丁運華 郭少敏 劉燕 鄭建靈

摘 要 采用篩選模型對10種南藥樣品乙酸乙酯提取物的乙酰膽堿酯酶抑制活性進行了評價。結果表明：10種南藥（益智、雞血藤、決明子、巴戟天、溪黃草、金櫻子、化橘紅、佛手、絞股藍、五指毛桃）均具有不同程度的乙酰膽堿酯酶抑制活性。當提取物濃度為1.0 mg/mL時，溪黃草、益智、化橘紅、絞股藍、五指毛桃表現出較強的抑制活性，平均抑制率大于50%，分別為89.59%，77.10%，67.54%，52.62%，52.29%，其他5種南藥的平均抑制率在20.81%～49.81%之間；提取物濃度為0.1 mg/mL時，溪黃草、益智、佛手仍表現出相對較強的抑制活性，平均抑制率大于25%，其他7種南藥的平均抑制率在6.07%～24.78%之間。應該深入研究復方中藥治療老年癡呆的藥效物質基礎，加大對南藥資源的開發(fā)利用。

關鍵詞 南藥；乙酰膽堿酯酶；抑制活性；篩選模型

中圖分類號 TQ041 文獻標識碼 A

Evaluation of Acetylcholinesterase Inhibitory Activity

of 10 Southern Chinese Herbs by Screening Model

DING Yunhua， GUO Shaomin， LIU Yan， ZHENG Jianling

School of life Science， Huizhou University， Huizhou， Guangdong 516007， China

Abstract In the present study， AChE activity of ethyl acetate-soluble fractions from 10 southern Chinese herb samples were screened by a screening model. The results indicated that all these 10 samples exhibited AChE inhibitory activities. At 1.0 mg/mL of extracts concentrations， higher inhibitory activity appeared in Rabdosia serra （Maxim.）Hara， Alpinia oxyphylla， Citrus grandis cv. Tomentosa， Gynostemma pentaphyllum， and Radix Fici Hirtae， with inhibition ratios of 89.59%， 77.10%， 67.54%， 52.62%， and 52.29%（all of the above more than 50%）respectively， and the inhibition ratios of the other 5 samples at this concentration were between 20.81% and 49.81%. At 0.1 mg/mL of extracts concentrations， Rabdosia serra（Maxim.）Hara， Alpinia oxyphylla， Citrus medica L. and var. sarcodactylis Swingle demonstrated higher inhibitory activites， with average inhibition ratios more than 25%， while the inhibition ratios of the other 7 samples at this concentration were between 6.07% and 24.78%. Exploring of southern Chinese herbs should be strengthened in searching components for treatment of Alzheimers Disease.

Key words Southern Chinese herb； acetylcholinesterase； inhibitory activity； screening model

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.08.013

阿爾茨海默氏病（Alzheimers Disease，AD） 又稱早老性癡呆癥，是一種以記憶、判斷和思維等存在認知功能障礙以及人格和行為嚴重改變?yōu)橹饕卣鞯穆陨窠浲诵行约膊　ｋS著世界人口老齡化進程的加快，AD病發(fā)病率在國內外呈現不斷上升的趨勢，AD 已成為繼心腦血管疾病和癌癥之后威脅老年人生命健康的嚴重疾病之一。AD的發(fā)病機制復雜，目前多方面研究表明，AD患者大腦內神經遞質—乙酰膽堿的缺失是導致AD疾病的關鍵原因[1-5]，AD的病理與患者神經間隙中乙酰膽堿酯酶（Acetylcholinesterase，AChE）活性過高具有重要關系。因此乙酰膽堿酯酶抑制劑（AChEI）藥物是目前研究最多、使用最為廣泛的抗早老性癡呆癥藥物[3-6]。

中國藥用植物資源極其豐富，是開發(fā)乙酰膽堿酯酶抑制劑的寶庫。大量研究發(fā)現，許多海藻[3]、蕨類[6]、中草藥[5，7]等天然植物都有乙酰膽堿酯酶抑制活性。如藥理研究表明石杉堿甲、黃皮酰胺對輕中度早老性癡呆有一定的治療作用[3]。從天然資源中尋找AChEI一直是研究的熱點領域。華南地區(qū)中草藥資源蘊藏量大，用藥歷史悠久，療效顯著，成為中國醫(yī)藥學的重要流派。南藥中的巴戟天、益智、化橘紅、佛手、五指毛桃、溪黃草、雞血藤、決明子、金櫻子等都是華南地區(qū)常用的藥用植物[8-10]。為了更好地開發(fā)利用南藥資源，尋找來源于南藥資源的乙酰膽堿酯酶抑制劑，本研究基于Ellman方法[11]，設計篩選模型，對10種南藥（溪黃草，決明子，巴戟天，雞血藤，金櫻子，茨實，五指毛桃，絞股藍，益智，佛手）95%乙醇提取物的乙酸乙酯組分進行活性篩選，為篩選高效安全的天然乙酰膽堿酯酶抑制劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 溪黃草、巴戟天、五指毛桃、絞股藍、益智、佛手、化橘紅、決明子、雞血藤、金櫻子等10種南藥購于惠州同仁堂藥店，經惠州學院生命科學學院林芳花副教授鑒定。

1.1.2 試劑與儀器 碘化硫代乙酰膽堿（ATCI，由國藥集團化學試劑有限公司進口分裝，用50 mmol/L、pH8.0的PBS溶液配制），二硫代雙對硝基苯甲酸（DTNB，由國藥集團化學試劑有限公司進口分裝，用50 mmol/L、pH7.0的PBS溶液配制），乙酰膽堿酯酶（Sigma產品，10 mg酶加入1 mg牛血清白蛋白作為穩(wěn)定劑，用1 mL 50 mmol/L、pH8.0的PBS溶液溶解，制成2 U/mL的酶液），他克林（tacrine，Sigma公司，用50 mmol/L、pH8.0的PBS溶液配制），其余試劑為國產分析純或生化試劑規(guī)格。

723E型可見分光光度計（天津科納斯光學分析儀器有限公司），DZF-6020型真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司），RE2000A旋轉蒸發(fā)儀（上海一科儀器有限公司），DK-8B型電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設備有限公司）

1.2 方法

酶促反應體系（篩選模型）的建立：參照Ellman的方法稍作改進[11]。Ellman的方法是測定AChE活性最常用的方法，其原理為AChE催化水解底物碘化硫代乙酰膽堿（ATCI），水解形成的產物碘化硫代乙酰膽堿迅速與顯色劑二硫代雙硝基苯甲酸（DTNB）反應生成黃色產物5-巰基-2硝基苯甲酸，該產物在412 nm處有光吸收。在酶催反應的穩(wěn)態(tài)階段用光吸收值OD值表征酶促反應初速度。

1.2.1 非酶促水解光吸收 由于底物ATCI不穩(wěn)定，在儲存及水浴過程中容易發(fā)生非酶催水解產生碘化硫代乙酰膽堿，其與顯色劑DTNB結合產生光吸收[11]。因此在測酶活之前，需測定ATCI非酶催水解產生的光吸收，排除背景干擾，計算真正由酶催反應所產生的光吸收值。

取pH8.0、50 mmol/L的 PBS 2 730 μL于試管中，依次加入15 mmol/L的DTNB 100 μL，15 mmol/L ATCI 100 μL，不加酶，分別于37 ℃水浴反應不同時間（0，5，10，15，20，25，30 min）；加入100 μL 1%的SDS終止反應，測其在412 nm處的光吸收值OD值，這就是底物ATCI的非酶催水解光吸收值。

1.2.2 OD-t曲線的繪制 取pH8.0、50 mmol/L 的PBS 2 730 μL于試管中，依次加入乙酰膽堿酯酶13 μL、15 mmol/L的DTNB 100 μL、15 mmol/L 的ATCI 100 μL，分別于37 ℃水浴反應不同時間（0，5，10，15，20，25，30 min）；加入100 μL 1%的SDS終止反應，測其在412 nm處的OD值，該實驗用于確定酶催反應處于穩(wěn)態(tài)的時間[3]。

1.2.3 OD-酶量（酶濃度）曲線的繪制 取pH8.0、50 mmol/L的PBS 2 730 μL，再依次加入不同濃度（0.8，1.2，1.6，2.0，2.4，2.8 U/mL）的乙酰膽堿酯酶13 μL、15 mmol/L的DTNB 100 μL、15 mmol/L的ATCI 100 μL，分別于37 ℃水浴反應20 min（由1.2.2確定的時間），測其在412 nm處的OD 值。該實驗用于確定是否可以用OD值表征酶活。

1.2.4 1/OD-1/[S]雙倒數曲線的繪制 根據1.2.2確定的穩(wěn)態(tài)反應時間，20 min內的OD-t曲線具有良好的線性關系，故在此時間內可用OD值表征反應速度v，同理可用1/OD-1/[S]曲線代替1/v-1/[S]曲線以探討乙酰膽堿酯酶的性質，并驗證其是否符合米氏方程。

取pH8.0、50 mmol/L的 PBS 2 730 μL，加入2 U/mL的乙酰膽堿酯酶13 μL、15 mmol/L的DTNB 100 μL，再分別加入不同濃度（7.5，3.75，2.5， 1.875，1.5，1.25 mmol/L）的ATCI 100 μL，分別于37 ℃水浴反應20 min，加入100 μL 1%的SDS終止反應，測其在412 nm處的OD值。

1.2.5 樣品的制備 取10種中藥樣品置于干燥箱中以60 ℃干燥24 h，分別稱取30 g，粉碎；用600 mL 95%的乙醇溶液分3次浸泡，以50 ℃超聲提取30 min，合并提取液，減壓濃縮，得乙醇提取物；取乙醇提取物，加適量水分散，用600 mL乙酸乙酯分3次萃取，合并萃取液，減壓濃縮，得到乙酸乙酯提取物（膏狀物），測定活性時再用50%的乙醇溶液分別將其溶解成1.0 mg/mL和0.1 mg/mL的樣品溶液。

1.2.6 活性測定及計算 取PBS（pH8.0，50 mmol/L）2 650 μL、樣品100 μL、乙酰膽堿酯酶13 μL、15 mmol/L的DTNB 100 μL、15 mmol/L的ATCI 100 μL，于37 ℃水浴反應20 min，加入100 μL 1%的SDS終止反應，測其在412 nm處的OD值，記為A樣品。

由于中藥樣品本身多有顏色，所以每個樣品同時做一個本底扣除，在上面的測定中，用100 μL 50 mmol/L的PBS代替底物溶液，測其在412 nm處的OD值，記為A本底。

空白對照用100 μL PBS來代替樣品，測其在412 nm處的OD值，記為A空白。

陽性對照：測定方法同A樣品，反應體系中用100 μL的他克林代替樣品溶液。

吸光值和抑制率的計算公式為：

樣品真實吸光值（A真實）為：A真實=A樣品-A本底

樣品抑制率（I）為：I=（A空白-A真實）/A空白×100%

所有實驗重復3次，并計算平均值和標準偏差。

2 結果與分析

2.1 非酶催反應的光吸收

由圖1可以看出，ATCI在水浴條件下的吸光值隨著水浴時間的延長而增加，OD-t成線性關系，表明ATCI的非酶催吸光值不可忽略。

2.2 OD-t曲線確定穩(wěn)態(tài)反應時間

由圖2可看出，本實驗的酶反應體系在反應開始后的20 min內線性關系較好，反應處在穩(wěn)態(tài)階段，因此可以取20 min作為該反應體系的反應時間，此段時間內的OD412值可表征酶催反應的反應速率。

2.3 OD-酶活曲線

從圖3可以看出，在20 min的反應時間范圍內，酶濃度為0.8～2.8 U/mL時，酶濃度和OD值呈現良好的線性關系，因此在此范圍內可以用OD值來表征酶活。

2.4 1/OD-1/[S]曲線

從圖4可以看出，在本實驗范圍內1/OD與1/[S]成正比，即反應速度倒數與底物濃度倒數之間符合線性關系，說明本實驗中的Sigma乙酰膽堿酯酶為米氏酶，符合米氏方程：

v=Vmax[S]/（Km+[S]）

2.5 南藥提取物的AChE抑制活性

依據1.2.5的樣品制備方法得到2種濃度的樣品溶液：1.0 mg/mL和0.1 mg/mL， 以Sigma乙酰膽堿酯酶為酶源，采用1.1.2的方法配制成酶液，按照1.2改良的Ellman方法及篩選模型，利用1.2.6的抑制率計算公式，得到10種南藥乙酸乙酯提取物在2種濃度（1.0，0.1 mg/mL）時的乙酰膽堿酯酶抑制活性，結果見表1。結果表明，在提取物濃度為1.0 mg/mL和0.1 mg/mL時，10種南藥均具有一定的乙酰膽堿酯酶抑制活性。其中，提取物濃度為1.0 mg/mL時溪黃草、益智和化橘紅表現出較強的抑制活性，平均抑制率分別達到89.59%、77.1%和67.54%；五指毛桃和絞股藍的平均抑制率都在52%；雞血藤和佛手的平均抑制率接近50%；金櫻子和決明子的平均抑制率都在40%；巴戟天的平均抑制率在選取的10種南藥中最低，為20.81%。當提取物濃度為0.1 mg/mL時，所有10種南藥仍具有一定的抑制活性，其中益智的抑制活性最高，平均抑制率為48.04%；其次是溪黃草，平均抑制率為30.78%；佛手、五指毛桃、雞血藤和決明子等4種南藥的平均抑制率都在20%以上；化橘紅的平均抑制率為19.69%，接近20%；金櫻子和巴戟天的平均抑制率在10%以上；絞股藍的平均抑制率最低，為6.07%。

3 討論

治療AD目前最有效的方法是應用乙酰膽堿酯酶抑制劑，尋找安全毒副作用小、選擇性強的藥物，目前公開的主流方法均由Ellman法改進而來[3，5，12]。本研究首次運用基于Ellman法的篩選模型，對10種南藥植物進行乙酰膽堿酯酶抑制活性篩選，結果表明，溪黃草、益智、化橘紅、佛手、五指毛桃、雞血藤、絞股藍、決明子、巴戟天、金櫻子等10種南藥均表現出一定的抑制活性，其中溪黃草、益智、化橘紅、佛手、五指毛桃等5種南藥在1.0 mg/mL和0.1 mg/mL 2種不同的提取物濃度下都表現較強的抑制活性。研究結果可以為篩選高效、安全的乙酰膽堿酯酶抑制劑提供新線索。

南藥在用于預防和治療老年性癡呆等方面已經有一些報道。胡增峣等[13]通過研究132首與老年癡呆有關的中藥復方，發(fā)現益智、巴戟天、雞血藤，決明子、化橘紅等5種南藥已作為復方中藥的配伍組成用于治療老年癡呆癥。佛手作為益智聰腦顆粒的配方能改善老年癡呆患者的總體功能[14]。五指毛桃與熟地黃、何首烏、黃精等組成的中藥制劑具有鎮(zhèn)靜安神、寧心益智的作用[15]。梁宏宇等[16]研究發(fā)現巴戟天膠囊對血管性癡呆患者的智能改善有一定療效。以上大部分應用停留在中藥復方配伍的水平上，對于其中藥效的物質基礎尚不清楚。劉學貴等[17]發(fā)現金櫻子的醇提取物對預防老年癡呆癥有一定的作用。石紹淮等[18]的研究發(fā)現益智正丁醇提取物可促進老年癡呆模型小鼠學習記憶能力的改善。金虹等[19]發(fā)現益智的乙醚提取物有較強的乙酰膽堿酯酶抑制活性，這與本研究結果比較接近，在提取方法上稍有不同。關于溪黃草和絞股藍在預防和治療老年性癡呆方面的應用尚未見報道。本研究發(fā)現溪黃草具有很強的乙酰膽堿酯酶抑制活性，在選取的10種南藥中排在首位；絞股藍的乙酰膽堿酯酶抑制活性在決明子、巴戟天和金櫻子之上。因此，很有必要對這些中草藥進行進一步的研究，揭示南藥預防和治療老年性癡呆的藥效物質基礎，從中發(fā)現活性更強的有效成分，從而為防治早老性癡呆癥的藥物研究提供有價值的活性先導結構。

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