朱惠霞　陶興林　胡立敏　劉明霞

摘要：以青花菜F1代雜交種綠雄60為材料，研究了青花菜小孢子單核靠邊期花蕾的特征。結(jié)果表明，通過整枝可以得到發(fā)育整齊的青花菜小孢子花蕾，當(dāng)花蕾長度為3.70～4.70 mm時(shí)，單核靠邊期小孢子比例最高，此時(shí)花蕾為綠色，花藥黃綠色，花瓣/花藥為0.83～1.00。以上指標(biāo)可以作為青花菜小孢子取樣的參考指標(biāo)。

關(guān)鍵詞：青花菜；綠雄60；花蕾長度；小孢子；單核靠邊期

中圖分類號(hào)：S635.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-1463（2017）06-0019-03

doi：10.3969/j.issn.1001-1463.2017.06.007

Studies on the Characteristic of Mid-late Uninucleate Stage of Lüxiong 60

Brassica oleracea L .

ZHU Huixia， TAO Xinglin， HU Limin， LIU Mingxia

（Institute of Vegetables， Gansu Academy of Agricultural Sciences， Lanzhou Gansu 730070， China）

Abstract：Lüxiong 60 of Brassica oleracea L as the experimental material， the characteristics of mid-late uninucleate stage of microspore bud side is researched. The result shows that the training can get a neat microspore bud development， when the bud length is 3.70 ～ 4.70 mm， mononuclear side has the highest percentage of microspore stage， the buds of green， anthers yellow-green， petals/anther ratio is 0.83 ～ 1.00. These indicators can be a reference index of broccoli microspore sampling， provide the basis for accurate sampling.

Key words：Brassica oleracea L.； Lüxiong 60；Flower buds； Microspore； Mid-late uninucleate stage

近30年來，我國許多單位開展了青花菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究，對(duì)影響小孢子出胚的主要因素如材料的基因型、花蕾取樣時(shí)期、培養(yǎng)基成份、預(yù)處理方式等方面進(jìn)行了大量研究[1 - 4 ]，建立了小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系。大量研究認(rèn)為，適合青花菜小孢子培養(yǎng)的適合時(shí)期是單核靠邊期，且單核靠邊期小孢子占70%以上時(shí)，才有可能獲得成 功[5 - 6 ]。但不同基因型的供體植株間小孢子培養(yǎng)最佳時(shí)期也不同，且在大批量的小孢子培養(yǎng)過程中，通過鏡檢進(jìn)行取樣則費(fèi)時(shí)費(fèi)力，因此，在培養(yǎng)前對(duì)花蕾的形態(tài)指標(biāo)與小孢子發(fā)育時(shí)期的對(duì)應(yīng)關(guān)系進(jìn)行研究顯得尤為重要。我們以青花菜綠雄60為研究材料，在花球膨大過程中進(jìn)行了2～3次整枝，以期得到發(fā)育同步性一致的花蕾，并觀察花粉的發(fā)育時(shí)期，研究花蕾外部形態(tài)與小孢子發(fā)育時(shí)期的對(duì)應(yīng)關(guān)系，確定小孢子單核靠邊期花蕾縱橫徑、花瓣長、花藥長、花瓣/花藥（P/I）比值、花藥顏色、花瓣顏色等一系列特征，以期為青花菜小孢子培養(yǎng)精準(zhǔn)選樣提供參考依據(jù)，旨在為青花菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系進(jìn)入規(guī)模化奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為青花菜F1代雜交種綠雄60。于2016年8月25日育苗，9月20日定植至日光溫室，正常田間管理，培養(yǎng)植株抽薹開花，11月底初花期開始采集花蕾供試。

1.2 整枝方法

花球直徑8～10 cm時(shí)第1次削球疏枝，花徑伸長后進(jìn)行2～3次整枝疏花[7 ]，每株保留3～4個(gè)主枝，每個(gè)主枝留3～4個(gè)1級(jí)分枝，最終只20個(gè)左右花序用于試驗(yàn)，以自然抽薹不整枝植株上的花蕾為對(duì)照。

1.3 取樣及觀測(cè)方法

晴天8：00～9：00時(shí)采摘青花菜花序，用游標(biāo)卡尺測(cè)量花蕾長度，按長度分為5個(gè)等級(jí)：2.00～2.99、3.00～3.99、4.00～4.49、4.50～4.99、5.00～6.00 mm，每個(gè)等級(jí)取5個(gè)花蕾，計(jì)算平均值。先在載玻片上滴一滴醋酸洋紅染液，然后用鑷子將花藥從花蕾中剝出，置于載玻片上，輕輕擠壓，使花藥中的小孢子均勻游離于染液中。去除花藥壁等雜質(zhì)，蓋上玻片，制成臨時(shí)壓片，顯微鏡下觀察小孢子的細(xì)胞學(xué)特征，隨機(jī)觀察5個(gè)視野，統(tǒng)計(jì)單核靠邊期小孢子所占比例，比較整枝處理對(duì)小孢子發(fā)育同步性的影響，確定單核靠邊期至雙核早期所對(duì)應(yīng)的花蕾長度及其他特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 整枝對(duì)花蕾發(fā)育同步性的影響

從結(jié)球期到開花期，經(jīng)過整枝處理的植株花序營養(yǎng)充足，長勢(shì)強(qiáng)，發(fā)育快，開花期提早3～5 d，花蕾飽滿（圖1A、B）。顯微觀察發(fā)現(xiàn)，不同長度的花蕾小孢子發(fā)育時(shí)期整齊一致（圖1C），同一時(shí)期的小孢子能達(dá)到60%以上，適宜進(jìn)行小孢子培養(yǎng)。未經(jīng)整枝的花球由于營養(yǎng)不足，花球抽薹較慢，且干花較多，花蕾瘦?。▓D1C、D），由于花球內(nèi)部通透性差，花球中間有腐爛，顯微觀察發(fā)現(xiàn)，花蕾小孢子發(fā)育極不同步（圖1F），即在同一花蕾中存在各個(gè)發(fā)育時(shí)期的小孢子，單核靠邊期的小孢子在50%以下，不適宜進(jìn)行小孢子培養(yǎng)。

2.2 小孢子不同發(fā)育時(shí)期的形態(tài)觀察

對(duì)青花菜綠雄60不同大小花蕾小孢子進(jìn)行顯微觀察發(fā)現(xiàn)（圖2），花蕾長2.00 mm以下時(shí)，花蕾中的花粉細(xì)胞大多處于四分體時(shí)期，隨著花蕾的長大，四分體逐漸釋放形成單個(gè)小孢子。早期的小孢子，體積較小，花粉壁較薄，細(xì)胞核位于中央，形狀似小梅花（圖2A），三棱狀明顯；隨后小孢子體積逐漸增大，內(nèi)含物增多，液泡增大，顏色逐漸加深，外形逐漸接近圓形，細(xì)胞核位于花粉邊緣（圖2B），此時(shí)為單核靠邊期，小孢子繼續(xù)發(fā)育膨大，形成1大1小2個(gè)核，較大的營養(yǎng)核染色較淺，較小的生殖核染色較深，此時(shí)為雙核早期（圖2C）。若在青花菜生長過程中不進(jìn)行疏枝，則花蕾發(fā)育會(huì)出現(xiàn)不同步性，嚴(yán)重影響小孢子的培養(yǎng)效果。

2.3 不同長度花蕾中單核靠邊期小孢子所占比例

以整枝處理過的植株上不同長度的花蕾為材料，每組選5個(gè)花蕾，用游標(biāo)卡尺測(cè)量長度，顯微鏡下每花蕾取5個(gè)視野觀察，統(tǒng)計(jì)單核靠邊期小孢子所占比例，計(jì)算平均值。花蕾長度為2.40～3.20 mm時(shí)，小孢子基本處于單核早期；花蕾長度為3.21～3.69 mm時(shí)（表1），大多數(shù)小孢子處于單核中期；花蕾長度3.70～4.70 mm時(shí)，單核靠邊期所占比例較大，其中花蕾長度4.20 mm時(shí)達(dá)72%，此時(shí)適合進(jìn)行小孢子培養(yǎng)。而花蕾長度超過4.70 mm時(shí)，個(gè)別花粉粒逐漸趨于橢圓形，隨著長度增大，單核靠邊期小孢子所占比例逐漸減少，花粉粒變?yōu)闄E圓形，接近成熟。因此，取樣時(shí)候可以在4.20 mm左右范圍重點(diǎn)觀察，力爭(zhēng)精確取樣。

2.4 花瓣與花藥比值（P/I）與小孢子單核靠邊期的關(guān)系

以整枝處理過的植株上的花蕾為材料，重點(diǎn)測(cè)定花蕾長度在3.20～5.40 mm的花蕾長度。用鑷子輕輕撥開花蕾，取下花瓣和花藥，分別用游標(biāo)卡尺測(cè)定長度，每組花蕾測(cè)定5個(gè)花蕾，計(jì)算平均值，再顯微觀察對(duì)應(yīng)的花藥小孢子發(fā)育時(shí)期。發(fā)現(xiàn)P/I值在0.93時(shí)，單核靠邊期小孢子所占比例最大，為72%，最適合進(jìn)行小孢子培養(yǎng)；大于或小于0.93時(shí)，所占比例逐漸下降，在P/I為0.83和1.00時(shí)分別為66%和57%，可以進(jìn)行培養(yǎng)。因此，在具體進(jìn)行小孢子培養(yǎng)的試驗(yàn)中，合適的P/I值為0.83～1.00，在此范圍內(nèi)可進(jìn)一步精確。P/I值受基因型影響較小，與材料花蕾本身的大小無相關(guān)系，可以作為取樣的可靠標(biāo)準(zhǔn)。

2.5 不同長度花蕾發(fā)育形態(tài)特征

從表1可以看出，在花蕾的整個(gè)發(fā)育過程中，花蕾顏色變化順序?yàn)榈S→黃綠→綠→深綠，花藥顏色變化順序?yàn)榫G→淡綠→黃綠→黃色，花蕾顏色逐漸變深，直至成熟開放。觀察不同花蕾長度下相應(yīng)的花藥，發(fā)現(xiàn)處于單核靠邊期的花蕾顏色為綠色，而花藥顏色是淡綠或者黃綠色，在取樣時(shí)，首先可將花蕾和花藥顏色作為參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行粗取樣，然后再通過其余指標(biāo)綜合判斷，達(dá)到精確取樣的目的。

3 結(jié)論

青花菜綠雄60花球經(jīng)過2～3次疏枝和后期疏蕾后，小孢子發(fā)育整齊一致，適合進(jìn)行小孢子培養(yǎng)研究?；ɡ匍L度在3.70～4.70 mm時(shí)，單核靠邊期所占比例較大，此時(shí)花蕾橫徑2.33～2.75 mm，縱/橫比值1.58～1.71，花瓣長度2.00～3.40 mm，花藥長度2.40～3.40 mm，花瓣/花藥比值0.83～1.00，花蕾綠色，花藥淡綠到黃綠色。在實(shí)際操作中因材料基因型和栽培管理方式不同，花蕾大小不同，花蕾縱橫徑也不同，因此不能依據(jù)單一標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行取樣。但花瓣/花藥比值和花藥顏色可以做為取樣參考標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合多個(gè)指標(biāo)，在一定范圍內(nèi)取樣觀察，將大大減少工作量，提高取樣的精確性。

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（本文責(zé)編：鄭立龍）