王未名 裘紀(jì)瑩 劉孝永 辛雪 孫華 陳蕾蕾 張翔 王易芬 陳相艷

摘要[目的]評(píng)價(jià)銀杏花粉及其發(fā)酵飲料的食用安全性。[方法]選擇健康小鼠進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)，開展了大劑量預(yù)試驗(yàn)及小鼠最大給藥量試驗(yàn)，并測定了該劑量下的小鼠胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)。[結(jié)果]大劑量預(yù)試驗(yàn)小鼠均未死亡，未有異常反應(yīng)，不能測出LD50。最大給藥量試驗(yàn)顯示，小鼠灌胃給藥后除銀杏花粉組1只小鼠意外死亡外，其他小鼠均未發(fā)生死亡或中毒癥狀，活動(dòng)、臟器等均未見異常。銀杏花粉和銀杏花粉發(fā)酵飲料的最大給藥量分別為21.1 g/kg體重和80.0 mL/kg體重，此最大給藥量遠(yuǎn)高于可能攝入的最高劑量；同時(shí)在此劑量下銀杏花粉及其發(fā)酵飲料能夠增加雄性小鼠的胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)。[結(jié)論]銀杏花粉及其發(fā)酵飲料對小鼠沒有急性毒性作用，并且提示對雄性小鼠可能具有一定的免疫增強(qiáng)作用。

關(guān)鍵詞銀杏花粉；小鼠；急性毒性；最大給藥量

中圖分類號(hào)TS201.6文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）05-0077-02

Abstract[Objective] To evaluate the edible safety of ginkgo pollen and its fermentation beverage. [Method] Healthy mice were chosen for acute toxicity test. Highdose pilot study and maximum dose experiment were carried out， as well as determination of the thymus and spleen coefficients of the mice in this dose. [Result] The mice in the highdose pilot study were all alive， no abnormal reaction， and the LD50 could not be measured. The maximum dose experiment showed that except the accidental death of one mouse， no other death or poisoning symptoms occur， and the activities and organs were all normal. The maximum dose of ginkgo pollen and its fermentation beverage were 21.1 g/kg and 80.0 mL/kg， respectively. These dose were much higher than those could be ingested， and the thymus and spleen coefficients of the mice in this dose were increased. [Conclusion] There are no acute toxic effects of ginkgo pollen and its fermentation beverage on mice， and prompting that they might have some immune enhancement effects on male mice.

Key wordsGinkgo pollen；Mice；Acute toxicity；Maximum administration dosage

基金項(xiàng)目山東省自然科學(xué)基金三院聯(lián)合基金項(xiàng)目（ZR2014YL020，ZR2016YL022）；國家科技支撐計(jì)劃（2015BAD16B02）；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科研基金項(xiàng)目（2014QNM47）；泰山學(xué)者專項(xiàng)工程項(xiàng)目；山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年英才培養(yǎng)計(jì)劃。

作者簡介王未名（1957—），男，山東濟(jì)南人，研究員，從事植物保護(hù)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究。*通訊作者，研究員，碩士，從事農(nóng)產(chǎn)品加工研究。

收稿日期2016-12-09

銀杏花粉是銀杏雄株的花粉，營養(yǎng)豐富并且富含黃酮、萜內(nèi)酯等活性組分。研究顯示，銀杏花粉24種游離氨基酸總量達(dá)62.316 mg/g，鉀離子含量達(dá)26.301 mg/g[1]，黃酮類化合物總量約為20.44 mg/g[2]，其中蘆丁、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖-（4→1）-β-L-吡喃鼠李糖苷和山柰酚含量分別為120.90、114.00和222.10 μg/g[3]，具有廣闊的開發(fā)利用價(jià)值。目前在銀杏花粉的開發(fā)利用方面有部分報(bào)道，如孫謹(jǐn)先[4]報(bào)道了一種銀杏花粉膠囊及其制備方法，曹福亮等[5]開展了銀杏花粉食品的加工工藝研究，裘紀(jì)瑩等[6]以銀杏花粉為原料研究開發(fā)了銀杏花粉發(fā)酵飲料，但銀杏花粉原料以及報(bào)道產(chǎn)品的安全性研究尚少見報(bào)道，這大大限制了銀杏花粉在普通食品及功能性食品領(lǐng)域的應(yīng)用。因此，筆者開展了銀杏花粉及其發(fā)酵飲料對小鼠的急性毒性研究，旨在為銀杏花粉的食用安全性提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1

銀杏花粉供試品。銀杏花粉采自山東省郯城縣，干燥過100目篩，供試品采用蒸餾水配制成264 mg/mL的混懸液。

1.1.2

銀杏花粉發(fā)酵飲料供試品。由山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自行研制，該發(fā)酵飲料的銀杏花粉含量為50 mg/mL，乳酸菌活菌量為109 CFU/mL。

1.1.3

試驗(yàn)動(dòng)物。SPF級(jí)昆明種小鼠，雌雄各半，年齡在3～4個(gè)月，體重18～22 g。供試鼠及飼料均由山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)室溫度20～25 ℃，自由進(jìn)水、進(jìn)食。鼠籠墊料及飲水壺每2 d更換并進(jìn)行清洗，以保持清潔。

1.2方法

1.2.1大劑量預(yù)試驗(yàn)。取禁食（正常飲水）18 h的小鼠20只，隨機(jī)分為銀杏花粉組和銀杏花粉發(fā)酵飲料組，每組雌雄各半。采用口服灌胃法，每組劑量為0.04 mL/g體重[7]，記錄試驗(yàn)動(dòng)物反應(yīng)情況。

1.2.2最大給藥量試驗(yàn)[8]。取小鼠60只，禁食12 h（不禁水），隨機(jī)分為銀杏花粉、銀杏花粉發(fā)酵飲料、空白對照組3組，每組20只，雌雄各半。2個(gè)給藥組按0.04 mL/g體重給小鼠灌胃相應(yīng)藥液，2次/d；空白對照組給予小鼠同等體積的蒸餾水灌胃。計(jì)算1 d內(nèi)的給藥量，進(jìn)行急性毒性試驗(yàn)觀察，連續(xù)觀察14 d。期間每天觀察并記錄小鼠的飲食、活動(dòng)、大小便及有無死亡等情況。觀察期結(jié)束，將小鼠脫臼處死解剖，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、小腸等臟器的改變情況；并取小鼠胸腺、脾臟，電子天平稱重，計(jì)算胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.3數(shù)據(jù)分析方法。文中數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1大劑量預(yù)試驗(yàn)

試驗(yàn)得出，給藥后銀杏花粉組和銀杏花粉發(fā)酵飲料組的小鼠均活動(dòng)自如，未發(fā)現(xiàn)明顯異常反應(yīng)，且無一死亡，說明銀杏花粉及其發(fā)酵飲料的安全性高，同時(shí)不能測出急性毒性的LD50值，故按預(yù)試驗(yàn)的2倍劑量進(jìn)行小鼠最大給藥量試驗(yàn)。

2.2最大給藥量試驗(yàn)結(jié)果

小鼠給藥劑量及觀察14 d的體重及死亡情況如表1所示。給藥后小鼠活動(dòng)自如，未發(fā)現(xiàn)明顯異常反應(yīng)，銀杏花粉組給藥后1只小鼠體重逐漸減輕，第5天死亡，解剖后發(fā)現(xiàn)小鼠肺部明顯充血，其他臟器未見明顯異常，灌胃操作時(shí)發(fā)現(xiàn)銀杏花粉組藥液濃度過高，并且銀杏花粉不溶于水，灌胃時(shí)操作難度較大，需反復(fù)灌胃。所以該小鼠死亡的原因可能為反復(fù)操作引起了肺炎反應(yīng)，應(yīng)判定為意外死亡。其余小鼠全部存活，活動(dòng)自如，毛發(fā)光滑，飲食正常，呼吸道、眼及口腔等處無異常分泌物，未發(fā)現(xiàn)任何中毒癥狀，體重均有增加。與空白對照組比較，銀杏花粉發(fā)酵飲料組的雄性小鼠體重極顯著增加（P<0.001）。14 d觀察期結(jié)束，將小鼠脫臼處死解剖，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、小腸等臟器，均未見明顯異常表現(xiàn)。

如上所述，在該1 d給藥劑量下，除銀杏花粉組1只小鼠意外死亡外，其他小鼠在觀察期內(nèi)均未發(fā)生死亡或中毒癥狀，活動(dòng)、臟器等均未見異常。故試驗(yàn)采用的1 d給藥劑量即為小鼠最大給藥量。

銀杏花粉最大給藥量（g/kg體重）=（單只小鼠日給藥量/小鼠平均體重）×1 000=21.1；

發(fā)酵飲料最大給藥量（mL/kg體重）=（單只小鼠日給藥量/小鼠平均體重）×1 000=80.0。

2.3銀杏花粉及其發(fā)酵飲料對小鼠胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)的影響

胸腺是小鼠體內(nèi)重要的免疫器官，胸腺系數(shù)指胸腺重量與體重的比值。脾臟是小鼠體內(nèi)最大的淋巴器官，脾臟系數(shù)指脾臟重量與體重的比值。胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)的變化與機(jī)體免疫功能變化密切相關(guān)[9]。給藥14 d后小鼠胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)結(jié)果見表2。與空白對照組相比，雌性小鼠組間的差異不顯著，而銀杏花粉組的雄性小鼠胸腺系數(shù)顯著增加（P<0.05），銀杏花粉發(fā)酵飲料組的雄性小鼠脾臟系數(shù)極顯著增加（P<0.01）。由此提示，銀杏花粉、銀杏花粉發(fā)酵飲料對雄性小鼠具有一定的免疫增強(qiáng)作用。

3結(jié)論與討論

該研究大劑量預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，銀杏花粉及其發(fā)酵飲料對小鼠無毒無害，安全性高，不能測出急性毒性的LD50值。最大給藥量研究結(jié)果表明，1 d累計(jì)灌服銀杏花粉21.1 g/kg體重、銀杏花粉發(fā)酵飲料80.0 mL/kg體重劑量下，觀察14 d，小鼠無明顯異常反應(yīng)。表明銀杏花粉及其發(fā)酵飲料小鼠灌胃給藥的最大給藥量分別為21.1 g/kg體重和80.0 mL/kg體重，此最大給藥量遠(yuǎn)高于可能攝入的最高劑量，初步說明銀杏花粉及其發(fā)酵飲料對小鼠沒有急性毒性作用。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，銀杏花粉及其發(fā)酵飲料的攝入能夠增加雄性小鼠的胸腺系數(shù)和脾臟系數(shù)，提示其具有一定的免疫增強(qiáng)作用，而對雌性小鼠的免疫功能影響不顯著，其免疫增強(qiáng)作用是否與性別激素有關(guān)，需開展進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)

[1] 任浩，宿樹蘭，管漢亮，等.銀杏花粉中核苷、氨基酸及無機(jī)元素的成分分析[J].中草藥，2014，45（19）：2839-2843.

[2] 王國霞，曹福亮，汪貴斌，等.不同地區(qū)銀杏花粉黃酮和內(nèi)酯含量的差異性[J].南京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007，31（3）：34-38.

[3] 徐澄梅，任浩，錢大瑋，等.采用UPLC-TQ-MS同時(shí)測定銀杏花粉24種資源性化學(xué)成分[J].中國中藥雜志，2015，40（11）：2157-2162.

[4] 孫謹(jǐn)先.銀杏花粉膠囊及其制備方法：200510130954.5[P].2006-08-30.

[5] 曹福亮，汪貴斌，陳穎，等.銀杏花粉食品加工工藝的研究[J].林業(yè)科技開發(fā)，2005，19（4）：68-70.

[6] 裘紀(jì)瑩，陳相艷，劉孝永，等.銀杏花粉及其發(fā)酵飲料的總黃酮含量及總黃酮測定方法比較[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（10）：371-373.

[7] 中華人民共和國國家衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì).食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)：GB 15193.3—2014[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2014.

[8] 張賓，王予輝.常用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作指南[M].上海：上海中醫(yī)藥大學(xué)出版社，2007：204.

[9] 齊東江，徐阿曼.奧美拉唑?qū)π∈笮叵佟⑵⑴K免疫功能的影響[J].安徽醫(yī)藥，2015，19（9）：1665-1667.