郁長(zhǎng)治 郭小娜

摘要[目的]采用高效液相色譜-電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)識(shí)別天山花楸總黃酮類中的化學(xué)成分。[方法]反相C18色譜柱，以乙腈-0.3%甲酸為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm，梯度洗脫。利用紫檢測(cè)器和電噴霧質(zhì)譜負(fù)離子模式在線檢測(cè)化學(xué)成分，掃描范圍250～700 amu。通過(guò)此方法分析糖苷及其苷元。[結(jié)果]通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比及解析質(zhì)譜，識(shí)別了7個(gè)化合物，分別為綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素3-O-己糖苷、槲皮素3-O-己糖苷丙二酸復(fù)合物、山奈素3-O-己糖苷、山奈素3-O-己糖苷丙二酸復(fù)合物。[結(jié)論]HPLC/ESI-MS2技術(shù)可準(zhǔn)確迅速識(shí)別天山花楸黃酮類化合物，方法穩(wěn)定可靠。

關(guān)鍵詞天山花楸；黃酮化合物；液質(zhì)譜聯(lián)用

中圖分類號(hào)R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）05-0111-03

Abstract[Objective] To analyze and identify the chemical compositions form total flavonoids of Sorbus tianshanica Rupr by HPLCESIMS. [Method] The analysis was processed by means of a reversed phase C18 column and binary mobile phase system consisting of acetonitrile -0.3% methanoic acid records 360 um by ultraviolet detector. The electrospray ionization mass spectrometry under negative ion modes was used to detect the chemical constituents. The full scan of ions ranged from 250-700 amu. Glycosides and aglycones were analyzed. [Result] 7 compounds were identified by standard comparison and analytical mass spectrometry， including 3caffeoylquinic acid， rutin， hyperin， quercetin3Ohexoside， quercetin glycoside 3O hexose malonic acid compound， kaempferol hexoside 3Ohexoside， kaempferol glycosides 3O hexose malonic acid compound. [Conclusion] HPLCESIMS can accurately and quickly identify the compositions of flavonoids in S. tianshanica， the method is stable and reliable.

Key wordsSorbus tianshanica Rup；Flavonoids；HPLC/ESIMS

作者簡(jiǎn)介郁長(zhǎng)治（1985—），男，新疆烏魯木齊人，藥師，碩士，從事藥物分析研究。*通訊作者，藥師，碩士，從事藥物分析及新劑型研究。

收稿日期2016-12-13

天山花楸（Sorbus tianschanica Rup）為花楸屬薔薇科植物[1]，具有悠久的民間用藥歷史[2]，具有改善心腦血液循環(huán)、降低血管阻力、依賴性地抑制心肌收縮和保護(hù)心肌缺血等[3]重要作用，在機(jī)體抗氧化[4-5]、鎮(zhèn)咳平喘方面也有顯著的效果。研究表明，天山花楸中主要化學(xué)成分有黃酮、甾醇、三萜等化合物[6]。目前，對(duì)天山花楸黃酮的測(cè)定方法主要有薄層色譜法、紫外分光光度法、毛細(xì)管電泳法和高效液相法[7-8]，但這些方法無(wú)法對(duì)提取物中的未知化合物進(jìn)行定性分析。近年來(lái)，多級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)廣泛應(yīng)用于天然化合物的定性、定量分析[9]，可以快速確定未知成分[10]。筆者采用HPLC/ESI-MS2技術(shù)對(duì)天山花楸總提取物進(jìn)行了分析，為明確天山花楸化合物組成提供了試驗(yàn)基礎(chǔ)和依據(jù)。

1材料與方法

1.1試材

天山花楸提取物（自制）；蘆丁、綠原酸、金絲桃苷、槲皮素、異鼠李素、山奈素標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)藥品生物制品檢定所）；乙腈、甲酸（色譜純）；高純水。

1.2儀器

島津LC-20AD高效液相色譜儀，色譜柱waters C18（4.6 mm×250 mm）；質(zhì)譜儀AB/applied Biosystem.API4000，Analyst 1.42數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

1.3方法

1.3.1樣品溶液制備。稱取天山花楸1 000 g，經(jīng)60%乙醇超聲循環(huán)提取2次，濃縮后經(jīng)AB-8大孔吸附樹(shù)脂柱用60%乙醇洗脫，冷凍干燥得粉末74 g。稱取天山花楸提取物10 mg，甲醇定容至25 mL容量瓶中，過(guò)0.22 μm微孔濾膜備用。標(biāo)準(zhǔn)品均用甲醇溶解，用0.22 μm濾膜過(guò)濾。

1.3.2色譜條件。梯度洗脫檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm；柱溫25 ℃；流速1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。梯度洗脫條件見(jiàn)表1。

1.3.3質(zhì)譜條件。采用ESI負(fù)離子掃描，掃描范圍為250～700 amu；碰撞氣流速5 psi，氣常流速20 psi，離子源電噴霧電壓為-4 500 V，離子源溫度650 ℃，霧化氣電流GS1 50 psi 、GS2 60 psi，去簇電壓DP為 -40 V、EP為-50 V，碰撞能量為-35 V，碰撞出口電壓為-6 V。使用氣體為N2。

1.3.4苷元分析。

天山花楸提取物在酸性條件下加熱水解。苷元經(jīng)HPLC/ESI-MS2分析確定苷元類型。苷元的HPLC洗脫條件見(jiàn)表2。

2結(jié)果與分析

2.1苷元分析

由苷元HPLC圖（圖1）中樣品的保留時(shí)間可看出主要為2種苷元，通過(guò)HPLC/ESI-MS2并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)（表3）可以確定2種苷元是槲皮素和山奈素。

2.2總離子流與色譜分析

天山花楸提取物HPLC色譜圖與其總離子流色譜圖吻合（圖2）。因黃酮類化合物具有較多羥基，可形成穩(wěn)定的氧負(fù)離子，所以采用負(fù)離子檢測(cè)模式，使總離子流色譜圖有較低的信噪比。

2.3質(zhì)譜解析

2.3.1化合物1。準(zhǔn)分子離子峰m/z為352.8[M-H]-，針對(duì)m/z 352.8進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，出現(xiàn)m/z 190.9、160.8碎片離子，發(fā)現(xiàn)其與綠原酸的[M-H]-離子碎片的分子量十分吻合。2個(gè)離子碎片分別是綠原酸酯鍵斷裂后形成的阿魏酸m/z 190.9和奎寧酸m/z 160.8的離子碎片（表4）。最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比確定化合物1為綠原酸。

2.3.2

化合物2。準(zhǔn)分子離子峰m/z為609.1[M-H]-，對(duì)m/z 609.1進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，出現(xiàn)m/z 300.0特征峰，并含有m/z 273.0、178.9、151.0特征碎片，可以認(rèn)定這個(gè)是槲皮素離子，說(shuō)明化合物2是以槲皮素為苷元的化合物。m/z 307.4離子碎片為槲皮素上的二糖結(jié)構(gòu)（表4）。對(duì)比分子量、苷元與糖苷的組成發(fā)現(xiàn)，此化合物與蘆丁裂解規(guī)律一致。最后通過(guò)蘆丁對(duì)照品對(duì)比確定化合物2為蘆丁。

2.3.3

化合物3。準(zhǔn)分子離子峰m/z為462.9[M-H]-。針對(duì)m/z 462.9進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，出現(xiàn)m/z 300.8特征峰，并且含有m/z 272.9、179.0、150.9特征碎片，參考化合物2可以斷定m/z 300.8是槲皮素離子；m/z 162.7離子碎片與六碳糖苷的分子量吻合（表4）。經(jīng)對(duì)比分子量、苷元與糖苷的分子量與組成發(fā)現(xiàn)，此化合物與金絲桃苷的裂解規(guī)律十分吻合。最后通過(guò)金絲桃苷對(duì)照品對(duì)比，確定化合物3為金絲桃苷。

2.3.4化合物4。準(zhǔn)分子離子峰m/z為463.1[M-H]-。針對(duì)m/z 463.1進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，得到m/z 300.0特征峰，并且含有m/z 273.0、179.0、150.8特征碎片，同化合物2可以斷定m/z 300.0是槲皮素離子，說(shuō)明化合物4是以槲皮素為苷元的化合物。m/z 155.0離子峰的出現(xiàn)說(shuō)明槲皮素苷元是按照RDA途徑I進(jìn)行裂解，可以推斷m/z 161這個(gè)糖基是連接在槲皮素碳3位上（表4）。所以此化合物可以認(rèn)為是槲皮素3-O-己糖苷。

2.3.5化合物5。準(zhǔn)分子離子峰m/z為549.0[M-H]-。針對(duì)m/z 549.0進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，同樣得到了m/z 300.0的特征峰，并且含有m/z 271.0、179.0、150.6特征碎片，參考化合物2說(shuō)明化合物5是以槲皮素為苷元的化合物；雖然未出現(xiàn)m/z 155.0、136.0等離子碎片，但按照槲皮素苷元與糖的連接特點(diǎn)可以認(rèn)為糖的連接位置依然是槲皮素碳3位上。m/z 160.8為己糖離子。m/z 89.0為丙二酸的離子碎片，有文獻(xiàn)報(bào)道黃酮苷在進(jìn)行質(zhì)譜解析中會(huì)出現(xiàn)含有丙二酸的結(jié)構(gòu)成分（表4）。所以此化合物推測(cè)是槲皮素3-O-己糖苷丙二酸復(fù)合物[11]。

2.3.6

化合物6。準(zhǔn)分子離子峰m/z為447.0[M-H]-。針對(duì)m/z 447.0通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜掃描，得到m/z 283.8特征峰，并且找到了山奈素0、4位裂解的特征碎片m/z 177.8。由此可以斷定m/z 283.8是山奈素離子，說(shuō)明化合物6是以山奈素為苷元的化合物。m/z 160.8為己糖離子（表4）。所以此化合物可以認(rèn)為是山奈素3-O-己糖苷[12]。

2.3.7

化合物7。準(zhǔn)分子離子峰m/z為533.2[M-H]-。針對(duì)m/z 533.2通過(guò)二級(jí)質(zhì)譜掃描，出現(xiàn)m/z 285.0、1790，同化合物6可以斷定m/z 285.0是山奈素離子，該化合物是以山奈素為苷元的化合物。m/z 160.8為己糖離子，m/z 89.0為丙二酸（表4）。所以此化合物可以推測(cè)是山奈素3-O-己糖苷丙二酸復(fù)合物[13]。

3結(jié)論

運(yùn)用HPLC/ESI-MS2對(duì)天山花楸粗提物中的化學(xué)成分進(jìn)行了系統(tǒng)研究，對(duì)天山花楸提取物在負(fù)離子模式下的離子流圖中的化學(xué)成分進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，天山花楸化學(xué)成分主要為黃酮類化合物。根據(jù)不同化合物在質(zhì)譜中的相對(duì)分子量、質(zhì)譜碎片結(jié)構(gòu)信息及色譜保留規(guī)律并加以標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，成功鑒定了天山花楸中7個(gè)化合物，分別為綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、槲皮素3-O-己糖苷、槲皮素3-O-己糖苷丙二酸復(fù)合物、山奈素3-O-己糖苷、山奈素3-O-己糖苷丙二酸復(fù)合物。

參考文獻(xiàn)

[1] 國(guó)家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草：第4卷[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：292.

[2] 新疆自治區(qū)衛(wèi)生廳.新疆自治區(qū)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].烏魯木齊：新疆衛(wèi)生出版社，1987：1410.

[3] 付偉，劉婷，楊彩玉，等.天山花椒葉總黃酮對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010，26（2）：251-254.

[4] TERMENTZI A，KEFALAS P，KOKKALOU E.Antioxidant activities of various extracts and fractions of Sorbus domestica fruits at different maturity stages[J].Food chemistry，2006，98（4）：599-608.

[5] NA M K，AN R B，MIN B S，et al.Antioxidant compounds from the stem bark of Sorbus commixta[J].Nat Prod Sci，2002，8（1）：26-29.

[6] LI L，TANG H，WU T，et al.Chemical composition of Sorbus tianschanica leaves[J].Chem of Nat Compd，2010，46（5）：811-812.

[7] 馬曉麗，常軍民，李毓斌，等.毛細(xì)管電泳法測(cè)定天山花楸中的黃酮類化合物[J].中成藥，2011，33（3）：534-536.

[8] MA Y C，LUO M，SARAH W，et al.Qualitative and quantitative evaluation of epimedium and ginseng contained combinations using HPLC[J].Journal of Chinese pharmaceutical sciences，2003，12（1）：6-10.

[9] TIAN H Z，WANG H，GUAN Y F.Separation and identification of isoflavonoida in Pueraria lobata extracts and its preparations by reversedphase capillary liquid chromatography coupled with electrospray ionization quadrupole time of flight mass spectrometry[J].Chinese journal of chromatography，2005，23（5）：477-481.

[10] 肖崇厚.中藥化學(xué)[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1998：265-323.

[11] KAMATA K，SEO S，NAKAJIMA J.Constituents from leaves of Apocynum venetum L.[J].J Nat Med，2008，62（2）：160-163.

[12] NGUELEFACK T B，MBAKAM F H K，TAPONDJOU L A，et al.A dimeric triterpenoid glycoside and flavonoid glycosides with free radicalscavenging activity isolated from Rubus rigidus var.camerunensis[J].Arch Pharmacal Res，2011，34（4）：543-550.

[13] WALD B，WRAY V，GALENSA R，et al.Malonated flavonol glycosides and 3，5dicaffeoylquinic acid from pears[J].Phytochemistry，1989，28（2）：663-664.