孫小英 鄒玉 王濤 王魁源 羅志文

摘要[目的]觀察東北黑蜂蜂膠醇提取物對(duì)昆明鼠免疫活性的影響和腫瘤抑制率。[方法]通過(guò)動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)，制備H22模型小鼠，計(jì)算黑蜂蜂膠提取物腫瘤抑制率，測(cè)定單核-巨噬細(xì)胞碳廓清的吞噬指數(shù)。[結(jié)果]東北黑蜂蜂膠醇提取物各組的吞噬指數(shù)、瘤重與陰性對(duì)照組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說(shuō)明東北黑蜂蜂膠醇提取物能夠提高H22小鼠的免疫活性，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)在一定程度上有很強(qiáng)的抑制作用，東北黑蜂蜂膠的乙醇提取物抗腫瘤作用顯著。[結(jié)論]該研究為蜂產(chǎn)品進(jìn)一步走向醫(yī)療領(lǐng)域特別是治療癌癥提供理論支持。

關(guān)鍵詞東北黑蜂；蜂膠醇提取物；昆明小鼠；免疫活性；抗腫瘤

中圖分類號(hào)R282.74文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）09-0127-02

Study on Immune Activity and Antitumor Activity of Apis mellifera Propolis

SUN Xiaoying，ZOU Yu，WANG Tao，LI Chunfeng* et al

（College of Life Science， Jiamusi University， Jiamusi， Heilongjiang 154007）

Abstract[Objective] The research aimed to observe the effect of alcohol extract of northeast Apis mellifera propolis on immune activity and tumor inhibition rate of Kunming mice.[Method] H22 model mice were prepared by in vivo animal test. The tumor inhibition rate of Apis mellifera propolis extract was calculated and the phagocytic index of mononuclear macrophages was measured.[Result] The phagocytic index and tumor weight of the

Apis mellifera propolis extract were significantly higher than those of the negative control group （P<0.05），which indicated that the extract of northeastern Apis mellifera propolis could improve the immunological activity of H22 mice and had a strong inhibitory effect on the growth of tumor. The ethanol extract of northeastern Apis mellifera propolis had significant antitumor effect.[Conclusion] The study provides theoretical support for the further development of bee products in the medical field， especially in the treatment of cancer.

Key wordsApis mellifera；Alcohol extract of propolis；Kunming mice；Immunological activity；Antitumor

東北黑蜂（Apis mellifera ssp.）是俄羅斯蜂和卡尼鄂拉蜂的中間過(guò)渡，并在一定意義上混有意大利蜂和高加索蜂這二者之血統(tǒng)，經(jīng)長(zhǎng)期自然選擇結(jié)合人工選擇而形成的一個(gè)新的品種，分布在我國(guó)黑龍江省，比其他普通蜜蜂個(gè)體大，全身呈現(xiàn)黑色，具有很強(qiáng)大的生命力，抗菌抗寒能力均優(yōu)于其他蜂[1-2]，并且其蜜源植物是大面積的原始林，這使得它能夠提供優(yōu)質(zhì)的蜂產(chǎn)品。

蜂膠（Propolis）是蜜蜂從適宜植物的芽孢、受損樹干上采集的半固體混合物類似松脂狀物質(zhì)，以及花粉等再加入自身上腭腺所分泌的物質(zhì)混合加工而成的一種帶有芳香味感的黏稠的膠狀固體，這一蜂產(chǎn)品是蜂群修理蜂房、防御疾病和侵害性微生物的一種蜂群特有的藥物，對(duì)蜂巢內(nèi)部起到了殺菌消炎作用的一種特性[3]，具有消炎、抗氧化、抗菌、提高免疫、抗腫瘤作用。筆者運(yùn)用東北黑蜂蜂膠的提取物進(jìn)行試驗(yàn)研究，分析黑蜂蜂膠的提取物對(duì)H22小鼠免疫活性的影響及其抗腫瘤作用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物。昆明種系小鼠，雌雄小鼠各半，體重18～22 g。正常飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和喂水，光照12 h/d。大約7 d左右適應(yīng)新環(huán)境，經(jīng)過(guò)仔細(xì)觀察，將健康的小鼠進(jìn)行分組。

1.1.2腫瘤細(xì)胞株。H22腫瘤細(xì)胞株，經(jīng)小鼠腹腔傳代保種，由佳木斯大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3試驗(yàn)儀器。分光光度計(jì)；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；YP600電子天平；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；循環(huán)水式真空泵；恒溫水浴鍋；WND-200型高速中藥粉碎機(jī)；離心機(jī)；微量注射器。

1.1.4試驗(yàn)藥品。蜂膠購(gòu)自虎林市黑蜂蜜蜂園；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液；環(huán)磷酰胺，國(guó)藥準(zhǔn)字H22022673，通化茂祥制藥有限公司；印度墨汁。

1.2方法

1.2.1黑蜂蜂膠的提取。

1.2.1.1預(yù)處理。稱取500 g東北黑蜂毛膠，放入冰箱，在-20 ℃冷凍3 h，取出粉碎過(guò)20目標(biāo)準(zhǔn)篩，用水浴的方式除去蜂蠟。將粉碎后的蜂膠粉倒入燒杯中，再加12倍體積量蒸餾水，在75 ℃浸泡40 min，并攪拌，蜂蠟緩緩析出，將燒杯靜置冷卻至室溫隔夜之后，把上層已凝固了的蜂蠟小心取走。將去除蜂蠟的蜂膠，在0 ℃條件下冷凍4 h以上，再進(jìn)行粉碎。粉碎過(guò)程要控制溫度，防止蜂膠在高溫下融化影響粉碎效果，過(guò)20目篩待提取。

1.2.1.2醇提法。分別稱預(yù)處理好的蜂膠3份，5 g/份；分放在燒杯中，分別加入10倍量的40%、80%、90%乙醇，冷浸2 d[4-6]，分別在30 ℃恒溫水浴中加熱并攪拌 30、45、60 min過(guò)濾，留濾液。重復(fù)上述試驗(yàn)3次，然后把濾液倒一起，于30 ℃下用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將濾液濃縮到一定體積，配制蜂膠溶液低、中、高濃度分別是1.0%、1.5%、2.5%，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2模型制備。

昆明小鼠，3～4周齡，體重（19±3）g，自由進(jìn)食物和水。從預(yù)先培養(yǎng)的荷瘤小鼠腹腔中抽出H22細(xì)胞，用無(wú)菌生理鹽水稀釋10倍，搖勻后，取此細(xì)胞液加臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)，細(xì)胞存活率在95%以上。將H22細(xì)胞懸液02 mL采用無(wú)菌方法接種到正常小鼠腹腔內(nèi)，每只小鼠注射0.1 mL（細(xì)胞數(shù)為2×107個(gè)/mL）培養(yǎng)。腹腔傳代2次，從培養(yǎng)的荷瘤小鼠腹腔中抽取含有H22的腹水，用無(wú)菌生理鹽水加肝素鈉稀釋10倍。將H22細(xì)胞懸液吸取0.2 mL接種在試驗(yàn)小鼠的右前肢腋下，制備移植瘤模型小鼠。

1.2.3黑蜂蜂膠醇提取物對(duì)小鼠免疫活性的影響。

1.2.3.1免疫活性試驗(yàn)。接種7 d后，取25只小鼠分組，將小鼠稱重，分為陰性組、黃酮組、陽(yáng)性對(duì)照組，其中黃酮組又分為高、中、低3個(gè)組（共5組，每組5只）。陰性對(duì)照組，每天按0.01 mL/（g·只）的量給予0.9%生理鹽，每天1次，連續(xù)7 d；

黃酮組為高、中、低3個(gè)組，按0.01 mL/（g·只）的量，以高、中、低3個(gè)濃度給藥但體積相同，每天1次，連續(xù)7 d；陽(yáng)性對(duì)照組按20 mg/（kg·只）給藥環(huán)磷酰胺生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。

1.2.3.2小鼠碳廓清試驗(yàn)。末次用藥24 h后，用徒手固定法，需2個(gè)人進(jìn)行。第1步固定：用毛巾按住小鼠同時(shí)露出尾巴，把小鼠固定好，尾巴拉直，用酒精棉球不斷擦尾巴，受熱使尾部靜脈受熱擴(kuò)張，不斷重復(fù)動(dòng)作，到看清血管為止。用食指、中指、無(wú)名指、大拇指將小鼠尾巴固定。第2步注射：用1 mL 注射器，握住其靠前0.1 mL處；推針姿勢(shì)：右手小指摁左手拇指然后進(jìn)針。注射時(shí)左手扯住尾巴，使尾巴緊緊貼在桌面上，一般選擇距尾尖1/4或1/3處進(jìn)針，以0.01 mL/g體重的劑量，給小鼠尾靜脈注射印度墨汁生理鹽水，挑皮膚薄及血管清晰處進(jìn)針。注意觀察是否有回血與人靜脈點(diǎn)滴相似，有回血就開(kāi)始注射。注射印度墨汁結(jié)束后，使用醫(yī)療用棉花止血。取血時(shí)間分別是在2、10 min；方法是把吸管用肝素處理，在內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，馬上溶于到2 mL 的0.1% Na2CO3溶液中并輕輕搖勻，用722分光光度計(jì)于600 nm測(cè)吸光度（A），以Na2CO3溶液作為空白，然后拉頸處死，解剖取出肝和脾，用濾紙輕輕把表面血污吸干，分別稱重（g），計(jì)算廓清指數(shù)K值和校正吞噬指數(shù)α值。

K=（lgA1-lgA2）/（T2-T1）

α=K1/3·體重/ （肝重+脾重）

式中，a為吞噬指數(shù)；K為廓清指數(shù)；A1是T1時(shí)的吸光度；A2是T2時(shí)的吸光度；T1是給墨汁后第1次取血的時(shí)間；T2是給墨汁后第2次取血的時(shí)間。

1.2.4黑蜂蜂膠醇提取物抑制腫瘤生長(zhǎng)試驗(yàn)。分組及給藥方法與“1.2.3.1”方法相同。

最后一次施藥24 h以后，斷頸處死，稱量體重并剝離瘤塊稱重，計(jì)算抑瘤率，抑瘤率=（陰性對(duì)照組瘤重-試驗(yàn)組瘤重）/陰性對(duì)照組瘤重×100%。

2結(jié)果與分析

2.1黑蜂蜂膠醇提物對(duì)小鼠的單核巨噬細(xì)胞碳廓清功能的影響由表1可知，

黑蜂蜂膠組和陽(yáng)性對(duì)照組的吞噬指數(shù)均大于陰性對(duì)照組，并且各試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組的差異均表現(xiàn)出顯著性（P<0.05），說(shuō)明黑蜂蜂膠醇提物具有促進(jìn)移植瘤小鼠的單核-巨噬細(xì)胞碳廓清功能的作用，表明黑蜂蜂膠醇提物能提高H22的免疫活性。

2.2黑蜂蜂膠醇提取物對(duì)小鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響由表2

可知，蜂膠低、中、高3個(gè)濃度組瘤均明顯小于陰性對(duì)照組；高濃度組

抑瘤率大于低濃度組和中濃度組；從各濃度組可以看出，蜂膠抑制腫瘤的作用對(duì)劑量存在一定的依賴性；高濃度組與對(duì)照組比較有顯著性差異（P<0.05），表明東北黑蜂蜂膠醇提物對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，說(shuō)明黑蜂蜂膠具有很客觀的抗癌作用。由于蜂膠是一種純天然、無(wú)副作用的純天然藥物，具有廣闊的研發(fā)前景和市場(chǎng)價(jià)值，為蜂產(chǎn)品進(jìn)一步走向醫(yī)療領(lǐng)域特別是治療癌癥這一領(lǐng)域提供理論支持。

3小結(jié)與討論

該試驗(yàn)結(jié)果表明，黑蜂蜂膠有提高H22小鼠免疫活性的能力。蜂膠提取物還能將免疫功能低下的病態(tài)鼠的自身免疫功能恢復(fù)甚至達(dá)到正常水平；蜂膠還具有抗菌、抗病毒、調(diào)節(jié)血糖、抗氧化、抗癌、抗炎、鎮(zhèn)痛、降血脂、抗?jié)?、保肝、抗疲勞、促進(jìn)組織再生等作用。由此可見(jiàn)，蜂膠作為保健品的研制與開(kāi)發(fā)有著巨大的市場(chǎng)潛力[7-9]。

腫瘤傳統(tǒng)療法以手術(shù)加放療和化療配合為主，這的確能除去大部分的癌細(xì)胞，但同時(shí)附帶的副作用和對(duì)身體免疫功能的破壞是明顯的。以環(huán)磷酰胺這一老牌的抗腫瘤藥物作為對(duì)比，此次試驗(yàn)過(guò)程中的黑蜂蜂膠醇提物同樣表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑瘤作用，但用傳統(tǒng)療法會(huì)使移植瘤鼠的體重下降、飲食、精神都很糟糕，且明顯是免疫功能的下降，而使用黑蜂蜂膠醇提物卻不存在這些副作用。大量的試驗(yàn)研究表明，蜂膠提取物具有顯著的抗腫瘤和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用。因此，此次試驗(yàn)觀察黑蜂蜂膠醇提物對(duì)H22移植瘤在小鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)情況及它對(duì)荷瘤小鼠免疫活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑蜂蜂膠醇提物高劑量組能明顯地減緩小鼠的體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)，說(shuō)明黑蜂蜂膠醇提物能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，對(duì)防治腫瘤生長(zhǎng)有積極意義。

參考文獻(xiàn)

[1]

劉勝范，王樹壯.東北黑蜂演化史概述[J].蜜蜂雜志，2016，36（4）：7-9.

[2] 彭文君，羅其花，李長(zhǎng)春，等.基于微衛(wèi)星標(biāo)記的東北黑蜂群體遺傳多態(tài)性分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)，2012，45（21）：4484-4491.

[3] 周劍虹.蜂膠將成為天然保健品開(kāi)發(fā)新熱點(diǎn)[J].醫(yī)學(xué)信息，1997（6）：15-16.

[4] 葉陸星，胡福良，玄紅專.蜂膠的提取方法及影響因素[J].蜜蜂雜志，2002（7）：16-17.

[5] 丁立新，張楠楠，張?jiān)平?，?桂花中黃酮類物質(zhì)提取與純化的研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2008，31（5）：23，24.

[6] 張杰，焦淑清，滕楊，等.櫻桃葉中總黃酮的提取工藝研究[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2010，33（2）：13，14.

[7] 潘明.蜂膠提取物對(duì)荷瘤小鼠腫瘤免疫系統(tǒng)的影響研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2007，18（2）：415-416.

[8] 劉進(jìn)祖.保健食品新熱點(diǎn)——蜂膠[J].綠化與生活，1999（3）：17-18.

[9] ORSOLIC′ N，KNEZEVIC′ A H，SVER L，et al.Immunomodulatory and antimetastatic action of propolis and related polyphenolic compounds[J]. Journal of ethnopharmacology，2004，94（2/3）：307-315.