 15% SDS-PAGE檢測,并將濃縮后的蛋白經(jīng)酶標(biāo)儀檢測濃度后,于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 EoARF1重組蛋白的Western Blot檢測

將目的蛋白經(jīng)15% SDS-PAGE分離后,剪同樣大小的兩張濾紙和PVDF膜,將PVDF膜放置于甲醇中,進(jìn)行活化20 s后,在蒸餾水中清洗2 min,置于轉(zhuǎn)膜儀中,90 V恒壓冰浴轉(zhuǎn)膜90 min,轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將PVDF膜置于脫脂牛奶封閉液中封閉1 h,利用anti-His抗體4℃孵育過夜(1∶1 500稀釋),PBST中清洗3-5次后,羊抗鼠熒光二抗(1∶10 000稀釋)4℃孵育1 h,PBST中清洗5次后經(jīng)Odyssey Family雙色紅外激光成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司)掃膜成像。

1.2.5 熒光光譜法測定EoARF1蛋白與嘌呤核苷酸的相互作用

采用熒光光譜法測定EoARF1蛋白與嘌呤核苷酸GMP/GDP/GTP以及ADP的相互作用[14]。蛋白質(zhì)因含有色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸殘基而能發(fā)射較強(qiáng)的內(nèi)源熒光,在270～300 nm的紫外光照射下發(fā)出熒光,當(dāng)測定體系中加入小分子配體時(shí),配體和蛋白質(zhì)發(fā)生弱相互作用,會導(dǎo)致蛋白質(zhì)熒光的靜態(tài)淬滅。利用這個(gè)現(xiàn)象,可以確定蛋白質(zhì)與配體的作用類型以及其結(jié)合部位等[16-17]。

將EoARF1純化蛋白用緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L NaCl,pH 7.4)調(diào)節(jié)至終濃度為1.25 μmol/L。取2 mL置于4 mL石英比色皿中,隨后利用10 mmol/L GDP溶液進(jìn)行熒光滴定(累積滴定1、2、4、8、16 μL等等),直到熒光強(qiáng)度穩(wěn)定為止。在每次滴加GDP溶液結(jié)束后攪拌均勻,穩(wěn)定2 min后,進(jìn)行熒光光譜變化的測量。設(shè)定測試條件:室溫下 (25℃),激發(fā)波長280 nm,掃描波長300～450 nm,狹縫寬度激發(fā)狀態(tài)為4.0 nm,發(fā)射狀態(tài)為5.0 nm,掃描速率300 nm/min。在同等條件下,分別利用 10 mmol/L 的GMP/GTP/ADP溶液取代GDP溶液重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 八肋游仆蟲ARF1基因克隆、序列分析及重組質(zhì)粒pET28a-ARF1的構(gòu)建

序列分析表明,游仆蟲ARF1基因編碼區(qū)全長 565 bp,無內(nèi)含子。編碼區(qū)有兩個(gè)開放閱讀框,第一個(gè)讀框編碼ARF1的前109個(gè)氨基酸,而從328 bp起的第二個(gè)開放讀框編碼ARF1剩余的78個(gè)氨基酸。該基因序列已經(jīng)提交GanBank,登錄號為KU981055。分析后初步確定這個(gè)基因是游仆蟲中的一個(gè)+1位的編程性移碼基因,兩個(gè)讀框的銜接處是TTTTAAC,屬于一個(gè)新的七核苷酸滑動序列類型[18],兩個(gè)讀框編碼的完整游仆蟲ARF與人的ARF1序列同源性為 45.9%。含有與 GTP結(jié)合與解離相關(guān)的四個(gè)結(jié)構(gòu)域(見討論)。

以pMD?18-EoARF1質(zhì)粒為模板,利用上下游引物擴(kuò)增EoARF1基因,將其克隆到表達(dá)載體pET28a(+)中,通過雙酶切鑒定以及測序證實(shí)重組質(zhì)粒pET28a-ARF1構(gòu)建成功。為了使這個(gè)基因能夠在大腸桿菌中得到表達(dá),通過定點(diǎn)突變將七核苷酸滑動序列TTTTAAC變?yōu)門TTAAC(圖1),以保證產(chǎn)生結(jié)構(gòu)域完整的EoARF1。

Fig.1 Partial sequences before (A) and after (B) site-directed mutation of EoARF1 gene圖1 EoARF1基因的定點(diǎn)突變前(A)后(B)的序列

2.2 EoARF1重組蛋白的表達(dá)純化

將重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-ARF1-T轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中進(jìn)行表達(dá),表達(dá)產(chǎn)物通過15% SDS-PAGE分析,在分子量約為25 kD左右出現(xiàn)一條誘導(dǎo)表達(dá)蛋白條帶,并且該表達(dá)產(chǎn)物存在于上清液中,而在未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的工程菌中無此條帶,將上清液中的目的蛋白通過親和層析進(jìn)行純化,SDS-PAGE中顯示為單一條帶(圖2A,泳道3-5),Western印跡分析表明,可溶性的EoARF1 蛋白可與anti-His 抗體特異性反應(yīng)(圖2B)。隨后對目的蛋白又進(jìn)行了SuperdexTM75 凝膠柱層析純化(圖2C),SDS-PAGE分析表明蛋白達(dá)到了電泳純(圖2D)。

A: SDS-PAGE analysis of expressed product. Lane 1: whole cell lysate of E.coli BL21(DE3)/pET28a-ARF1;Lane 2:Supernatant of E.coli BL21(DE3)/pET28a-ARF1; Lane 3-5: protein fraction from the Ni-column eluted with 50 mmol/L, 100 mmol/L and 150 mmol/L imidazole; B: Western blot of pET28a-ARF1;C: Gel filtration chromatography of the EoARF1; D: SDS-PAGE analysis of purified EoARF1 protein.Lane M: Low molecular weight markerFig.2 Expression and purification of pET28a-ARF1A: 表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE圖。Lane 1:E.coli BL21(DE3)/pET28a-ARF1全菌;Lane 2:E.coli BL21(DE3)/pET28a-ARF1上清;Lane 3-5;不同濃度咪唑洗脫樣品;B: pET28a-ARF1 的Western 印跡分析;C: ARF1蛋白經(jīng)凝膠柱純化的洗脫圖;D:SuperdexTM75 凝膠柱層析純化后的EoARF1的SDS-PAGE圖。 Lane M: 低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白圖2 pET28a-ARF1的表達(dá)純化

2.3 EoARF1蛋白與嘌呤核苷酸相互作用的熒光光譜分析

為了探究表達(dá)的EoARF1是否具有與嘌呤核苷酸的結(jié)合活性,采用熒光光譜法[14]。EoARF1蛋白編碼181個(gè)氨基酸,其內(nèi)源熒光來自于分子中的色氨酸(W66,W78,W153,W172)和酪氨酸(Y35,Y81,Y91)。將EoARF1蛋白濃度固定后,隨著鳥嘌呤GMP/GDP/GTP或者腺嘌呤ADP濃度的增加,EoARF1蛋白的內(nèi)源熒光強(qiáng)度降低,不同濃度的嘌呤核苷酸導(dǎo)致EoARF1蛋白的熒光猝滅結(jié)果見圖3。

EoARF1蛋白與嘌呤核苷酸形成復(fù)合物引起熒光猝滅,二者的結(jié)合可用熒光物質(zhì)-猝滅分子間的結(jié)合常數(shù)表達(dá)式lg{[F0-F]/F}=lgK+nlg[Q]進(jìn)行計(jì)算[19],求得結(jié)合常數(shù)以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(表 1)。

A:Fluorescence spectroscopies of the addition GMP to EoARF1. B:Plot of lg{[F0-Fr]/[Fr-Fz]} versus lgGMP of EoARF1. C: Fluorescence spectroscopies of the addition GDP to EoARF1.D:Plot of lg{[F0-Fr]/[Fr-Fz]} versus lgGDP of EoARF1.E: Fluorescence spectroscopies of the addition GTP to EoARF1. F:Plot of lg{[F0-Fr]/[Fr-Fz]} versus lgGTP of EoARF1.G:Fluorescence spectroscopies of the addition ADP to EoARF1.H:Plot of lg{[F0-Fr]/[Fr-Fz]} versus lgADP of EoARF1Fig.3 Fluorescence quenching by the addition GMP/GDP/GTP/ADP to EoARF1 A:GMP滴定EoARF1的熒光光譜;B: lg{[F0-Fr]/[Fr-Fz]}對lgGMP作圖。 C: GDP滴定EoARF1的熒光光譜;D: lg{[F0-Fr]/[Fr-Fz]}對lgGDP作圖。 E: GTP滴定EoARF1的熒光光譜;F:lg{[F0-Fr]/[Fr-Fz]}對lgGTP作圖。 G: ADP滴定EoARF1的熒光光譜;H:lg{[F0-Fr]/[Fr-Fz]}對lgADP作圖。圖3 以GMP/GDP/GTP/ADP滴定EoARF1的熒光淬滅圖

嘌呤核苷酸結(jié)合常數(shù)(Ka)結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)相關(guān)系數(shù)(R)GMP4.53×103mol-0.8320.8320.9985GDP6.82×103mol-0.9030.9030.9985GTP7.06×103mol-0.8790.8790.9884ADP1.88×103mol-0.7780.7780.9950

表1結(jié)果顯示,表達(dá)純化的EoARF1蛋白能夠與嘌呤核苷酸相互作用,且結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n≈1,與GMP、GDP和GTP的結(jié)合常數(shù)分別為4.53×103mol-、6.82×103mol-、7.06×103mol-,表明其與鳥嘌呤核苷酸作用強(qiáng)弱順序?yàn)镚TP>GDP>GMP,此外與ADP的結(jié)合常數(shù)為1.88×103mol-,表明EoARF1蛋白與GDP的結(jié)合強(qiáng)度大于與ADP的結(jié)合,與重組hARF1與嘌呤核苷酸結(jié)合性質(zhì)一致[14]。

3 討論

真核細(xì)胞中許多大分子物質(zhì)的運(yùn)輸需要通過囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)完成,其中COP I(coat protein I)型囊泡主要介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體之間和高爾基體內(nèi)部的轉(zhuǎn)運(yùn)過程[20],ARF1蛋白是COPⅠ包被的囊泡運(yùn)輸中重要的調(diào)節(jié)蛋白。ARF1在GDP結(jié)合型和GTP結(jié)合型兩種構(gòu)象間循環(huán),當(dāng)它與GDP結(jié)合時(shí)為非活性狀態(tài),位于胞質(zhì)中,而與GTP結(jié)合時(shí)為活性狀態(tài),可以錨定在膜上,這種狀態(tài)的ARF1能夠啟動COPⅠ囊泡的形成[21]。本研究主要將單細(xì)胞真核生物八肋游仆蟲的ARF1基因在大腸桿菌BL21中進(jìn)行了表達(dá)純化,得到高純度的重組蛋白,利用光譜學(xué)手段研究了重組EoARF1蛋白與嘌呤核苷酸的相互作用。

Fig.4 Alignment of deduced amino acid sequence of ARF1 from different organisms.The blue box shows the conserved motif involved in GTP dissociation.The red boxes show the conserved motifs involved in GTP binding.The red triangle indicates G2, the site of N-terminal myristoylation afterco-translational removal of methionine.The red asterisks indicate the frameshift region圖4 八肋游仆蟲ARF1與其他生物的ARF1的氨基酸序列比對圖。藍(lán)色方框標(biāo)注的是保守的GTP解離結(jié)構(gòu)域,紅色方框標(biāo)注的是保守的GTP結(jié)合結(jié)構(gòu)域,紅色三角形標(biāo)注的是N末端十四烷基化位點(diǎn)G2,紅色星號標(biāo)注的是移碼位點(diǎn)

分析八肋游仆蟲ARF1基因序列時(shí)發(fā)現(xiàn),該基因是一個(gè)編程性核糖體移碼基因(programmed ribosomal frameshift, PRF),編程性核糖體移碼是指翻譯中的核糖體在mRNA上的特定位置,從起始的0讀框轉(zhuǎn)換到+1或-1讀框,然后繼續(xù)翻譯的現(xiàn)象[22],目前已經(jīng)在多種生物中發(fā)現(xiàn)這種現(xiàn)象的存在。編程性核糖體移碼是在翻譯水平上的一種基因表達(dá)調(diào)控方式。本實(shí)驗(yàn)室通過基因組轉(zhuǎn)錄組研究發(fā)現(xiàn),八肋游仆蟲中存在高頻率的編程性核糖體移碼現(xiàn)象[18]。八肋游仆蟲的ARF1基因移碼位點(diǎn)位于距翻譯起始109氨基酸殘基處,對應(yīng)的氨基酸序列為107-EFFN-110 (圖4,星號表示),如果不發(fā)生移碼,只能形成一個(gè)截短蛋白。有文獻(xiàn)報(bào)道,利用分子對接法表明重組hARF1蛋白與嘌呤核苷酸的結(jié)合位點(diǎn)位于高度保守的GDP結(jié)合區(qū)域(126-NKQD-129),且GDP能通過與TCAT結(jié)構(gòu)域(158-TCAT-161)的相互作用來增加其穩(wěn)定性,其中Ala-160與鳥嘌呤堿基形成氫鍵[14]。該分子對接結(jié)果提示,這種相互作用既有嘌呤核苷酸分子中磷酸基團(tuán)的參與,也有堿基的作用[14]。八肋游仆蟲ARF1與鳥嘌呤核苷酸作用的熒光光譜結(jié)果顯示其結(jié)合強(qiáng)弱順序?yàn)镚TP>GDP>GMP,體現(xiàn)了磷酸基團(tuán)在結(jié)合中的重要性；同時(shí),當(dāng)比較鳥嘌呤核苷酸GDP以及腺嘌呤核苷酸ADP與EoARF1結(jié)合常數(shù)時(shí),表明EoARF1蛋白與GDP的結(jié)合強(qiáng)度大于與ADP的結(jié)合,體現(xiàn)了堿基在相互作用中的重要性。因此,本研究從實(shí)驗(yàn)上支持了利用hARF1與嘌呤核苷酸分子對接結(jié)果。

比較八肋游仆蟲ARF1與其他生物的ARF1氨基酸序列發(fā)現(xiàn),游仆蟲的ARF1序列中也同樣含有保守氨基酸序列NKXD(圖4,見紅色方框),然而這個(gè)結(jié)構(gòu)域在移碼位點(diǎn)之后。如果這個(gè)基因在游仆蟲體內(nèi)是有功能的,在蛋白質(zhì)翻譯時(shí)必須通過一次+1移碼產(chǎn)生一個(gè)包括NKXD結(jié)構(gòu)域的完整蛋白,才能與GDP結(jié)合,發(fā)揮其囊泡運(yùn)輸?shù)恼{(diào)節(jié)功能。游仆蟲ARF1的TCAT相應(yīng)結(jié)構(gòu)域處是CCAL(圖4,紅色方框),保守的Ala氨基酸可與鳥嘌呤形成氫鍵,增強(qiáng)了鳥嘌呤與ARF1結(jié)合的穩(wěn)定性。本研究為后續(xù)游仆蟲ARF1特異性抗體制備提供了實(shí)驗(yàn)材料,同時(shí)也為游仆蟲編程性核糖體移碼機(jī)制的研究提供了新思路。

[1] Andersson M X,Sandelius A S.A Chloroplast-localized Vesicular Transport System: A Bio-informatics Approach[J].BMCGenomics,2004,5(1):40-48.DOI:10.1186/1471-2164-5-40.

[2] D’Souza-Schorey C,Chavrier P.ARF Proteins:Roles in Membrane Traffic and Beyond[J].Naturereviews.Molecularcellbiology,2006,7:347-358.DOI:10.1038/nrm1910.

[3] Davis J E,Xie X,Guo J,etal.ARF1 Promotes Prostate Tumorigenesis Via Targeting Oncogenic MAPK Signaling[J].Oncotarget,2016;9405.DOI:10.18632/oncotarget.9405.

[4] Dong C,Zhang X,Zhou F,etal.ADP-ribosylation Factors Modulate the Cell Surface Transport of Gprotein-coupled Receptors[J].JPharmacolExpTher,2010,333:174-183.DOI:10.1124/jpet.109.161489.

[5] Bos J L,Rehmann H,Wittinghofer A.GEFs and GAPs:Critical Elements in the Control of Small G Proteins[J].Cell,2007,129:865-877.DOI:10.1016/j.cell.2007.05.018.

[6] Bernards A,Settleman J.GAP Control:Regulating the Regulators of Small GTPases[J].JCellBiol,2004,14:377-385.DOI:10.1016/j.tcb.2004.05.003.

[7] Gillingham A K,Munro S.The Small G Proteins of the Arf family and Their Regulators[J].AnnuRevCellDevBiol,2007,23:579-611.DOI:10.1146/annurev.cellbio.23.090506.123209.

[8] Franco M,Boretto J,Robineau S,etal.ARNO3,a Sec7-domain Guanine Nucleotide Exchange Factor for ADP Ribosylation Factor 1,is Involved in the Control of Golgi Structure and Function[J].ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1998,95:9926-9931.DOI:10.1073/pnas.95.17.9926.

[9] Randazzo P A,Kahn R A.Myristoylation and ADP-ribosylation Factor Function[J].Methodsinenzymology，1995,250:394-405.DOI:org/10.1016/0076-6879(95)50087-1.

[10] Mossessova E,Corpina R A,Goldberg J.Crystal Structure of ARF1*Sec7 Complexed with Brefeldin A and Its Implications for the Guanine Nucleotide Exchange Mechanism[J].MolecularCell,2003,12:1403-1411.DOI:org/10.1016/S1097-2765(03)00475-1.

[11] Chavrier P,Goud B.The Role of ARF and Rab GTPases in Membrane Transport[J].CurrentOpinioninCellBiology,1999,11:466-475.DOI:10.1016/S0955-0674(99)80067-2.

[12] Kahn R A,Der C J,Bokoch G M.The Ras Superfamily of GTP-binding Proteins:Guidelines on Nomenclature[J].FASEBJ,1992,6:2512-2513.

[13] Myers K R,Casanova J E.Regulation of Actin Cytoskeleton Dynamics by Arf-family GTPases[J].TrendsCellBiol,2008,18:184-192.DOI:10.1016/j.tcb.2008.02.002.

[14] 鄭芳芳,阮路,劉艷,等.人類ARF1蛋白的重組表達(dá)及其與GDP/ADP的弱相互作用[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào),2011,6:1053-1058.

[15] Li J J,Nie Y,Dang X H,etal.Characterization of a Rab11 Homologye,EoRab11a,inEuplotesoctocarinatus[J].FEMSMicrobiologyLetters,2009,292(2):222-230.DOI:10.1111/j.1574-6968.2009.

[16] Hiromasa Y,Roche T E.Critical Role of Specific Ions for Ligand-induced Changes Regulating Pyruvate Dehydrogenase Kinase Isoform 2[J].Biochemistry,2008,47:2298-2311.DOI:10.1021/bi701475f.

[17] 徐倩,鄧丹丹,曹志娟,等.熒光法和分子對接研究4種黃酮與血清白蛋白的相互作用[J].分析化學(xué),2010,38(4):483-487.DOI:10.3724/SP.J.1096.2010.00483.

[18] Wang R,Xiong J,Wang W,etal.High Frequency of +1 Programmed Ribosomal Frameshifting inEuplotesoctocarinatus[J].ScientificReports,2016,6:21139.DOI:10.1038/srep21139.

[19] Wang X,Yao M Z,Yang B S,etal.Enzymology and Thermal Stability of Phytase AppA Mutants[J].RSCAdv,2015,5,43863.DOI:10.1039/c5ra02199e.

[20] Beck R,Rawet M,Wieland F T,etal.The COPI System:Molecular Mechanisms and Function[J].FEBSLett,2009,583(17):2701-2709.DOI: 10.1016/j.febslet.2009.07.032.

[21] Nie Z,Hirsch D S,Randazzo P A.Arf and Its Many Interactors[J].CurrOpinCellBiol,2003,15(4):396-404.DOI:org/10.1016/S0955-0674(03)00071-1.

[22] Caliskan N,Peske F,Rodnina M V.Changed in Translation:mRNA Recoding by-1 Programmed Ribosomal Frameshifting[J].TrendsinBiochemicalSciences,2015,40:265-274.DOI:10.1016/j.tibs.2015.03.006.

Expression and Purification of a Recombinant ARF1 ofEuplotesoctocarinatusand Its Interaction with Purine Nucleotides

ZHAO Xuemei1,SONG Jianying1,WANG Xi1,WANG Ruanlin1,YANG Binsheng2,LIANG Aihua1*

(1.Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education, Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006,China;2.Institute of Moleculat Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China)

ADP ribosylation factor 1 (ARF1) is a member of the Ras superfamily, which regulate the intracellular vesicle transport and thereby affect the cell growth and development. In order to study the function of ARF1 fromEuplotesoctocarinatus, a recombinant plasmid pET28a-ARF1 was constructed and expressed inE.coliBL21. High purity of EoARF1 was obtained. The interaction between EoARF1 with purine nucleotides was investigated by using fluorescence spectroscope. The results showed that the EoARF1 protein could interact with purine nucleotides, the binding site value was nearly one and the intensity of the interaction with guanine nucleotides was GTP>GDP>GMP. In addition, the binding constant indicated that the interaction between EoARF1 and GDP was stronger than that of ADP.

ADP ribosylation factor 1;Euplotesoctocarinatus;expression and purification;fluorescent spectrometry

10.13451/j.cnki.shanxi.univ(nat.sci.).2017.02.026

2016-12-22；

2017-02-17

國家自然科學(xué)基金(31372199；31272100)

趙雪梅(1990-)，女，山西朔州人，碩士研究生，研究方向?yàn)樵鷦游锛?xì)胞分子生物學(xué)。E-mail:464391230@qq.com

*通信作者：梁愛華(LIANG Aihua),E-mail:aliang@sxu.edu.cn

Q74

A

0253-2395(2017)02-0365-08