姜守剛 袁穎潔 阮鑫

摘要 [目的]優(yōu)化野火球總黃酮的最佳提取工藝，研究野火球總黃酮的抗氧化活性。[方法]比較分析熱回流提取法、索氏提取法、超聲提取法對(duì)野火球總黃酮提取率的影響，并采用單因素試驗(yàn)及正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)，優(yōu)化超聲提取野火球總黃酮的最佳提取工藝。采用DPPH和FRAP法對(duì)野火球總黃酮的DPPH自由基清除能力和總抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。[結(jié)果]超聲提取法為提取野火球總黃酮的最合適的提取方法，其最優(yōu)工藝參數(shù)是：乙醇濃度50%，超聲時(shí)間75 min，料液比1∶20，超聲功率350 W。在上述條件下，野火球總黃酮提取率為1.686%。野火球提取物對(duì)DPPH自由基有較好的清除效果，IC50為（0.207 7±0.010 3） mg/mL，并且具有較好的總抗氧化能力，F(xiàn)RAP值為（4.561 0±0.228 0） mmol/g。[結(jié)論]優(yōu)化的野火球總黃酮提取工藝穩(wěn)定可行，野火球總黃酮具有較好的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞 野火球；總黃酮；超聲提??；正交試驗(yàn)；抗氧化

中圖分類號(hào) R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）28-0003-04

Abstract [Objective] To optimize the extraction process for total flavonoids from Trifolium lupinaster L.and to study its antioxidant activities.[Method] Choosing the extraction rate of flavonoids as evaluation standard，the different methods，such as heating reflux method，soxhlet extration method and ultrasonic extraction，were comparatively analysed.Base on the single factor tests and the orthogonal experimental design，the best condition of ultrasonic extraction flavonoids was found and sifted.Furthermore，the DPPH radical scavenging capacity and FRAP total antioxidant activity tests were carried out to examine its antioxidant activities.[Result] The ultrasonic extraction was the best way to extract the total flavonoids from Trifolium lupinaster L.The optimal ultrasonic extract conditions were ethanol concentration of 50%，ultrasonic time of 75 min，solidliquid radio of 1∶20 and ultrasonic power of 350 W.Under these optimized conditions，the yield of total flavonoids from Trifolium lupnaster L.was 1.686%.Additionally，by in vitro antioxidant assays，the total flavonoids extracted using ultrasonic extraction had a potent scavenging effect on DPPH free radical with IC50 value of （0.207 7±0.010 3） mg/mL and FRAP antioxidative capacity scavenging activity with value of （4.561 0±0.228 0） mmol/g.[Conclusion] The ultrasonic extraction of total flavonoids was stable and feasible.Moreover，the extracts by this method exhibited a better antioxidative activity.

Key words Trifolium lupinaster L.；Total flavonoids；Ultrasonic extraction；Orthogonal experiment；Antioxidant activity

野火球（Trifolium lupinaster L.）為豆科車軸草屬多年生草本植物，別名野車軸草、豆參、野火萩等。野火球大多數(shù)生長在林緣草甸、森林草原、山坡濕地、河岸兩旁、灌叢中，廣泛分布于我國黑龍江省、遼寧省、吉林省、內(nèi)蒙古和河北省等地[1]。據(jù)記載，野火球味苦、性平，具有鎮(zhèn)靜安神、止咳止血的功效[2]。

研究表明，野火球中含有豐富的黃酮類成分[1]。國外對(duì)野火球的研究很少，國內(nèi)有對(duì)其化學(xué)成分[1]、鎮(zhèn)靜催眠[3]、營養(yǎng)價(jià)值[4]、總黃酮微波提取優(yōu)化[2]、組織培養(yǎng)[5-6]等方面的研究，而對(duì)野火球總黃酮不同提取方法的比較研究和抗氧化活性研究鮮見報(bào)道。因此，野火球作為一種可再生資源，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的開發(fā)和利用具有重要意義。

熱回流提取法可以使提取劑與目標(biāo)物充分接觸，并通過升溫來提高溶劑對(duì)目標(biāo)物的提取率[7]。索氏提取法是利用溶劑回流及虹吸原理，使用純?nèi)軇┎粩嗟剌腿」腆w物質(zhì)的一種提取方法[8]。超聲提取法的原理是利用超聲波的空化作用、熱效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)，使胞內(nèi)有效成分不斷地被釋放、擴(kuò)散和溶解，進(jìn)而使有效成分的提取率得到顯著提高[9]。筆者以野火球總黃酮提取率作為考察指標(biāo)，研究了在相同提取條件下3種不同提取方法（熱回流提取法、索氏提取法、超聲提取法）對(duì)野火球總黃酮提取率的影響，采用單因素試驗(yàn)及正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化超聲提取的最佳提取工藝，并對(duì)野火球總黃酮的DPPH自由基清除能力和FRAP抗氧化能力進(jìn)行了分析[10]，以期為野火球的綜合開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料。野火球采自黑龍江省哈爾濱市東北林業(yè)大學(xué)知園，經(jīng)東北林業(yè)大學(xué)森林植物生態(tài)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室祖元?jiǎng)偨淌阼b定為豆科植物野火球（Trifolium lupinaster L.）。將野火球藥材洗凈后干燥，粉碎，然后過80目篩，將其置陰涼干燥處以待備用。

1.1.2 藥劑與試劑。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品購自南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；FRAP購自碧云天生物技術(shù)有限公司；DPPH購自美國Sigma公司； 亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸鋁和乙醇均為分析，購自天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器。KQ-500DE超聲波清洗器購自昆山市超聲儀器有限公司；DHG-9240電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱熱購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FW100高速萬能粉碎機(jī)購自天津泰斯特儀器有限公司； ALC-1104電子分析天平購自北京賽利多斯儀器系統(tǒng)有限公司；752N紫外可見分光光度計(jì)購自上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制。

稱取0.101 2 g蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（120 ℃烘干至質(zhì)量恒定），用60%乙醇溶解，然后置于100 mL容量瓶中，定容至100 mL，所配制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為1.012 mg/mL。

精密移取0、0.2、0.4、0.6、0.8 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于10 mL容量瓶中，加蒸餾水至2.4 mL，加0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻，放置6 min；加0.3 mL10%硝酸鋁溶液，混勻，放置6 min；加4.0 mL 4.3%氫氧化鈉溶液，再加入蒸餾水定容至10.0 mL，混勻，放置15 min，以試劑空白為參比，在波長490～520 nm掃描，得到其最大吸收峰的波長是515 nm，以吸光度為縱坐標(biāo)（y），蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)（x）繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程：y=9.456 5x+0.000 8，R2=0.999 5。

1.2.2 野火球總黃酮提取率的測定。稱取1.000 3 g野火球粉末，在一定的乙醇濃度、溫度和料液比條件下提取，并對(duì)提取液進(jìn)行抽濾、離心和定容。精密移取一定量的待測液，并且按照“1.2.1”方法測定吸光度，得到總黃酮含量，再由公式（1）計(jì)算總黃酮提取率：

總黃酮提取率=X×V×V′m×103×100%（1）

式（1）中，X為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的蘆丁濃度（mg/mL）；V為待測液的定容總體積（mL）；V′為提取后過濾得到的體積與待測液定容總體積之比；m為野火球粉末質(zhì)量（g）。

1.2.3 野火球總黃酮的提取。

1.2.3.1 熱回流提取法。

稱取1.000 2 g野火球粉末置于熱回流裝置中，按照料液比1∶20共加入80 mL 50%乙醇，溫度60 ℃，提取時(shí)間60 min，冷卻并對(duì)提取液進(jìn)行抽濾、離心和定容。精密移取一定量待測液，按照“1.2.1”方法測定吸光度。

1.2.3.2 索氏提取法。

稱取1.000 4 g野火球粉末置于索氏提取裝置中，按照料液比1∶20共加入80 mL 50%的乙醇，溫度60 ℃，提取時(shí)間60 min，冷卻并對(duì)提取液進(jìn)行抽濾、離心和定容。精密移取一定量待測液，按照“1.2.1”方法測定吸光度。

1.2.3.3 超聲提取法。

稱取1.000 3 g野火球粉末置于帶塞錐形瓶中，按照料液比1∶20共加入80 mL 50%乙醇，60 ℃下提取60 min，冷卻并對(duì)提取液進(jìn)行抽濾、離心和定容。精密移取一定量待測液，按照“1.2.1”方法測定吸光度。

1.2.4 單因素試驗(yàn)。

1.2.4.1 乙醇濃度的選擇。

稱取6份1.000 3 g野火球粉末，放入帶塞錐形瓶中，按料液比1∶20分別加入不同濃度（10%、30%、50%、70%、90%）乙醇。設(shè)置超聲功率300 W，溫度恒定于60 ℃，然后將其在上述條件下提取60 min，冷卻并對(duì)提取液進(jìn)行抽濾、離心和定容。精密移取一定量待測液，按照“1.2.1”方法測定吸光度。

1.2.4.2 超聲時(shí)間的選擇。稱取6份2.000 7 g野火球粉末，放入帶塞錐形瓶中，按料液比1∶20，加入50%乙醇。設(shè)置超聲功率300 W，溫度恒定于60 ℃，然后選擇不同的超聲時(shí)間（30、45、60、75、90 min），將其在上述條件下進(jìn)行提取，提取之后冷卻提取液，并且進(jìn)行抽濾、離心和定容。精密移取一定量待測液，按照“1.2.1”方法測定吸光度。

1.2.4.3 料液比的選擇。

稱取6份2.000 1 g野火球粉末，放入帶塞錐形瓶中，加入50%乙醇，超聲時(shí)間60 min，超聲功率300 W，溫度恒定于60 ℃，然后選擇不同的料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30），將其在上述條件下進(jìn)行提取，冷卻提取液，并且進(jìn)行抽濾、離心和定容。精密移取一定量待測液，按照“1.2.1”方法測定吸光度。

1.2.4.4 超聲功率的選擇。

稱取6份2.000 2 g野火球粉末，放入帶塞錐形瓶中，按料液比1∶20，加入50%乙醇，超聲時(shí)間60 min。溫度恒定于60 ℃，然后選擇不同的超聲功率（200、250、300、350、400 W），將其在上述條件下進(jìn)行提取，提取之后冷卻提取液，并且進(jìn)行抽濾、離心和定容。精密移取一定量待測液，按照“1.2.1”方法測定吸光度。

1.2.5 正交試驗(yàn)。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、超聲時(shí)間、料液比和超聲功率4個(gè)因素的3個(gè)水平（表1）進(jìn)行正交試驗(yàn)，優(yōu)化超聲提取野火球總黃酮的工藝條件，建立L9（34）正交表。

1.2.6 野火球總黃酮抗氧化活性的測定。

1.2.6.1 清除DPPH自由基能力的測定。

稱取0.003 9 g DPPH，將其溶解于95%乙醇溶液中[11]，并用100 mL容量瓶定容，配制成0.1 mmol/L DPPH 乙醇溶液，置于暗處保存[12]。向試管中分別加入1.5 mL 0.1 mmol/L DPPH 乙醇溶液和1.5 mL不同濃度的樣品溶液，混合，振蕩，在室溫和避光條件下使其反應(yīng)30 min，然后在517 nm波長處測定吸光值[10]。以空白試劑作為對(duì)照，DPPH自由基清除率按照公式（2）進(jìn)行計(jì)算：

清除率=A0-A1A0×100%（2）

式（2）中，A0為 DPPH 與乙醇混合液的吸光度；A1為加入樣品后 DPPH 與乙醇混合液的吸光度。

1.2.6.2 FRAP總抗氧化能力的測定。

準(zhǔn)確吸取乙酸緩沖液、TPTZ溶液和三氯化鐵溶液各2.5 mL，并將上述混合液置于37 ℃下保溫30 min[13]。取300 μL不同濃度的樣品溶液和6 mL FRAP溶液混合，振蕩，37 ℃避光保溫30 min，在593 nm波長處測定吸光值[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法的比較

熱回流提取法、索氏提取法、超聲提取法對(duì)野火球總黃酮提取率影響結(jié)果如圖1所示，在相同提取條件下（料液比1∶20、乙醇濃度50%、提取溫度60 ℃、提取時(shí)間60 min）野火球超聲提取物中總黃酮含量高于熱回流提取法和索氏提取法，這可能是由于超聲波具有機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)等作用，可以增大介質(zhì)分子的運(yùn)動(dòng)速度同時(shí)也增強(qiáng)了介質(zhì)的穿透力，所以加速了野火球中總黃酮的擴(kuò)散和溶解，同時(shí)也減少了其他雜質(zhì)成分的溶出量[9]。熱回流提取法和索氏提取法的提取率低于超聲提取法，因此，選取超聲提取法提取野火球中總黃酮成分，并采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲提取的最佳提取工藝。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對(duì)野火球總黃酮提取率的影響。

由圖2可知，隨著乙醇濃度增加野火球總黃酮的提取率有所提高，當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)，野火球總黃酮的提取率達(dá)到最大值，但是之后隨著乙醇濃度的增大野火球總黃酮的提取率逐漸減小。這可能是因?yàn)殡S著乙醇濃度的增大，材料細(xì)胞的溶脹性增強(qiáng)，乙醇溶液向細(xì)胞內(nèi)部滲透增強(qiáng)，有效地增大了黃酮的溶出量，當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增大，溶劑極性越來越低，具有親水性的黃酮溶出量減少，野火球總黃酮提取率下降[15]。因此，在其他條件確定時(shí)乙醇最佳濃度為50%，并且選取乙醇濃度30%、50%和70%作為正交試驗(yàn)的條件。

2.2.2 超聲時(shí)間對(duì)野火球總黃酮提取率的影響。

由圖3可知，在超聲時(shí)間逐漸增加的過程中，野火球總黃酮的提取率呈現(xiàn)出逐漸增大的趨勢，并且當(dāng)超聲時(shí)間為60 min時(shí)，野火球總黃酮的提取率達(dá)到最大值，之后有減小的趨勢，這可能是因?yàn)楫?dāng)超聲時(shí)間達(dá)到60 min時(shí)大部分黃酮類物質(zhì)已溶出，當(dāng)超聲時(shí)間繼續(xù)延長時(shí)，有可能溶出了其他雜質(zhì)或分解了部分黃酮類物質(zhì)，導(dǎo)致野火球總黃酮提取率下降[9]。因此，在其他條件確定的情況下，最合適的超聲時(shí)間為60 min，并且選取超聲時(shí)間45、60和75 min作為正交試驗(yàn)的條件。

2.2.3 料液比對(duì)野火球總黃酮提取率的影響。

由圖4可知，在料液比逐漸增大的過程中，野火球總黃酮的提取率逐漸減小，當(dāng)料液比為1∶10時(shí)，野火球總黃酮的提取率達(dá)到最大值，之后穩(wěn)定減小至基本不變，這可能是因?yàn)樵诹弦罕?∶10時(shí)，黃酮類成分已基本溶出，繼續(xù)增加溶劑用量反而促使其他雜質(zhì)的溶出，導(dǎo)致野火球總黃酮的提取率減小[12]?？紤]到節(jié)約成本和后續(xù)回收操作，因此在其他條件確定的情況下，最佳料液比為1∶10，并且選取料液比1∶10、1∶15和1∶20作為正交試驗(yàn)的條件。

2.2.4 超聲功率對(duì)野火球總黃酮提取率的影響。

由圖5可知，在超聲功率逐漸增加的過程中，野火球總黃酮提取率呈現(xiàn)出逐漸增大的趨勢，當(dāng)超聲功率增加到350 W時(shí)，野火球總黃酮提取率達(dá)到最大值，之后有減小的趨勢，這可能是由于超聲波的機(jī)械效應(yīng)和空化作用更容易使細(xì)胞膜被破壞，進(jìn)而使大部分存在于膜內(nèi)的黃酮類成分更容易溶出，當(dāng)超聲功率達(dá)到350 W時(shí)，隨著超聲功率的增大，分子之間的運(yùn)動(dòng)更加劇烈，加強(qiáng)了黃酮類成分和其他成分之間的反應(yīng)，從而使黃酮類成分遭到破壞，導(dǎo)致野火球總黃酮的提取率減小[16]。因此在其他條件確定的情況下，最佳超聲功率為350 W，并且選取300、350和400 W作為正交試驗(yàn)的超聲功率。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2極差分析可知，影響野火球總黃酮提取率的4個(gè)因素從主到次順序?yàn)锳（乙醇濃度）、C（料液比）、B（超聲時(shí)間）、D（超聲功率）。方差分析結(jié)果表明，乙醇濃度對(duì)野火球總黃酮提取率的影響為極顯著，料液比對(duì)野火球總黃酮提取率的影響為顯著。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)得出最佳提取工藝條件組合為A2B3C3D2，即乙醇濃度50%，超聲時(shí)間75 min，料液比1∶20，超聲功率350 W。在上述條件下，超聲提取得到的野火球總黃酮提取率為1.686%。

2.4 野火球總黃酮抗氧化活性分析

2.4.1 DPPH自由基清除能力。

由圖6可知，3種不同的提取方法（熱回流提取法、索氏提取法和超聲提取法）得到的野火球提取物對(duì)DPPH自由基都有一定的清除效果，并且濃度在0.012 5～0.400 0 mg/mL，當(dāng)野火球提取物濃度逐漸增大時(shí)，其對(duì)DPPH自由基清除效果越明顯，可以看出二者具有一定的量效關(guān)系。當(dāng)濃度在0.400 0～0.800 0 mg/mL時(shí)，不同提取方法得到的提取物的清除率變化不大，且趨于一致。

熱回流、索氏提取和超聲提取得到的野火球提取物對(duì)DPPH自由基清除能力的IC50值分別為（0.207 7±0.010 3）、（0.253 1±0.012 7）、（0.318 6±0.015 9） mg/mL。由此可見，不同提取方法（熱回流提取法、索氏提取法和超聲提取法）獲得的野火球提取物對(duì)DPPH自由基清除能力從大到小依次為超聲提取物、索氏提取物、熱回流提取物，因此，超聲提取物對(duì)DPPH自由基具有較好的清除效果。

2.4.2 FRAP抗氧化能力。

FRAP作為一種檢測被測物質(zhì)抗氧化能力的簡單直接的常規(guī)方法被廣泛應(yīng)用。該研究采用FRAP法研究不同提取方法得到的野火球提取物的抗氧化活性。由圖7可知，3種提取方法得到的野火球提取物的抗氧化能力從大到小依次為超聲提取物、索氏提取物、熱回流提取物，表明超聲提取野火球中抗氧化活性成分的效果最好，索氏提取次之，熱回流提取最差。

3 結(jié)論

不同的提取方法影響野火球總黃酮成分的提取。試驗(yàn)以野火球?yàn)樵?，以野火球總黃酮提取率作為考察指標(biāo)，分別采用熱回流提取法、索氏提取法和超聲提取法提取野火球總黃酮。通過3種提取方法的比較得出超聲提取方法的提取率最高，并且其具有高效、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)勢。采用單因素試驗(yàn)及正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)優(yōu)化超聲提取野火球總黃酮的最優(yōu)工藝。野火球總黃酮超聲提取最優(yōu)工藝參數(shù)為：乙醇濃度50%，超聲時(shí)間75 min，料液比1∶20，超聲功率350 W。在上述條件下，超聲提取得到的野火球總黃酮的提取率為1.686%。

對(duì)野火球提取物的抗氧化活性的研究表明，超聲提取得到的提取物具有較熱回流提取法和索氏提取法更好的DPPH自由基的清除能力和FRAP抗氧化能力。試驗(yàn)結(jié)果為野火

球的進(jìn)一步開發(fā)和利用提供了理論依據(jù)。

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