時濤 蔡吉苗 李超萍 陳奕鵬 李博勛 黃貴修

摘 要 由地毯草黃單胞木薯萎蔫致病變種（Xanthomonas axonopodis pv.manihotis）侵染引起的細菌性萎蔫病是世界范圍內木薯種植中的重要病害，也是為害中國木薯最嚴重的病害。目前，國內外有關該病病原菌致病分子機理方面的研究還很少，制約了相關防控工作的開展。本項目組在前期構建國內菌株XamGX11的轉化子庫的基礎上，開展了7個致病相關突變體的分子鑒定、表型變異評價、插入位點側翼序列的分離和相關基因的分子分析等研究，發(fā)現(xiàn)氨基轉移酶、葡萄糖-果糖氧化還原酶等基因可能參與病原菌的致病過程。

關鍵詞 木薯細菌性萎蔫病菌；突變體；基因分析

中圖分類號 S533.24 文獻標識碼 A

Identification and Molecular Analysis of Integration Flanking Genes

from Seven Xanthomonas axonopodis pv. manihotis

Pathogenicity-related Mutants

SHI Tao， CAI Jimiao， LI Chaoping， CHEN Yipeng， LI Boxun， HUANG Guixiu*

Environment and Plant Protection Institute， CATAS / Key Laboratory of Integrated Pest Management on Tropical Crops， Ministry of Agriculture / Hainan Key Laboratory for Monitoring and Control of Tropical Agricultural Pests， Haikou， Hainan， 571101， China

Abstract Cassava bacterial blight caused by Xanthomonas axonopodis pv. manihotis is one kind of important disease worldwide， and it is the most serious disease in the cassava plantations of China too. A few reports were focused on the molecular pathogenic mechanism of X. axonopodis pv. manihotis in the world. As a result， the prevention and control work related of cassava bacterial blight was seriously affected. The transposon library of X. axonopodis pv. manihotis strain XamGX11 was constructed， and 7 mutants were screened. The identification， variation evaluation of physiology and biochemistry characteristics， separation of flanking sequences and molecular analysis of related genes of these mutants were finished. All the results showed the aminotransferase， glucose-fructose oxidoreductase and some other genes may play an important role in the infection process of X. axonopodis pv. manihotis.

Key words Xanthomonas axonopodis pv. manihotis； mutants； gene analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.09.018

木薯（Manihot esculenta Crantz）為大戟科（Euphorbiaceae）木薯屬灌木狀多年生作物，是和馬鈴薯、甘薯并稱的三大薯類作物之一。木薯具有高產、高淀粉、耐旱耐貧瘠等優(yōu)點，起源于熱帶美洲地區(qū)，后傳入非洲和亞洲，目前種植范圍遍及100多個國家和地區(qū)[1]。1820年前后，木薯自東南亞傳入中國，目前在廣西、海南、廣東、江西等地區(qū)普遍種植，近年來栽培面積一直在40萬hm2左右，已形成比較成熟的木薯產業(yè)鏈[2]，產量不能自給，是世界上最大的進口國[3]，每年約80%的鮮薯及干片需要進口。

由地毯草黃單胞木薯萎蔫致病變種（Xanthomonas axonopodis pv. manihotis，Xam）引起的細菌性萎蔫病，也稱細菌性枯萎病，是一種世界性病害，廣泛發(fā)生于亞洲、非洲和美洲的木薯產區(qū)[4-6]。項目組前期調查表明，該病在廣西、海南、廣東、江西等地普遍發(fā)生，主栽品種均不具抗性，是為害中國木薯最嚴重的病害[7-8]。有關Xam的致病機理，國內外研究還很少。國外完成了67個菌株的基因組序列測定，并證明TALE1基因和致病性相關[9-11]。中國熱帶農業(yè)科學院也完成了菌株XamGX11的基因組測序并證明hrpG基因和致病性相關[12]。在前期利用EZ：：TN轉座體構建病原菌轉化子庫的基礎上[13]，本研究開展了7個致病相關突變體的分子鑒定、表型變異評價及相關基因的分子分析等方面研究，以期為后續(xù)研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 木薯品種、供試菌株和培養(yǎng)基 木薯品種‘新選048，由中國熱帶農業(yè)科學院熱帶作物品種與資源研究所提供，中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所已證明其感細菌性萎蔫病[8]。木薯細菌性萎蔫病菌菌株XamGX11及各轉化子由中國熱帶農業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所提供。菌株培養(yǎng)選用YPG、NA、M210、NYGB等培養(yǎng)基，配方參見方中達主編的《植病研究方法》[14]。

1.1.2 生物試劑、引物、菌株 DNA片段膠回收試劑盒和pMD18-T載體購買自寶生物工程（大連）有限公司；Taq酶、dNTPs和大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞購買自天根生化科技（北京）有限公司；引物TMK1（5′-CCTCTTCCGACCATCAAGCA-3′）、TKM2（5′-ACTCACCGAGGCAGTTCCAT-3′）、SP1（5′-GA

TAGATTGTCGCACCTGATTG-3′）、SP2（5′-ACTCA

CCGAGGCAGTTCCAT-3′）、SP3（5′- GCAATGTAA

CATCAGAGATTTTGAG-3′）、SPF1（5′-ATCAGATC

ACGCATCTTCCC-3′）、SPF2（5′-ACCTACAACAAA

GCTCTCATCAACC-3′）、SPF3（5′-AGATGTGTATA

AGAGACAG-3′）、AD5[5′-AG（A/T）GNAG（A/T）AN

CA（A/T）AGG-3′]、AD6[5′-CA（A/T）CGICNGAIA（G/C）GAA-3′]和AD8[5′-（G/C）TTGNTA（G/C）TNCT

NTGC-3′]由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。其它試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 突變體鑒定 各突變體的致病力和遺傳穩(wěn)定性評價、PCR鑒定和southern雜交分析等參照陳江莎等[13]的方法進行。

1.2.2 突變體的表型變異評價 菌落生長速率測定參照時濤等[14]的方法進行。突變體的游動性，胞外多糖分泌、纖維素酶分泌、淀粉酶活性、生物膜形成能力等參照黃貴修[15]、許景升[16]等的方法進行評價，分別重復3次，相關數(shù)據(jù)采用SAS9.0軟件進行差異顯著性分析[17]。

1.2.3 突變體側翼序列的分離及相關基因的分子分析

參照陳江莎等[13]的方法進行。

2 結果與分析

2.1 7個突變體鑒定

2.1.1 7個突變體的篩選及致病力評價 在前期構建病原菌轉化子庫的基礎上，隨機選取960個轉化子，采用剪葉法評價各轉化子致病力變異情況。結果表明，野生型菌株XamGX11接種7 d后，葉片上形成大片水浸狀、邊緣枯黃色病斑，Xtn5756、Xtn9663、Xtn9972、Xtn7709等4個突變體形成面積較小的病斑，而Xtn8484、Xtn8113、Xtn5926等3個突變體不能形成水浸狀病斑，表明這7個突變體的致病力均嚴重減弱（圖1、2）。

2.1.2 7個突變體的分子鑒定 提取各突變體的基因組DNA后，根據(jù)外源插入片段所攜帶的卡那霉素抗性基因編碼區(qū)序列設計引物對TMK1和TMK2，進行PCR擴增，結果7個突變體均獲得大小約0.5 kb的擴增產物，而野生型菌株XamGX11無任何擴增產物。隨機選取Xtn5756、Xtn9663、Xtn8484、Xtn8113等4個突變體的擴增產物，回收、克隆測序后，比對發(fā)現(xiàn)所獲序列和外源插入片段卡那霉素抗性基因編碼區(qū)完全一致。

用外源片段上無切點的EcoRⅠ對各突變體基因組DNA進行酶切處理，以前述引物對TMK1和TMK2擴增突變體Xtn5756所獲產物為探針，進行雜交處理，結果7個突變體均只有一條雜交條帶，而XamGX11無任何條帶（圖3），分析各突變體均為單位點插入。

2.1.3 7個突變體的遺傳穩(wěn)定性評價 7個突變體在YGP平板上培養(yǎng)2 d后，均能形成和野生型一致的淡黃色、粘稠狀菌落。各突變體在不含卡那霉素的YGP平板上轉接20次后，接種到含有50 μg/mL卡那霉素的YGP平板上后正常生長，而野生型菌株XamGX11不能在含卡那霉素的平板上生長，表明轉化子所攜帶的外源片段能夠穩(wěn)定遺傳。

2.2 7個突變體的表型變異評價

2.2.1 7個突變體的生長速度評價 制作了各突變體的生長曲線，結果表明突變體Xtn8113和Xtn5926進入對數(shù)生長期時間顯著晚于野生型菌株XamGX11，表明這2個突變體的生長速度下降。Xtn7709和Xtn8484早于XamGX11進入對數(shù)生長期，表明其生長速度顯著提高，其他3個突變體的生長曲線基本和XamGX11一致，表明其生長速度和野生型無差異。

2.2.2 7個突變體的游動性評價 測量了各突變體在含0.3%、0.6%和0.9%瓊脂的半固體NA培養(yǎng)基平板上形成的菌落直徑，統(tǒng)計分析結果表明僅有Xtn7709菌落顯著變小，表明其游動性顯著降低。

2.2.3 7個突變體的生化特性評價 在NYGB培養(yǎng)基中分別加入2%脫脂奶粉、0.5%羧甲基纖維素和0.1%可溶性淀粉，接種各突變體以評價其胞外蛋白酶、纖維素酶分泌和淀粉酶活性。Xtn5756、Xtn9663和Xtn5926在3種檢測平板上形成和XamGX11類似的反應圈，表明這3種酶活性和XamGX11一致。Xtn9972的纖維素酶和淀粉酶活性下降，而Xtn8484的纖維素酶活性下降。Xtn7709的蛋白酶和纖維素酶活性下降，而Xtn8113的淀粉酶和纖維素酶活性嚴重下降（表1、2）。

2.2.4 7個突變體的胞外多糖分泌和生物膜形成能力評價 在M210液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)各個突變體，菌液離心取上清并用乙醇處理后對所獲多糖進行稱重，發(fā)現(xiàn)Xtn5926分泌的多糖顯著減少，表明其分泌胞外多糖能力下降。各突變體菌液用結晶紫染色、PBS潤洗和無水乙醇洗脫后，測量 OD490值發(fā)現(xiàn)Xtn8484生物膜形成能力提高，而Xtn9663和Xtn8113的形成能力減弱（表3）。

2.3 7個突變體的側翼序列分離和目的基因分子分析

2.3.1 7個突變體的側翼序列分離 以各突變體基因組DNA為模版，分別用簡并引物和嵌套引物配對進行Tail-PCR擴增。Xtn5756、Xtn9663和Xtn7709等3個突變體用左邊界嵌套引物和簡并引物AD8配對獲得了擴增產物，克隆、測序比對后得到長度在487～505 nt之間的側翼序列。Xtn9972和Xtn5926用右邊界嵌套引物和AD8配對獲得了長度分別為441和731 nt的側翼序列，AD6分別和左右邊界嵌套引物配對獲得了Xtn8484和Xtn8113的側翼序列，長度分別為679和1138 nt（表4）。

2.3.2 7個突變體的目的基因預測和功能分析

將各突變體側翼序列片段和菌株XamGX11基因組比對后，確認外源片段的插入位點，發(fā)現(xiàn)Xtn7709、Xtn8113和Xtn5926的插入位點位于Scaffold1，其它4個分別位于Scaffold2、Scaffold3、Scaffold15和Scaffold16。提取插入位點上下游各約3.0 kb序列后進行目的基因預測，7個預測基因編碼區(qū)長度在597～1794 nt之間，其中Xtn9663、Xtn9972和Xtn8484的外源片段插入預測基因編碼區(qū)的5′端，Xtn5756、Xtn7709和Xtn5926的外源片段插入預測基因編碼區(qū)的3′端，而Xtn8113插入目的預測基因編碼區(qū)上游0.1 kb。Xtn5756、Xtn9663、Xtn9972、Xtn7709和Xtn5926等突變體預測基因的蛋白產物分別和黃單胞類病原細菌的氨基轉移酶、乙酰鳥氨酸氨甲酰轉移酶、克拉維胺合成酶、鉀轉運ATP酶A亞基、蛋白酶和葡萄糖-果糖氧化還原酶等預測基因有較高的同源性，分析其分別參與相關的代謝過程，外源片段的插入破壞了目的基因的功能而導致致病力下降。突變體Xtn8484的預測基因編碼產物和辣椒瘡痂病菌IV型系統(tǒng)成員蛋白酶TraF同源性較高，該基因缺失后可能影響了蛋白質等生物大分子的轉運，因此對侵染過程造成了不利影響。Xtn5926預測基因的編碼蛋白產物和地毯草黃單胞柑橘致病變種保守基因有很高的同源性，但其功能未知。各突變體測序片段擴增所用引物對、插入位點及分析結果見表4。

3 討論

本研究對所獲的7個致病相關突變體開展了相關研究，發(fā)現(xiàn)外源片段均為單位點插入，除致病力減弱外，分別在生長速度、游動性、胞外蛋白酶、纖維素酶分泌、淀粉酶、胞外多糖和生物膜形成能力等方面存在著變異情況。各突變體側翼序列的分離和目的基因的預測結果表明氨基轉移酶、乙酰鳥氨酸氨甲酰轉移酶、克拉維胺合成酶等蛋白參與Xam與木薯之間的互作反應，功能受影響后產生表型的變異和致病力減弱現(xiàn)象。

通常認為，胞外酶在植物病原細菌的致病過程中發(fā)揮重要作用。岑貞陸等[18]研究發(fā)現(xiàn)胞外淀粉酶在Xam病菌的致病反應中起重要作用，其活性和葉片上病斑面積密切相關。本研究發(fā)現(xiàn)和野生型菌株XamGX11相比，突變體Xtn9972的淀粉酶活性下降并形成較小的病斑，而Xtn8113的活性嚴重下降并且不能形成病斑，這一點和岑貞陸等的研究結果是一致的，分析克拉維胺合成酶和葡萄糖-果糖氧化還原酶可能參與Xam病菌的淀粉酶合成和分泌反應。胞外多糖的合成能力和植物病原細菌的致病力之間是正相關的[19]。胞外多糖（EPS）是黃單胞病原菌的重要毒力因子，水稻白葉枯病菌缺失EPS合成必須的gumM基因后，失去合成EPS的能力，同時毒性喪失[20]。Xtn5926的預測基因和黃單胞類病原菌的一個保守預測蛋白具較高的同源性，分析該類蛋白可能參與黃單胞病菌的EPS合成，被破壞后降低了致病力。

革蘭氏陰性細菌的Ⅳ型分泌系統(tǒng)能夠介導DNA的水平轉移以及蛋白質等大分子物質的轉移，參與致病過程。Xtn8484的預測基因和辣椒瘡痂病菌IV型分泌系統(tǒng)的蛋白酶TraF具有較高的同源性，分析該基因功能的喪失可能影響了該分泌系統(tǒng)的功能，從而降低了病原菌的致病力。

利用外源片段在病原菌染色體上的隨機插入，構建轉化子庫，從中篩選出致病力變異突變體，以插入片段為標記進行目的基因的功能研究，是病原菌致病相關基因克隆的常用技術。蔡志英等[21]、裴月令等[22]、黃貴修等[15]分別采用T-DNA插入技術構建了橡膠樹膠孢炭疽病菌、西瓜枯萎病菌和水稻白葉枯病菌的轉化子庫并篩選到一批變異突變體。曾申艷等[23]、韋珂等[24]在篩選出致病力變異突變體的基礎上，開展了相關基因的功能鑒定工作。本研究同樣在前期研究基礎上開展了相關突變體的鑒定和插入位點基因的分析研究，后續(xù)將進行各個預測基因的缺失和互補等方面研究，進一步驗證其功能。

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