黃歡 黃敬洲

【摘 要】文章主要研究利用微生物乙酰膽堿酯酶抑制法開展蔬菜農(nóng)藥殘留檢測(cè)。通過使用超聲波、滲透壓、溶菌酶等方法，從微生物中提取對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥敏感的微生物酯酶。根據(jù)有機(jī)磷農(nóng)藥能夠抑制膽堿酯酶的機(jī)理，用比色法測(cè)定酶的活性。結(jié)果表明：酶促反應(yīng)最佳條件是反應(yīng)時(shí)間為15 min、反應(yīng)溫度為35 ℃、pH值為7.4。選用5種有機(jī)磷農(nóng)藥（敵百蟲、甲胺磷、氧化樂果、乙酰甲胺磷、敵敵畏）對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制作用進(jìn)行了研究。結(jié)果表明：農(nóng)藥濃度在0.1～20 ppm的范圍內(nèi)，農(nóng)藥對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制率隨濃度的升高而增大。此外，文章還分析了溫度、pH值、金屬離子對(duì)該酯酶活力的影響。結(jié)果表明：該酯酶在低于40 ℃的條件下穩(wěn)定，pH值穩(wěn)定范圍為7.4～8.0；Cu2+有明顯的抑制作用，EDTA有較低的抑制作用，Ca2+、Mg2+、Mn2+則有一定程度的激活作用。

【關(guān)鍵詞】有機(jī)磷；農(nóng)藥殘留；微生物酯酶；酶抑制法

【中圖分類號(hào)】X839.2 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1674-0688（2017）06-0068-03

隨著生產(chǎn)的發(fā)展，農(nóng)藥已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)十分重要的生產(chǎn)因素，它的廣泛應(yīng)用為人類創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟(jì)利益，也促進(jìn)了農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展。農(nóng)藥的使用已經(jīng)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中成為必然，并且在將來(lái)農(nóng)業(yè)的發(fā)展依然離不開農(nóng)藥。但是農(nóng)藥也會(huì)對(duì)環(huán)境和人類自身造成一定的危害[1]，農(nóng)藥在食品上的殘留更是引起人們的廣泛關(guān)注。農(nóng)藥殘留量超標(biāo)，直接影響著人們的身體健康、出口貿(mào)易及農(nóng)民收入的提高，嚴(yán)重阻礙了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。建立一套快速和有效的農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法顯得尤為重要，這樣就可以對(duì)農(nóng)藥加以控制，減少和降低農(nóng)藥對(duì)環(huán)境和人類的威脅[2]。

為了更有效地建立有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測(cè)方法，本實(shí)驗(yàn)對(duì)微生物的膽堿酯酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)的研究，包括最適反應(yīng)pH值、最適反應(yīng)溫度、在不同溫度和不同pH值之下的穩(wěn)定性、金屬離子對(duì)酶活力的影響等。

1 膽堿酯酶的提取

對(duì)實(shí)驗(yàn)室包藏菌種進(jìn)行破胞取酶，用3種方法進(jìn)行破胞：超聲波、滲透壓和溶菌酶。取3管菌液進(jìn)行超聲波破胞，超聲波時(shí)間分別為2 min、3 min和5 min，再測(cè)定破胞后的酶活力，選出最佳超聲波時(shí)間。再用4管菌液進(jìn)行滲透壓破胞，滲透壓的蔗糖濃度分別為15%、20%、25%和30%，再測(cè)定破胞后的酶活力，比較出最佳滲透壓濃度。再用4管菌液進(jìn)行溶菌酶破胞，溶菌酶濃度分別為0.3 mg/L、0.5 mg/L、0.8 mg/L和1.0 mg/L，測(cè)定4管破胞后的酶活力，比較出最佳反應(yīng)濃度。再通過3種破胞方法的比較，選擇出酶活力最高的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行破胞取酶。

2 膽堿酯酶酶活的檢測(cè)方法

采用分光光度法：以緩沖液稀釋靛酚乙酸酯（紅色）2.5倍作為底物，乙酰膽堿酯酶將靛酚乙酸酯水解成靛酚（藍(lán)色）和乙酸。靛酚在605 nm的可見光處有吸收峰，根據(jù)其OD值改變量確定酶的相對(duì)活性。

實(shí)驗(yàn)中，在EP管加入10μL膽堿酯酶、450μL緩沖液和50μL靛酚乙酸酯，混勻，于37 ℃水浴中反應(yīng)20 min，加入500μL 95%的乙醇，混勻，取500μL于比色皿中，加入2.5 mL蒸餾水，混勻，測(cè)定OD605。

計(jì)算公式如下：

膽堿酯酶相對(duì)酶活=ΔOD/ΔODmax×100%（1）

公式（1）中：ΔOD為酶反應(yīng)液OD與對(duì)照OD之差；ΔODmax為酶反應(yīng)液OD與對(duì)照OD之差的最大值。

2.1 pH值對(duì)膽堿酯酶活力的影響

配制不同pH值的Na2HPO■檸檬酸緩沖液（0.2 mol/L，pH值為4.0～9.0）。在EP管中加入10μL膽堿酯酶、450μL緩沖液和50μL靛酚乙酸酯，混勻。改變緩沖液的pH值，于37 ℃水浴保溫10 min，加入500μL 95%的乙醇，混勻，測(cè)定OD605。

2.2 溫度對(duì)膽堿酯酶活力的影響

在EP管中加入10μL膽堿酯酶、450μL的Na2HPO■檸檬酸緩沖液（0.2 mol/L，pH值為7.6）和50μL靛酚乙酸酯，混勻。在不同溫度（20～50 ℃）的水浴保溫20 min，加入500μL 95%的乙醇，混勻，測(cè)定OD605。

2.3 膽堿酯酶在不同溫度下的穩(wěn)定性

將10μL膽堿酯酶分別于不同的溫度（20～70 ℃）水浴保溫20 min，加入450μL的Na2HPO■檸檬酸緩沖液（0.2 mol/L，pH值為7.6）和50μL靛酚乙酸酯，混勻，于37 ℃水浴保溫20 min，加入500μL 95%的乙醇，混勻，測(cè)定OD605。

2.4 膽堿酯酶在不同pH值下的穩(wěn)定性

配制不同pH值的Na2HPO■檸檬酸緩沖液（0.2 mol/L，pH值為4.0～9.0）。將10μL膽堿酯酶分別于不同pH（2.2～9.0）37 ℃水浴保溫20 min，將pH調(diào)至7.6，加入50μL靛酚乙酸酯，混勻，于37 ℃水浴保溫20 min，加入500μL 95%的乙醇，混勻，測(cè)定OD605。

2.5 金屬離子對(duì)酶活力的影響

加入100μL二價(jià)金屬離子溶液于不同的EP管中，加入10μL膽堿酯酶、450μL Tris-HCl緩沖液（5 mmol/L，pH值為8.0）和50μL靛酚乙酸酯，混勻，于37 ℃水浴保溫20 min，加入500μL 95%的乙醇，混勻，測(cè)定OD605，計(jì)算金屬離子對(duì)膽堿酯酶的抑制率。

抑制率的計(jì)算公式如下：

I=（Uo-UI）/Uo×100%（2）

公式（2）中：Uo為未受抑制時(shí)膽堿酯酶的活力；UI為受金屬離子抑制時(shí)膽堿酯酶的活力。

2.6 不同濃度的農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶活力的影響

用蒸餾水將農(nóng)藥標(biāo)樣分別稀釋到一定濃度。取100μL不同濃度的農(nóng)藥溶液，加入10μL膽堿酯酶，混勻，于37 ℃水浴保溫20 min，再加入450μL的PB（pH值為7.6）和50μL靛酚乙酸酯，混勻，在37 ℃水浴保溫20 min，加入500μL 95%的乙醇，混勻，測(cè)定OD605，計(jì)算農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶的抑制率。以農(nóng)藥濃度為橫坐標(biāo)，膽堿酯酶的抑制率為縱坐標(biāo)，繪制不同農(nóng)藥的抑制曲線。

抑制率的計(jì)算公式如下：

I=（Uo-UI）/Uo×100%（3）

公式（3）中：Uo為未受抑制時(shí)膽堿酯酶的酶活力；UI為受農(nóng)藥抑制時(shí)膽堿酯酶的酶活力。

3 結(jié)果與分析

3.1 膽堿酯酶粗酶活力的測(cè)定

使用超聲波、滲透壓和溶菌酶3種方法從微生物中提取膽堿酯酶，并改變各方法的反應(yīng)條件，再比較所提取的酶活力，選擇最佳的提取條件。

比較3種提取方法，活力最高的為超聲波，使用超聲波2 min提取膽堿脂酶是最佳的選擇。但是，超聲波提取方法提取量低，只適合實(shí)驗(yàn)室提取，如果是大量提取，應(yīng)該選擇容易操作的滲透壓方法較好。

3.2 pH值對(duì)膽堿酯酶活力的影響

酸、堿既能影響酶的穩(wěn)定性，也能直接影響酶的催化活性。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)酶促反應(yīng)的最適pH值堿酯酶活力較高，酶活力在80%以上；在45 ℃以后，酶活力顯著下降，剩余酶活在10%以下。

3.4 膽堿酯酶在不同溫度下的穩(wěn)定性

丁詩(shī)華等人[36]報(bào)道，不同來(lái)源的膽堿酯酶熱穩(wěn)定性不同，熱穩(wěn)定性越好則該酶越不易失活，越有利于酶的保存。本實(shí)驗(yàn)將膽堿酯酶在不同溫度（20～45 ℃）水浴保溫20 min，研究其酶活力的變化情況。

膽堿酯酶在20～25 ℃保溫20 min，酶活力基本不變，膽堿酯酶剩余酶活都在80%以上。隨著溫度的升高，酶的活性逐漸降低，在35 ℃保溫20 min，活力下降45%；在40 ℃保溫20 min，活力下降63%；在50 ℃保溫20 min，剩余酶活只有15%，說(shuō)明膽堿酯酶對(duì)熱不穩(wěn)定，僅在低于25 ℃的條件下穩(wěn)定。

3.5 膽堿酯酶在不同pH值下的穩(wěn)定性

酶的活性受酸堿的影響很大，同時(shí)酸堿還會(huì)影響到顯色反應(yīng)的程度、顯色時(shí)間以及顯色穩(wěn)定性。本反應(yīng)是一個(gè)酶催化作用下的顯色反應(yīng)，因此保持酶的活性至關(guān)重要，過強(qiáng)的酸堿性對(duì)酶的活性都會(huì)起到破壞作用。本實(shí)驗(yàn)將膽堿酯酶在不同pH（pH值為4.0～9.0）下保溫20 min，研究其酶活力的變化情況，

膽堿酯酶在pH值為7.4～8.0時(shí)，酶活力基本不變，膽堿酯酶剩余酶活都在90%以上；而在pH值為4.0～5.0時(shí)，剩余酶活在30%～50%；在pH值為8.6時(shí)，活力下降40%；在pH值為9.0時(shí)，剩余酶活僅剩42%。這說(shuō)明膽堿酯酶在不同pH值下的穩(wěn)定范圍為7.4～8.0。

3.6 金屬離子及EDTA對(duì)膽堿酯酶活力的影響

金屬離子對(duì)酶的活力有很大的影響。有些金屬離子是穩(wěn)定酶的三維構(gòu)象的重要因素；有些金屬離子則是直接參與催化反應(yīng)的。外加的金屬鹽會(huì)改變酶的許多性質(zhì)，金屬離子對(duì)酶的活力影響也有很強(qiáng)的選擇性，起抑制或激活作用。酶液游離的金屬離子也會(huì)對(duì)膽堿脂酶的活力產(chǎn)生影響，溶液中加入的EDTA會(huì)吸收溶液中的游離金屬離子，也會(huì)對(duì)酶活產(chǎn)生一定的影響。因此，本文研究了幾種常見的金屬離子及EDTA對(duì)膽堿酯酶活力的影響。

低濃度的Cu2+、EDTA對(duì)膽堿酯酶有明顯的抑制作用，如C（Cu2+）=5 mmol/L時(shí)，可以抑制91%左右；C（EDTA）=10 mmol/L時(shí)，可以抑制20%左右；Ca2+、Mg2+、Mn2+則對(duì)膽堿酯酶有一定程度的激活作用，如C（Mg2+）=5 mmol/L時(shí)，可以激活27%左右；C（Ca2+）=5 mmol/L時(shí)，可以激活9%左右。

3.7 不同濃度的農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶活力的影響

膽堿酯酶是有機(jī)磷藥劑的最適反應(yīng)底物，其活性能夠?qū)Ｒ恍缘乇挥袡C(jī)磷和氨基甲酸酯類藥劑所抑制。下面研究了在不同濃度農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶活性的影響。

如圖1所示，農(nóng)藥對(duì)膽堿酯酶的抑制能力隨著濃度的升高，抑制作用增強(qiáng)。其中，敵敵畏對(duì)膽堿酯酶的抑制作用靈敏度最高，其濃度在1 ppm后對(duì)膽堿酯酶的抑制率在90%以上；而其余農(nóng)藥在濃度大于10 ppm后對(duì)膽堿酯酶的抑制作用基本一致，對(duì)膽堿酯酶的抑制率在80%以上。

4 討論

通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，膽堿酯酶對(duì)敵敵畏、敵百蟲、氧化樂果、甲胺磷、乙酰甲胺磷的敏感性非常高，可用于對(duì)有農(nóng)藥殘留的蔬菜進(jìn)行檢測(cè)。此外，該方法檢測(cè)某些蔬菜品種如韭菜、蘿卜、苦瓜時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，因?yàn)檫@些蔬菜含有還原劑，會(huì)影響靛酚乙酸酯的顯色效果，所以這幾種蔬菜不能用酶抑制法來(lái)檢測(cè)。同時(shí)，該方法檢測(cè)農(nóng)藥殘留還有其他缺陷，如樣品中含有過多的葉綠素、植物次生物質(zhì)及反應(yīng)過程中的時(shí)間、溫度等均對(duì)檢測(cè)結(jié)果有影響。而且，該方法只能檢測(cè)對(duì)乙酰膽堿酯酶有抑制作用的有機(jī)磷及氨基甲酸酯類農(nóng)藥，對(duì)其他類型農(nóng)藥造成的污染則無(wú)法檢出。

參 考 文 獻(xiàn)

[1]姚建仁，鄭永權(quán)，董豐收.淺談農(nóng)藥殘留污染、中毒與控制策略[J].植物保護(hù)，2001，27（3）：31-35.

[2]王晶，陳義珍，張?zhí)铮?三種農(nóng)藥殘留量速測(cè)方法的對(duì)比性試驗(yàn)研究[J].中國(guó)食品衛(wèi)生雜志，2001，13（6）：

18-20.

[3]丁詩(shī)華，李清漪.赤子愛勝蚓膽堿酯酶的純化和性質(zhì)[J].

應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，1997，3（3）：246-251.

[責(zé)任編輯：陳澤琦]