韋顯凱 閉璟珊 蔣曉霞

摘要[目的]檢測廣西豬群主要疫病的感染狀況。[方法]2015年，從發(fā)病豬場和屠宰場采集豬組織樣品276份，應用RT-PCR方法檢測豬瘟病毒（CSFV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV），并應用PCR方法檢測豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）和豬偽狂犬病病毒（PRV）。[結果]發(fā)病豬場中，CSFV、PRRSV、PEDV、PCV2、PRV病毒感染率分別為3.98%、11.36%、0、28.98%和4.55%，而屠宰場豬CSFV、PRRSV、PEDV、PCV2、PRV病毒的感染率分別為1.00%、2.00%、0、29.00%和3.00%。對豬群混合感染情況分析發(fā)現(xiàn)，PCV2和其他病原的混合感染率最高。其中，發(fā)病場二重感染率最高的為PRRSV+PCV2，達到5.11%，其次為PCV2+PRV和PRV+PRRS， 陽性率均為0.57%。屠宰場二重感染率最高的是PCV2+PRV，陽性率為1.00%。[結論]在發(fā)病豬場和屠宰場中，豬圓環(huán)病毒2型的感染率最高，且常與其他病原發(fā)生混合感染，偽狂犬病毒感染率較2014年有所下降。

關鍵詞豬群； 流行病學調查；多重感染；廣西

中圖分類號S858.28文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）36-0085-03

Abstract[Objective]To detect the infection situations of normal swine diseases in Guangxi.[Method] 276 swine tissue samples were collected from diseased pig farms and slaughter houses，classical swine fever virus（CSFV），porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV） and porcine epidemic diarrhea virus（PEDV） were detected by RTPCR， porcine circovirus 2（PCV2） and porcine pseudorabies virus（PRV） were detected by PCR.[Result] The infection rates of CFSV，PRRSV，PEDV，PCV2，PRV in diseased pig farms were 3.98%，11.36%，0，28.98% and 4.55%， respectively， and those in the slaughter houses were 1.00%，2.00%，0，29.00% and 3.00%， respectively.The analysis of the mixed infection in pig herd showed that the coinfection rate of PCV2 with other viruses was the highest.In the diseased pig farms， PCV2+PRRSV was the most universal double infection， the positive rate was 5.11%， posteriorly was PCV2+PRV and PRV+PRRS， the positive rates of the both were 0.57%.In the slaughter houses， PCV2+PRV was the most universal double infection， the positive rate was 1.00%.[Conclusion]PCV2 had the highest infection rate not only in morbidity farms， but also in slaughter houses.And PCV2 coinfection with other virus was universal.The infection rate of PRV was descend compared with that in 2014.

Key wordsPig herd；Epidemiological investigation；Multiple infection； Guangxi

豬瘟（Classical swine fever，CSF）、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）、豬流行性腹瀉?。≒orcine epidemic diarrhea，PED）、豬圓環(huán)病毒相關疾?。≒orcine circovirus associated disease，PCVAD）和豬偽狂犬病（Porcine pseudorabies，PR）是近年來流行和危害較為嚴重的豬群疫病，這 5種傳染病中的任何一種一旦發(fā)生，都會給豬場造成巨大的經濟損失。因此，在養(yǎng)豬生產中必須做好 CSF、PRRS、PED、PCV2 和PR這5種傳染病的防疫工作 [1-3]。

目前，我國對豬瘟的防控以疫苗免疫為主，取得了一定的效果，但豬瘟在我國仍時有發(fā)生[4]。豬瘟一直困擾著養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展，主要以急性發(fā)病、高稽留熱、小血管壁變性、全身性小點狀出血及脾臟邊緣梗死為主要病理變化。目前豬場現(xiàn)狀是豬瘟頻發(fā)，以非典型豬瘟為主，有的地方還可以看見非常明顯的豬瘟，其主要原因有疫苗質量不合格、疫苗運輸冷鏈管理不規(guī)范、疫苗免疫操作不當、豬群免疫抑制疾病干擾等[5]。高致病性豬藍耳病自2006年至2010年在我國多個省（市）引發(fā)了多起 、多輪疫情。自2011年以來，病毒變異度逐年下降、趨于穩(wěn)定，疫情強度隨之明顯下降。 目前的主要問題是高藍變異株與經典株并存、歐洲株與美洲株并存。豬繁殖與呼吸綜合征以引起豬群免疫力嚴重降低，易繼發(fā)感染等為主要特征，是目前影響豬場健康的重要動物疫病之一[6]。自2010年以來，隨著豬流行性腹瀉病毒新毒株的出現(xiàn)，該病在我國的流行情況更為嚴重。由于疫苗毒株與流行毒株不匹配、免疫途徑不能產生滿意的黏膜免疫，商品滅活疫苗的免疫預防效果不佳[7-8]。豬圓環(huán)病毒相關疾病 （PCVAD）是由PCV2感染引起的，對豬的感染率較高，在世界范圍內廣泛發(fā)生，嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展，近年來已成為危害我國養(yǎng)豬業(yè)的主要疾病之一[9]。豬偽狂犬病是由偽狂犬病病毒引起的多種家畜和野生動物的一種高度接觸性傳染病，可導致懷孕母豬發(fā)生流產、死胎、木乃伊胎，哺乳仔豬出現(xiàn)神經系統(tǒng)癥狀，死亡率在90%以上，并表現(xiàn)出從單一感染向混合感染擴大的趨勢，給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。自2011 年以來，偽狂犬病在我國部分豬場中出現(xiàn)大面積感染現(xiàn)象，包括已接種基因缺失苗的規(guī)?；i場，陽性率普遍升高，疫情日趨嚴重[10]。

盡管養(yǎng)殖戶對上述疫病的防控都十分重視，很多豬場也采取了嚴格的疫苗免疫措施，但仍不能有效控制上述疫病的發(fā)生和流行。為了解廣西豬群主要疫病的流行情況，筆者于2015年從廣西不同地區(qū)發(fā)病豬場和屠宰場采集豬組織樣品，并應用RT-PCR和PCR方法對5種病原進行檢測，分析其單一感染和多重感染情況，旨在為廣西豬群主要疫病的預防和控制提供科學依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品采集。按照動物疫病實驗室病料樣品采集方法，2015年從廣西壯族自治區(qū)南寧市、柳州市、玉林市、博白縣、靈山縣等地的發(fā)病豬場采集不同日齡病死豬的肺臟、脾臟和淋巴結組織樣品 176份；從南寧市、柳州市、玉林市、博白縣、靈山縣等地的屠宰場采集肺臟、脾臟和淋巴結組織樣品100份。將采集的樣品送至廣西動物疫病預防控制中心，經處理后取上清組織液，置于-70 ℃低溫冰箱中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2試劑。RNA 和DNA提取試劑盒（MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0）、一步法RT-PCR試劑（PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2）、PCR試劑Premix TaqTM（Ex TaqTM Version 2.0 plus dye），均購自TaKaRa 公司。

1.2方法

1.2.1引物設計與合成。參照我國農業(yè)標準合成特異性引物，采用RT-PCR方法進行豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬流行性腹瀉的病原學檢測，采用PCR方法進行豬圓環(huán)病毒2型和豬偽狂犬病的病原學檢測，RT-PCR和PCR引物序列見表1。

1.2.2病毒核酸的提取。每份采集病料取2 g左右，按1∶5的比例加入生理鹽水進行研磨，凍融2次后，10 000 r/min離心3 min，取200 μL上清液，用 RNA/DNA提取試劑盒提取病毒核酸，操作方法按照說明書進行。

1.2.3RT-PCR和PCR。①RT-PCR反應體系（25 μL）：2×One Step Buffer 12.5 μL，上、下游引物（20 pmol/μL）各1 μL，RNA 3 μL，PrimeScriptTMOne Step Enzyme Mix 1 μL，用無菌水補足25 μL。RT-PCR反應程序：50 ℃ 30 min；95 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。②PCR反應體系：2×Premix PCR Buffer 12.5 μL，上、下游引物（20 pmol/μL）各1 μL，DNA 3 μL，用無菌水補足25 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性5 min；94 ℃預變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。

1.2.4PCR產物的鑒定。取RT-PCR或PCR產物6 μL在1.0%瓊脂凝膠上進行電泳。如果檢測樣品出現(xiàn)預期陽性對照大小的條帶，則判定為陽性，否則判定為陰性。

1.2.5感染情況的鑒定。對采集病樣分別進行CSFV、PRRSV、PCV2、PRV和PEDV的病原學檢測，同一份樣品只能檢測到1種病原呈陽性的為單一感染，同時檢測到2種病原呈陽性的為二重感染，同時檢測到3種及以上病原呈陽性的為三重以上感染。

2結果與分析

從廣西5個地區(qū)共采集發(fā)病豬以及屠宰場豬組織樣品325份，所有的樣品均進行CSFV、PRRSV、PCV2、PRV和PEDV病原學檢測，陽性樣品RT-PCR/PCR預期擴增產物大小分別為508、433、1 154、217和663 bp，5種病毒的電泳圖譜如圖1所示。對檢測結果進行感染率、單一感染、二重感染及多重感染的分析結果見表2～5。

2.15種病原檢測結果

由表2可知，在5種病原中，檢出率最高的是PCV2，陽性率高達28.99%，其次為PRRSV（陽性率達7.97%），PRV和CSFV陽性率分別為3.99%和2.90%，最低的為PEDV（陽性率為0）。其中，PCV2在發(fā)病場和屠宰場的檢出率分別為28.98%和29.00%。CSFV、PRRSV和PRV在發(fā)病豬場的檢出率均高于屠宰場。這表明PCV2是感染豬群的主要疫病，健康豬和發(fā)病豬均有較高的感染率，而PRRSV、PRV和CSFV主要在發(fā)病豬中檢出。

2.2單一感染情況

由表3可知，PCV2的單一感染率最高，在發(fā)病場和屠宰場中分別為23.30%和28.00%；PEDV的單一病原感染率最低，在發(fā)病場和屠宰場中均為0。這表明PCV2無論發(fā)病豬還是健康豬都有很高的單一感染率。

2.3二重感染情況由表4可知，在發(fā)病場中，PCV2和其他病原的混合感染最為多見。其中，感染率最高的是PRRSV+PCV2，達到5.11%；其次為PRRSV+PRV和PCV2+PRV，陽性率均為0.57%。屠宰場二重感染較多的是PCV2+PRV，陽性率為1.00%。這表明在發(fā)病豬場中PRRSV+PCV2是最為普遍的混合感染情況。

2.4三重以上感染情況

此次檢測三重感染的在發(fā)病豬場和屠宰場均未檢測到。2014年發(fā)病豬場PRRSV+PEDV+PCV2和PRRSV+PCV2+PRV的三重感染率均為2.29%，屠宰場CSFV+PCV2+PRV三重感染率為0.67%。與2014年相比，2015年多重感染情況減輕。

3討論與結論

豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬偽狂犬病和豬圓環(huán)病毒2型是引起母豬繁殖障礙以及造成豬場損失較大的豬群疫病，豬流行性腹瀉使初生仔豬腹瀉死亡，給豬場帶來巨大的經濟損失。檢測發(fā)病豬場以及屠宰場中這些動物疫病對于預防和控制豬群疫情具有重要意義。

在所有樣品中，PCV2的檢出率最高，說明PCV2不僅在發(fā)病豬場中有較高的感染率，而且在無發(fā)病癥狀的豬群中也同樣存在。該病毒能引起免疫抑制，造成其他疫病的疫苗免疫后抗體產生不良反應。近年來，隨著 PCV2滅活疫苗的使用，其流行情況得到了一定程度控制，但在臨床檢測診斷中仍有 PCV2感染病例不斷出現(xiàn)，加之與其他疾病的混合感染，PCV2感染控制的形勢仍然十分嚴峻[11]。當前豬病的一大特征就是混合感染病例增多，使得診斷和治療難度加大、治療成本上升、治愈率下降，且這種混合感染呈逐漸增長趨勢。PCV2和其他疫病病原的混合感染最為嚴重，具有免疫抑制作用，在感染后機體免疫力受到抑制，容易繼發(fā)感染其他動物疫病[12]。豬繁殖與呼吸綜合征病毒的一個顯著特征就是對巨噬細胞的嗜性，在巨噬細胞內進行殺傷性復制，造成機體內各種組織器官的巨噬細胞被大量破壞[13]，PRRSV和PCV2的混合感染最為常見。

該研究中PRV的檢出率比2014年要低，說明偽狂犬病在采樣地區(qū)的感染率有所下降。豬偽狂犬病發(fā)病率自2011年冬季以來，不同規(guī)模豬場發(fā)病病例明顯增多，波及仔豬、保育豬、育肥豬甚至種豬等不同階段豬群，導致母豬流產，哺乳仔豬腦炎、死淘率高，保育豬與育肥豬呼吸道問題等。董和平等[14]認為，這與豬偽狂犬病病毒毒力和免疫原性基因發(fā)生改變有關。迄今為止，免疫接種仍然是預防和控制該病的有效辦法。通過對豬場分離的偽狂犬病野毒來測定疫苗免疫后血清的中和抗體水平是選擇疫苗毒株的科學方法。

豬流行性腹瀉在近幾年的流行情況比較嚴重，給養(yǎng)殖戶造成了極大的經濟損失。盡管許多養(yǎng)殖場已執(zhí)行豬流行性腹瀉的免疫程序，但腹瀉情況仍時有發(fā)生。由于豬流行性腹瀉病毒發(fā)生變異，商品滅活疫苗由于疫苗毒株與流行毒株不匹配，肌肉注射免疫途徑不能產生有效的黏膜免疫，免疫預防效果不佳[7-8]。部分豬場常常使用腹瀉仔豬小腸返飼母豬，由于腹瀉也是偽狂犬病的癥狀之一，因此當豬場使用返飼技術緊急預防仔豬流行性腹瀉時，如果仔豬小腸中含有偽狂犬病毒，則不可避免地傳播擴散偽狂犬病毒[10]。

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