宋娟 張霽紅 胡生海 李明澤

摘要：以新鮮蘋果渣為主要原料，采用果膠酶法對蘋果渣的酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵工藝進行優(yōu)化研究，通過正交試驗確定最優(yōu)釀造工藝參數(shù)。初步獲得的蘋果渣酒精發(fā)酵條件是果膠酶添加量0.06%、酵母接種量8%、初始糖度16 °Brix；蘋果渣醋酸發(fā)酵過程的最優(yōu)工藝條件是干濕蘋果渣的配料比為1 ∶ 10、醋酸菌接種量15%、發(fā)酵溫度32 ℃，此條件下總酸含量增長到38.267 6 g/L。

關(guān)鍵詞：蘋果渣；固態(tài)發(fā)酵；蘋果醋

中圖分類號：TS275.4 文獻標志碼：A 文章編號：1001-1463（2017）08-0048-06

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2017.08.012

Research on Apple Vinegar Production from Apple Pomace by Solid State Fermentation

SONG Juan， ZHANG Jihong， HU Shenghai， LI Mingze

（Institute of Agricultural Product Storage and Processing，Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：To transform waste into assets that disposing of apple process， using fresh apple pomace as the main ingredient. Being used pectinase enzymatic to study of alcohol fermentation and acetic acid fermentation technology， and orthogonal experimental design is applied for optimi -zing fermentation technical parameters. We have preliminary obtained the optimal conditions of alcohol fermentation is the addition amount of pectinase 0.06%， yeast inoculation quantity 8%， initial sugar degree 16°Brix. And the optimal conditions of acetic fermentation is dried apple pomace：fresh apple pomace 1：10， acetic bacteria inoculation quantity 15%， fermentation temperature 32 ℃， the acidity increase is 38.267 6 g/L under this condition.

Key words：Apple pomace；Solid state fermentation；Apple vinegar

蘋果被中國農(nóng)業(yè)部確定為11 種具有明顯競爭力的特色優(yōu)勢農(nóng)產(chǎn)品之一[1 ]，其產(chǎn)量占國內(nèi)水果總產(chǎn)量的26.6%[2 ]，是中國第一大果品產(chǎn)業(yè)[3 ]，且年產(chǎn)量居世界第一位[4 ]。從蘋果的消費及深加工方面來 看[5 ]，目前我國鮮食蘋果消費量占蘋果消費總量的64%，蘋果加工制品的消費量約占蘋果消費總量的36%。蘋果加工過程中會產(chǎn)生大量的下腳料（果皮、果核和殘余果肉），占原料總量的20%～50%。我國年產(chǎn)蘋果約2 000 萬t，在加工果汁的過程中所排出的果渣約有100萬多t。蘋果渣中富含較高水分（約75%～80%）[6 ]、豐富的多糖和酚類等具有藥用價值的營養(yǎng)物質(zhì)，并且香味濃郁，具有較高的二次加工潛能[7 - 10 ]。但是，蘋果渣綜合利用率尚不足10%[5 ]，僅有少量用作飼料，其余當作廢棄物處理， 堆積后腐爛變質(zhì)，造成資源的浪費和環(huán)境的污染[11 ]，成為困擾果汁企業(yè)的難題。針對這一問題，目前解決途徑主要是從蘋果渣中提取生物活性物質(zhì)進行加工[12 ]，開發(fā)成功能食品，主要包括（1）蘋果渣飲料（膳食纖維飲料、果醋飲料）。（2）提取有效物質(zhì)，采用高壓脈沖電 場[13 ] 、酶法[14 ]等技術(shù)進行蘋果果膠的提取與優(yōu) 化[15 ]；以及采用酸法[16 ]、超聲[17 ]、微波[18 - 19 ]等手段對蘋果多酚進行提取與純化[20 ]。（3）采用生物發(fā)酵[21 ]、多菌種固態(tài)發(fā)酵法[22 - 23 ]生產(chǎn)蘋果渣復(fù)合蛋白飼料[24 - 25 ]。我們在蘋果醋液態(tài)發(fā)酵研究的基礎(chǔ)上，采用果膠酶法[26 ]對蘋果渣發(fā)酵制作蘋果醋固態(tài)的工藝進行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 蘋果渣為蘋果白蘭地加工過程產(chǎn)生的下腳料，甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所提供）。酵母菌CICC1750、醋酸菌CICC20056購自中國微生物菌種保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，自來水1 000 mL，pH 6.0。液體培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母膏1%，無水乙醇3%，pH 4.5。固體培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母膏1%，無水乙醇3%，瓊脂2%，pH 4.5。121 ℃，30 min高壓滅菌，備用。

1.1.3 試劑 氫氧化鈉（粒），分析純（天津大茂）；葡萄糖（上海廣諾）；酵母膏（北京奧博星）；瓊脂（上海致化）；無水乙醇、碳酸鈣、酚酞（天津光復(fù)）；果膠酶（> 50 000 u/g，上海源聚）。

1.2 實驗儀器

BSA224S-CW電子天平（賽多利斯）；YXQ-LS立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海博訊）；ZHJH-C1112B超凈工作臺（上海智城）；ZWY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城）；LRH-250生化培養(yǎng)箱（上海一恒）；TGL-16MC冷凍離心機（長沙維爾康）；HH-S4電熱恒溫水浴鍋（北京科偉）； KDM-2000型可調(diào)式電熱套（北京科偉）；堿式滴定管（上海國藥）；PAL-1糖度計：JAPAN ATAGO；酒精計（河北科化）。

1.3 實驗方法

1.3.1 工藝流程 蘋果→分選→清洗→破碎→汁、渣分離→果膠酶處理蘋果渣→糖化→酵母菌液→酒精發(fā)酵→測定酒精體積分數(shù)和糖度→加干蘋果渣、醋酸菌→固態(tài)醋酸發(fā)酵→測定酒精體積分數(shù)和總酸含量

1.3.2 菌種活化 購置的凍干保藏菌種先打管復(fù)活，將溶解后的菌懸液轉(zhuǎn)移至盛有4～5 mL液體培養(yǎng)基的試管中，并取100 μL轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基，一代菌種需延長培養(yǎng)時間，再轉(zhuǎn)接至2～3代恢復(fù)活力，備用。

1.3.3 發(fā)酵蘋果渣制備 將鮮渣90 ℃殺菌10 min，冷卻備用；將鮮渣經(jīng)過太陽能干燥脫水處理得到的干蘋果渣真空保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 蘋果渣發(fā)酵的指標測定方法 糖度用手持糖度儀測定；酒精體積分數(shù)采用蒸餾法測定[27 ]； 總酸含量采用酸堿滴定法測定[28 ]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果渣酒精發(fā)酵工藝研究

2.1.1 果膠酶添加量對蘋果渣酒精發(fā)酵的影響 取5份同質(zhì)量（500 g）的蘋果渣，其中1份不添加果膠酶，作為對照樣品，4份果膠酶添加量分別為0.01%、0.02%、0.04%、0.06%，攪拌均勻，在水浴鍋中45 ℃酶解4 h。酶解后接種8%酵母菌、初始糖度調(diào)整到15 °Brix。24 ℃發(fā)酵，檢測到酒精體積分數(shù)不增加、糖度不降低時結(jié)束酒精發(fā)酵，記錄酒精體積分數(shù)。

從圖1可知，隨著果膠酶添加量的增大，酒精體積分數(shù)也在增大，可見蘋果渣酒精發(fā)酵的酒精體積分數(shù)與果膠酶添加量呈正相關(guān)。當果膠酶添加量大于0.02%時，酒精體積分數(shù)的增加趨勢比較緩和，綜合考慮，選擇果膠酶添加量范圍0.02%～0.06%。

2.1.2 酵母接種量對蘋果渣酒精發(fā)酵的影響 取5份同質(zhì)量（500 g）蘋果渣，依次接種2%、4%、6%、8%、10%酵母菌，攪拌均勻，果膠酶添加量為0.02%，初始糖度調(diào)整到15 °Brix。24 ℃發(fā)酵，檢測到酒精體積分數(shù)不增加、糖度不降低時結(jié)束酒精發(fā)酵，記錄酒精體積分數(shù)。

從圖2可以看出，發(fā)酵周期的長短與酵母接種量密切相關(guān)。隨著酵母接種量的增大，酒精體積分數(shù)先升高后降低，酵母接種量8%時酒精體積分數(shù)達到最大值，故選擇酵母接種量范圍6%～10%。

2.1.3 初始糖度對蘋果渣酒精發(fā)酵的影響 取5份同質(zhì)量（500 g）蘋果渣，其中1份蘋果渣初始糖度為13 °Brix，作為對照樣品，后4份調(diào)整糖度到14 °Brix、15 °Brix、16 °Brix、17 °Brix，攪拌均勻，接種8%酵母菌、果膠酶添加量為0.02%。24 ℃發(fā)酵，檢測到酒精體積分數(shù)不增加、糖度不降低，即可結(jié)束酒精發(fā)酵，記錄酒精體積分數(shù)。

從圖3可知，隨著初始糖度的增加，酒精體積分數(shù)也在增加，然而糖度越大，其酒精體積分數(shù)增加趨于平緩，故選擇初始糖度范圍15 ～ 17 °Brix。

2.1.4 酒精發(fā)酵最佳工藝參數(shù)的確定 在以上3個單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇果膠酶添加量（A）、酵母接種量（B）、初始糖度（C），設(shè)計三因素三水平L9（33）的正交試驗，以酒精體積分數(shù)為指標，確定酒精發(fā)酵最佳工藝參數(shù)。正交試驗設(shè)計見表1。從表2可知，第8組和第9組試驗的酒精體積分數(shù)最大，為7.0。

從表3可知，通過正交試驗分析，得到蘋果渣酒精發(fā)酵的各因素主次關(guān)系為A > B > C，即果膠酶添加量 > 酵母接種量 > 初始糖度。綜合各因素K值和直觀比較分析，獲得蘋果渣酒精發(fā)酵的最佳工藝組合為：A3B2C2。

然而，最佳工藝組合A3B2C2沒有出現(xiàn)在正交試驗中，所以將優(yōu)化組合A3B2C2與表2中的8號組合A3B2C1、9號組合A3B3C2進行驗證，以酒精體積分數(shù)為考察指標，結(jié)果見表4。

由表4可知，最佳組合（A3B2C2）的酒精體積分數(shù)為7.2%，大于表2中所有組合數(shù)值，因此初步獲得的蘋果渣酒精發(fā)酵最優(yōu)工藝參數(shù)是A3B2C2，即果膠酶添加量0.06%、酵母接種量8%、初始糖度16 °Brix。

2.1.5 酒精發(fā)酵過程中酒精體積分數(shù)和糖度的變化 從圖4可知，隨著發(fā)酵時間的延長，酒精體積分數(shù)也在逐漸增加，2 ～4 d增加明顯，5～7 d增加緩慢，因此選控好酒精積累的最佳時間點對生產(chǎn)有重大意義。另外，隨著發(fā)酵時間的延長，糖度呈現(xiàn)下降趨勢，1 ～4 d明顯降低，5 ～7 d 緩慢降低，初步判斷酒精發(fā)酵停止。

2.2 蘋果渣醋酸發(fā)酵工藝研究

2.2.1 配料比對醋酸發(fā)酵的影響 將經(jīng)太陽能烘干處理的干蘋果渣和濕蘋果渣分別按照1 ∶ 8、1 ∶ 9、1 ∶ 10、1 ∶ 11、1 ∶ 12配料比進行混合，然后按10%接種醋酸菌，攪拌均勻，30 ℃發(fā)酵7 d左右，測定總酸含量。

從圖5可知，組配料比在14 d的總酸含量以1 ∶ 10最大，1 ∶ 12最小。添加干蘋果渣是為了疏松醋醅，促進空氣流通。隨著時間的延長，配料中干蘋果渣的含量越低，發(fā)酵液的總酸含量越低，主要是由于發(fā)酵液內(nèi)的空氣流通量降低，醋酸菌呼吸需氧量不足而導(dǎo)致產(chǎn)酸速率降低。因此，選擇干濕蘋果渣的配料比是1 ∶ 8，1 ∶ 9和 1 ∶ 10。

2.2.2 醋酸菌接種量對醋酸發(fā)酵的影響 將經(jīng)太陽能干燥處理的干蘋果渣和濕蘋果渣按照1：10進行混合，然后分別接種2%、5%、10%、15%、20%醋酸菌，攪拌均勻，30 ℃發(fā)酵7 d左右，測定總酸含量。

如圖6所示，5組醋酸菌接種量在14 d的總酸含量是15%最大，2%最小。因為醋酸菌可以將乙醇氧化產(chǎn)生乙酸，隨著發(fā)酵時間的延長，醋酸菌接種量越大，發(fā)酵液的總酸含量也伴隨著不同程度的升高。因此，選擇醋酸菌接種量是10%、15%和20%。

2.2.3 發(fā)酵溫度對醋酸發(fā)酵的影響 將經(jīng)太陽能烘干處理的干蘋果渣和濕蘋果渣按照1∶10進行混合，然后按10%接種醋酸菌，攪拌均勻，依次放入24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃、32 ℃培養(yǎng)箱中，發(fā)酵7 d左右，測定總酸含量。

從圖7可知，5組溫度處理在14 d的總酸含量是32 ℃最大，24 ℃最小?？梢姕囟仁怯绊懮锩富畹闹匾獥l件。隨著時間的延長，適宜的溫度越高，發(fā)酵液的總酸含量越高，這主要是由于最適溫度保證了醋酸菌代謝活躍，提高了產(chǎn)酸速率。因此，選擇醋酸發(fā)酵溫度是28 ℃、30 ℃和32 ℃。

2.2.4 醋酸發(fā)酵最佳工藝參數(shù)的確定 在以上3個單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇干濕蘋果渣的配料比（A）、醋酸菌接種量（B）、發(fā)酵溫度（℃），設(shè)計三因素三水平L9（33）正交試驗，以總酸含量為指標，確定醋酸發(fā)酵最佳工藝參數(shù)。正交試驗設(shè)計見表5，結(jié)果見表6。從表6可知，第5組試驗的總酸含量最高，為37.945 2 g/L。

從表7可知，通過正交試驗分析，獲得醋酸發(fā)酵的各因素主次關(guān)系為C > B > A，即發(fā)酵溫度 > 醋酸菌接種量 > 配料比。其中，發(fā)酵溫度是顯著因素。綜合各因素K值和直觀比較分析，獲得蘋果渣醋酸發(fā)酵的最佳工藝組合為：A3B2C3。

然而，最佳工藝組合A3B2C3沒有出現(xiàn)在正交試驗中，所以將優(yōu)化組合A3B2C3與表6中的組合A2B2C3進行驗證，以總酸含量為考察指標，見表8。由表8可知，最佳組合（A3B2C3）的總酸含量為38.267 6 g/L，大于表6中所有組合數(shù)值，因此初步獲得蘋果渣醋酸發(fā)酵最優(yōu)工藝參數(shù)是A3B2C3，即干濕蘋果渣的配料比為1∶10、醋酸菌接種量15%、發(fā)酵溫度32 ℃。

2.2.5 醋酸發(fā)酵過程中酒精體積分數(shù)和總酸含量的變化

從圖8可知，隨著發(fā)酵時間的延長，總酸含量也在逐漸增加，8 ～13 d增加明顯，13～14 d增加緩慢，可能是由于醋酸被過度氧化產(chǎn)生CO2使得總酸含量增加幅度變小。因此選控好總酸含量積累的最佳時間點對生產(chǎn)有重大意義。另外，隨著發(fā)酵時間的延長，酒精體積分數(shù)呈現(xiàn)下降趨勢，14 d降到最小值，初步判斷醋酸發(fā)酵停止。

3 結(jié)論

本研究以廢棄的新鮮蘋果渣為主要原料，通過果膠酶法對蘋果渣發(fā)酵工藝進行研究，獲得了預(yù)期的蘋果渣固態(tài)發(fā)酵的關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)。蘋果渣酒精發(fā)酵的最優(yōu)技術(shù)參數(shù)為膠酶添加量0.06%、酵母接種量8%、初始糖度16 °Brix，此組合的酒精體積分數(shù)高達7.2%。蘋果渣醋酸發(fā)酵的最優(yōu)技術(shù)參數(shù)為濕蘋果渣的配料比是1∶10、醋酸菌接種量為15%、發(fā)酵溫度32 ℃，此組合的總酸含量增長到38.267 6 g/L。

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（本文責編：陳 珩）