張瑋 阮龍 張欣 左曉龍

摘要[目的]從蛋白質(zhì)組水平上研究淹水脅迫對玉米種子萌發(fā)的影響，篩選重要蛋白質(zhì)，闡明相關(guān)的代謝通路，為深入研究植物種子萌發(fā)過程中的耐淹機制提供新的思路。[方法]以玉米自交系196為試驗材料，對種子萌發(fā)進(jìn)行淹水脅迫72 h處理，利用TMT標(biāo)記結(jié)合LC-MS/MS的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對蛋白質(zhì)組成進(jìn)行分析，對差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定及功能分析。[結(jié)果]此次試驗總共鑒定到1 456個蛋白，通過比較、篩選，鑒定到281個差異蛋白，其中244個上調(diào)蛋白，37個下調(diào)蛋白。通過對差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行了GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白大多參與了碳代謝、糖酵解過程、氨基酸代謝、抗逆與脅迫等過程。[結(jié)論]試驗表明淹水脅迫抑制了玉米種子的萌發(fā)，通過不同代謝類型的動態(tài)變化和不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)來提高種子耐受性。

關(guān)鍵詞玉米；定量蛋白質(zhì)組學(xué)；淹水脅迫

中圖分類號S513文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）09-0134-03

Study on Quantitative Proteomics of Maize Seed Germination in Response to Waterlogging Stress

ZHANG Wei1，RUAN Long1，ZHANG Xin2，ZUO Xiaolong1*

（1.Tobacco Research Institute，Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei，Anhui 230031；2.School of Life Sciences，Anhui Agricultural University，Hefei，Anhui 230036）

Abstract[Objective] To study the effects of waterlogging stress on maize seed germination from the level of proteome， screen important proteins and elucidate the related metabolic pathways，which provide new ideas for further study of flooding mechanism during seed germination.[Method]We chose maize inbred lines 196 as experimental materials to study the seeds germination under water stress for 72 hours.The protein composition was analyzed by TMT-labeled LC-MS/MS quantitative proteomics techniques.The differentially expressed proteins were analyzed by identification and functional analysis.[Result]A total of 1 456 proteins were identified in this trial.By comparison，we identified 281 differential proteins，of which 244 were upregulated proteins and 37 downregulated proteins.Through GO analysis and KEGG pathway analysis，we found those differential proteins were involved in the process of carbon metabolism，glycolysis，amino acid metabolism and stress resistance.[Conclusion]The experiment shows that waterlogging stress inhibits the germination of maize seed，and the seeds improve tolerance by dynamic changes of different metabolic types and different signal transduction.

Key wordsMaize；Quantitative proteomics；Waterlogging stress

我國黃淮海地區(qū)是夏玉米生產(chǎn)的重要區(qū)域[1]，這一區(qū)域的玉米種子在播種出苗過程中，剛好處于高濕、多雨季節(jié)。種子萌發(fā)是植物個體發(fā)育過程中最關(guān)鍵的時期，處于萌發(fā)時期的玉米種子對水分需求十分敏感，土壤水分過飽和會影響玉米種子的正常發(fā)育，使玉米種子的萌發(fā)受到抑制[2]。研究表明，種子在萌發(fā)時期長期處于逆境條件下，其生理、生化、遺傳和代謝等指標(biāo)會發(fā)生復(fù)雜的變化[3]。目前，有關(guān)玉米種子萌發(fā)抗逆的研究多集中在鹽脅迫[4]、水分脅迫[5]、外源激素調(diào)控[6]、真菌感染[7]、冷脅迫[8]、重金屬脅迫[9]等方面。而針對澇漬脅迫下種子萌發(fā)的蛋白響應(yīng)機制研究少見報道。揭示玉米種子對澇漬脅迫的響應(yīng)機制，可以為玉米耐澇性的研究和耐澇種質(zhì)的創(chuàng)制提供理論依據(jù)。

目前，質(zhì)譜技術(shù)已逐漸成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主流技術(shù)。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的不斷深入，定量蛋白質(zhì)組學(xué)已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的熱點之一。定量蛋白質(zhì)組學(xué)主要是針對不同狀態(tài)下蛋白質(zhì)的表達(dá)量進(jìn)行分析比較，既可以鑒定出表達(dá)的蛋白質(zhì)，又能對其豐度進(jìn)行精確定量。TMT是目前定量蛋白質(zhì)組學(xué)最為常用的體外化學(xué)標(biāo)記法之一。它是一種串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽，可以與位于肽段N末端和氨基酸側(cè)鏈的氨基特異性結(jié)合。TMT標(biāo)記最大的一個優(yōu)勢就是標(biāo)記效率高，可以同時對多達(dá)10個樣品進(jìn)行分析，有效節(jié)省了質(zhì)譜分析所用的時間和成本。該研究利用玉米自交系196為材料，采用TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，以期能檢測種子在澇漬過程中一些重要蛋白質(zhì)的表達(dá)模式，了解其功能，繼而揭示其在蛋白質(zhì)組水平上的響應(yīng)機制。

1材料與方法

1.1供試材料

以玉米自交系196為供試材料，由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所供種。

1.2玉米種子萌發(fā)培養(yǎng)

選取大小一致且無破損的玉米種子，用10%次氯酸鈉消毒10 min，蒸餾水沖洗干凈，再用濾紙吸干表面水分，將種子均勻播于沙盤上，使沙盤完全浸沒于水中，置于人工氣候箱中25 ℃暗培養(yǎng)，對照組正常條件下萌發(fā)。由于對照組在培養(yǎng)40 h后胚根將突破種皮完成萌發(fā)，所以將對照的時間點選在胚根即將突破種皮之前。處理組在淹水處理72 h后從沙中取出，剝胚進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.3玉米種子定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析

1.3.1玉米胚的總蛋白提取。參照三氯乙酸（TCA）/丙酮法提取玉米種子胚中的蛋白質(zhì)。具體操作步驟：稱取0.5 g玉米胚在液氮下研磨，而后加入1.5 mL預(yù)冷的TCA-2ME-丙酮溶液，旋渦振蕩1 min，混勻后置于-20 ℃1 h，10 000 r/min、4 ℃離心10 min，棄上清，加入1.5 mL預(yù)冷的2ME-丙酮溶液懸浮沉淀，以去除TCA，置于-20 ℃1 h，10 000 r/min、4 ℃離心15 min，棄上清，重復(fù)1次。將蛋白粉末在室溫下?lián)]干后于8 mol/L尿素中室溫復(fù)溶。

1.3.2胰蛋白酶水解和TMT標(biāo)記蛋白質(zhì)定量。

復(fù)溶的蛋白濃度用BCA（Solarbio，Beijing）法測定。每個樣品取100 μg蛋白，用二硫蘇糖醇還原和碘乙酰胺烷基化后，再用胰蛋白酶（Promega，F(xiàn)itchburg）37 ℃酶解過夜。為了準(zhǔn)確定量蛋白，使用Thermo公司的TMT試劑標(biāo)記酶解后的樣品。取15 μL溶解好的TMT試劑加到蛋白溶液中，混勻后室溫標(biāo)記反應(yīng)1 h，然用5%的羥胺終止反應(yīng)。用128標(biāo)記淹水72 h處理后的胚蛋白樣品，用130標(biāo)記對照。終止反應(yīng)后將標(biāo)記完的樣品進(jìn)行混合，用Waters公司的Sep-Pak除鹽柱除鹽，之后樣品用HPLC分離肽段。

1.3.3 LC-MS/MS分析及質(zhì)譜鑒定。

酶解后的產(chǎn)物經(jīng)TMT標(biāo)記后上nano-HPLC分離，之后進(jìn)入Thermo Q Exactive質(zhì)譜儀中。nano-HPLC的分離條件為流速250 nL/min，時長2 h，流動相A為0.1%的甲酸溶液，流動相B為0.1%的乙腈溶液。所用的分離柱是自制的填充C-18（孔徑300 A、粒徑5 μm）的石英毛細(xì)管柱（直徑75 μm，長度150 mm）。一級質(zhì)譜的掃描在Orbitrap中進(jìn)行，掃描范圍為400～1 800 m/z，分辨率75 000。每個一級質(zhì)譜后面接著10次數(shù)據(jù)依賴性的二級質(zhì)譜掃描。得到的二級譜圖利用Proteome Discoverer（1.4）軟件在Zea mays數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行搜庫分析。Score值小于5一般認(rèn)為可信度較低。試驗結(jié)果TMT比值128比130大于1.50，認(rèn)為這些蛋白是上調(diào)蛋白；試驗結(jié)果TMT比值128比130小于0.67，認(rèn)為這些蛋白是下調(diào)蛋白。玉米蛋白搜庫數(shù)據(jù)庫從UniProt上下載。差異蛋白用EasyGO軟件進(jìn)行富集分析。

2結(jié)果與分析

2.1淹水脅迫對玉米種子萌發(fā)形態(tài)的影響

每隔24 h，對淹水處理的種子進(jìn)行觀察。由觀察可知，淹水24 h，種子處于快速吸水階段，對照組和處理組沒有明顯變化；淹水48 h，對照組的胚根突破種皮，處理組的種子依舊沒有變化；淹水72 h，對照組胚根迅速伸長，胚芽長出，而處理組的種子鮮重基本保持不變，生長依舊處于停滯狀態(tài)，這說明淹水處理能明顯抑制種子的萌發(fā)。

2.2淹水脅迫下玉米種子蛋白質(zhì)組分析

試驗中，將胚內(nèi)蛋白酶解成肽段，使用TMT6-128標(biāo)記淹水處理組肽段，使用TMT6-130標(biāo)記對照組肽段。將不同試驗組的肽段混合在一起，使用LC-MS/MS儀器進(jìn)行分析。加入標(biāo)記后，同一條序列肽段的氨基端和賴氨酸上的氨基就帶有了TMT標(biāo)記。經(jīng)過高能誘導(dǎo)解離，產(chǎn)生了帶標(biāo)記的2種碎片離子，這2種碎片的相對離子強度代表蛋白質(zhì)中肽段的豐度。

試驗總共鑒定到1 456個蛋白，通過篩選、鑒定，發(fā)現(xiàn)在淹水處理下，玉米胚內(nèi)共得到281個差異蛋白，其中244個上調(diào)蛋白，37個下調(diào)蛋白。

通過對差異蛋白進(jìn)行GO功能富集分析，從生物過程、細(xì)胞組分、分子功能3個方面對所有相應(yīng)的蛋白數(shù)量進(jìn)行了分類，結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出，按生物過程來分，大部分的蛋白都與代謝過程和細(xì)胞過程相關(guān)，其次有11%的蛋白是與刺激響應(yīng)相關(guān)的蛋白，這些蛋白可能與淹水脅迫下種子的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)；按照細(xì)胞組分來分類，這些上調(diào)蛋白有55%分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞的其他部位；按照分子功能來看，39%的蛋白具有結(jié)合作用，34%的蛋白是代謝相關(guān)的酶類，另外27%的蛋白具有細(xì)胞骨架蛋白的功能。

對所鑒定的上調(diào)蛋白進(jìn)行了KEGG Pathway代謝通路富集分析，發(fā)現(xiàn)涉及38個KEGG 通路，其中P<0.05的有6個通路（圖2），包括核糖體通路、碳代謝通路、糖酵解通路等。研究表明，淹水脅迫影響了玉米萌發(fā)的多個生理代謝通路。

通過定量蛋白質(zhì)組分析，定量了一些鑒定到的差異蛋白（表1）。在淹水脅迫下，萌發(fā)種子胚中脫氫抗壞血酸還原酶下調(diào)至0.49倍。NADH泛醌氧化還原酶下調(diào)了0.59倍。貯藏物相關(guān)蛋白均上調(diào)，豐度為1.50倍，有的甚至高達(dá)9.10倍。糖酵解過程中相關(guān)蛋白，例如甘油醛3磷酸脫氫酶表達(dá)豐度也累積增加。一些調(diào)節(jié)脂類的蛋白表達(dá)豐度升高，表明脂肪酸的合成可能增強了種子對逆境的適應(yīng)性。還鑒定到一些熱激蛋白，在淹水脅迫下，不同熱激蛋白的變化規(guī)律并不相同，編號為B4F817的Class I heat shock protein 1發(fā)生了下調(diào)，降低至0.49倍，另外6個鑒定到的熱激蛋白均上調(diào)，豐度在1.60倍～4.23倍。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2017年

3結(jié)論與討論

種子萌發(fā)過程中，吸漲水的種子打破休眠并激活了多種代謝活性，包括貯藏物相關(guān)蛋白。這些蛋白對環(huán)境因素比較敏感，例如淀粉能夠為萌發(fā)過程中的呼吸和代謝中間物的合成提供碳源[10]，是主要能源物質(zhì)。該研究中，淀粉合酶（K7V1M1，uniprot編號）、油質(zhì)類蛋白（B6SI42，uniprot編號）表達(dá)豐度顯著增加。這表明在淹水脅迫下，種子可能加強了淀粉合成途徑，從而有利于積累更多的能源。

種子萌發(fā)過程需要大量的能量。糖酵解能為萌發(fā)過程中的能量供應(yīng)提供基本的代謝中間物。多個研究表明在植物中過表達(dá)甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因能提高種子的萌發(fā)率[11]。該試驗中甘油醛-3-磷酸脫氫酶在淹水處理后豐度增加，可能是由于在淹水條件下，種子萌發(fā)處于低氧環(huán)境下，只能靠糖酵解途徑來增加能量，抵抗逆境。

該試驗還鑒定出一類疏水蛋白，即晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白（LEA蛋白）和種子成熟蛋白。這類蛋白能夠保護(hù)蛋白質(zhì)

的結(jié)構(gòu)，維持膜的穩(wěn)定性，是一種脫水保護(hù)劑[12]。這類蛋白對環(huán)境變化也比較敏感，可以在營養(yǎng)生長過程中被干旱、鹽漬、滲透脅迫、ABA等誘導(dǎo)表達(dá)。該試驗中，在淹水脅迫下，uniprot編號為B6SGN7的胚胎蛋白和編號為Q6TM44的萌發(fā)類蛋白豐度上調(diào)表達(dá)，這與HUANG等[13]在干旱脅迫下對玉米種子萌發(fā)的蛋白質(zhì)組研究結(jié)果一致。另外，熱激蛋白是一類受溫度或其他逆境誘導(dǎo)而表達(dá)的逆境脅迫蛋白。它能防止蛋白質(zhì)變性，幫助蛋白的正常折疊，使其恢復(fù)原有的空間構(gòu)象和生物活性。該試驗還鑒定出一批小分子熱激蛋白，在淹水條件下，能夠增加種子的耐受性。

玉米的蛋白質(zhì)組學(xué)研究已經(jīng)應(yīng)用于各個領(lǐng)域，但是大部分的蛋白都未能得到有效的鑒定。在該試驗中，鑒定出來的蛋白有33%分子功能未知，70%的蛋白KEGG通路未知，這就導(dǎo)致研究方法存在諸多局限性。未來隨著蛋白質(zhì)組學(xué)研究的快速發(fā)展，期望能夠更快更好地完善玉米的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫，使其在玉米相關(guān)研究中的應(yīng)用越來越廣泛。

參考文獻(xiàn)

[1]

余衛(wèi)東，馮利平，盛紹學(xué)，等.黃淮地區(qū)澇漬脅迫影響夏玉米生長及產(chǎn)量[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2014，30（13）：127-136.

[2] 陳國平，趙仕孝，楊洪友，等.玉米澇害及其防御措施的研究：I.芽澇對玉米出苗及苗期生長的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報，1988，3（2）：12-17.

[3] 朱敏，史振聲，李鳳海.玉米耐澇機理研究進(jìn)展[J].玉米科學(xué)，2015，23（1）：122-127，133.

[4] 孟令波.玉米種子萌發(fā)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D].哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2008.

[5] FINCHSAVAGE W E，BLAKE P S，CLAY H A.Desiccation stress in recalcitrant Quercus robur L.seeds results in lipid peroxidation and increased synthesis of jasmonates and abscisic acid[J].J Exp Bot，1996，47（298）：661-667.

[6] KOORNNEEF M，VAN EDEN J，HANHART C，et al.Genetic finestructure of the GA1 locus in the higher plant Arabidopsis thaliana[J].Genet Res，1983，41（1）：57-68.

[7] SCOTT S J，JONES R A.Quantifying seed germination responses to low temperatures：Variation among Lycopersicon spp.[J].Environ and Exp Bot，1985，25（2）：129-137.

[8] RAJJOU L，BELGHAZI M，HUGUET R，et al.Proteomic investigation of the effect of salicylic acid on Arabidopsis seed germination and establishment of early defense mechanisms[J].Plant Physiol，2006，141（3）：910-923.

[9] CAMPO S，CARRASCAL M，COCA M，et al.The defense response of germinating maize embryos against fungal infection：A proteomics approach[J].Proteomics，2004，4（2）：383-396.

[10] ZEEMAN S C，KOSSMANN J，SMITH A M.Starch：Its metabolism，evolution，and biotechnological modification in plants[J].Annu Rev of Plant Biol，2010，61（1）：209-234.

[11] ZHANG X H，RAO X L，SHI H T，et al.Overexpression of a cytosolic glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase gene OsGAPC3 confers salt tolerance in rice[J].Plant Cell，Tiss and Organ Cult，2011，107：1-11.

[12] GOYAL K，WALTON L J，TUNNACLIFFE A.LEA proteins prevent protein aggregation due to water stress[J].Biochem J，2005，388：151-157.

[13] HUANG H，MOLLER I M，SONG S Q.Proteomics of desiccation tolerance during development and germination of maize embryos[J].J Proteomics，2012，75（4）：1247-1262.