王靜 張友青 陳燕茹

摘要 [目的]利用響應(yīng)面法優(yōu)化水酶法提取碧根果油的工藝。[方法]以碧根果為原料，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取料液比、酶添加量和pH為響應(yīng)因子，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析，建立數(shù)學(xué)模型，并得出水酶法提取碧根果油的最佳工藝條件。[結(jié)果]確定水酶法提取碧根果油的最佳工藝參數(shù)如下：烘烤溫度120 ℃，料液比1∶8（g∶mL）、堿性蛋白酶添加量2.05%、pH 12.15，酶解時間1.5 h，在此條件下碧根果油實際提取率為82.24%，與模型預(yù)測值相一致。[結(jié)論]該研究可為碧根果的綜合利用提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 碧根果油；提取率；水酶法；響應(yīng)面分析

中圖分類號 TS225.1+9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）28-0078-03

Abstract [Objective] The aqueous enzymatic extraction process of pecan oil was optimized by response surface methodology.[Method]Taking pecan as experiment material，based on singlefactor experiments，ratio of solid to liquid，enzyme amount and pH were chosen as the response factors，and extraction rate of oil was chosen as the response value.The mathematical model was established by the response surface analysis implemented by three factors and three levels，and the optimum technological conditions for extracting pecan oil were obtained.[Result]The optimal conditions were as follows：baking temperature 120 ℃，ratio of solid to liquid 1∶8（g∶mL），enzyme amount 2.05%，pH 12.15 and enzymolysis time 1.5 h.Under the above conditions，the actual extraction rate of oil was 82.24%，in agreement with the value predicted by the mathematical model.[Conclusion]The study can provide reference basis for comprehensive utilization of pecan.

Key words Pecan oil；Extraction rate；Aqueous enzymatic extraction；Response surface analysis

碧根果又名美國山核桃[Carya illinoensis （Wangenh.） K.Koch]、薄殼山核桃、長壽果，屬胡桃科山核桃屬，原產(chǎn)北美大陸的美國和墨西哥北部，是世界著名的優(yōu)質(zhì)干果[1-2]。碧根果果殼薄，出仁率高，果仁肥厚味美、無澀味，不僅可以鮮食還可榨取高級食用油和制作糕點、冰激凌等，其營養(yǎng)成分及風(fēng)味均優(yōu)于核桃、山核桃[3]。

水酶法主要在利用物理方式破碎的基礎(chǔ)上，通過酶（蛋白酶、淀粉酶、果膠酶、維生素酶等）的降解作用釋放細(xì)胞壁中包裹的油脂，然后利用非油成分對油和水的親和力差異將非油成分和油分離。與原始提取技術(shù)比較，水酶法具有綠色安全、投資少、能耗低、廢棄物易于利用和處理等優(yōu)點，在油脂工業(yè)中應(yīng)用前景十分廣闊[4-5]。李楊等[6]利用Alcalase 堿性蛋白酶提取松子油，總油提取率可達(dá)89.12%。李靜等[7]利用堿性蛋白酶提取牡丹籽中的油脂，出油率為23.25%。筆者采用堿性蛋白酶提取碧根果油，利用響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化工藝參數(shù)，旨在獲得一種綠色安全且提取率高的碧根果油提取工藝。

1 材料與方法

1.1 材料 供試碧根果采自浙江杭州余杭長樂林場。主要試劑：堿性蛋白酶（2×105 U/g），最適溫度45～55 ℃，最適pH 9.00～13.00，購自北京奧星博化學(xué)試劑有限公司； 其他試劑均為國產(chǎn)分析純。主要儀器設(shè)備：HWS-28型恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PHSJ-3F酸度計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；CT14RD高速冷凍離心機，上海天美科學(xué)儀器有限公司；AL204電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 水酶法提取碧根果油工藝流程。準(zhǔn)確稱取10.00 g碧根果仁，在一定溫度下烘烤0.5 h，粉碎，加入一定體積的蒸餾水，充分混勻，調(diào)節(jié)pH，加入一定量的堿性蛋白酶，置于50 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)酶解。酶解結(jié)束后，將溫度迅速升至100 ℃滅酶10 min，在4 200 r/min轉(zhuǎn)速下離心20 min，收集上層游離油脂，棄去乳狀液及水解液，用50 mL蒸餾水將殘渣洗滌，混勻，再次離心，收集上層游離油，將2次離心所得的游離油脂合并稱重，計算提取率。

提取率=（碧根果油質(zhì)量/碧根果脂肪含量）×100%

1.2.2 碧根果油脂肪含量測定方法。參照GB 5009.6—2016酸水解法測定。

1.2.3 堿性蛋白酶提取碧根果油的單因素及響應(yīng)面試驗。分析烘烤溫度、酶解時間、料液比、酶添加量、酶解pH 5個因素對碧根果油提取率的影響。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，進行Box-Behnken中心組合試驗，利用Design Expert 8.0進行響應(yīng)面分析，以獲得最佳工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 烘烤溫度對碧根果油提取率的影響。在酶解時間1.0 h，料液比1∶7（g∶mL），酶添加量為2.00%，酶解pH為12.00的條件下，分析不同烘烤溫度對碧根果油提取率的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，碧根果油提取率隨烘烤溫度升高快速上升，當(dāng)溫度達(dá)到120 ℃后，碧根果油提取率增長緩慢。因此確定水酶法提取碧根果油的最佳烘烤溫度為120 ℃。

2.1.2 酶解時間對碧根果油提取率的影響。在烘烤溫度為120 ℃，料液比1∶7（g∶mL），酶添加量為2.00%，酶解pH為12.00的條件下，分析不同酶解時間對碧根果油提取率的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著酶解時間的增加，碧根果油提取率呈快速上升趨勢，當(dāng)酶解時間達(dá)到1.5 h時，提取率達(dá)到最大值，為69.16%；但當(dāng)酶解時間超過1.5 h后，提取率呈緩慢增長趨勢。這可能是堿性蛋白酶與底物的反應(yīng)逐漸趨于完全的原因。隨著時間的延長，碧根果油中不飽和脂肪酸極易發(fā)生氧化，且生產(chǎn)成本也會增加，因此綜合考慮，確定最佳酶解時間為1.5 h。

2.1.3 料液比對碧根果油提取率的影響。在烘烤溫度為120 ℃，在酶解時間1.5 h，酶添加量為2.00%，酶解pH為12.00的條件下，分析不同料液比對碧根果油提取率的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，碧根果油的提取率隨著料液比中溶劑用量的增加快速上升，當(dāng)料液比中溶劑用量超過1∶8（g∶mL）后，提取率呈現(xiàn)下降趨勢。當(dāng)料液比中溶劑用量過低時，碧根果仁中大量油脂、蛋白質(zhì)導(dǎo)致碧根果仁漿料黏度較大，堿性蛋白酶與底物沒有完全接觸，不利于酶解的進行。當(dāng)料液比中溶劑用量過高，酶反應(yīng)體系中的酶濃度和底物濃度則會變得相對較低，影響堿性蛋白酶的反應(yīng)速率[8]。因此，確定最佳的料液比為1∶8（g/mL）。

2.1.4 酶添加量對碧根果油提取率的影響。在烘烤溫度為120 ℃，料液比1∶8（g∶mL），在酶解時間1.5 h，酶解pH為12.00的條件下，分析不同酶添加量對碧根果油提取率的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著堿性蛋白酶添加量的增加，碧根果油的提取率呈先上升后下降趨勢，當(dāng)堿性蛋白酶的添加量增加到2.00%時，提取率達(dá)到最大值，為81.24%?？赡苁怯捎谶^多的堿性蛋白酶會吸附在被粉碎的碧根果仁表面，使得油脂被包裹在其中無法釋放[9]。因此確定最佳的堿性蛋白酶添加量為2.00%。

2.1.5 酶解pH對碧根果油提取率的影響。在烘烤溫度為120 ℃，料液比1∶8（g∶mL），酶解時間1.5 h，酶添加量為2.00%的條件下，分析不同酶解pH對碧根果油提取率的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，隨著酶解pH的升高，碧根果油的提取率呈先上升后下降趨勢，酶解pH達(dá)到12.00時，碧根果油的提取率達(dá)到最大值，為81.21%。低酶解pH時，碧根果油提取率較低，可能是因為低pH環(huán)境中堿性蛋白酶的活性較弱，隨著酶解pH的上升，酶活增強，碧根果油的提取率開始逐漸增加。當(dāng)酶解pH繼續(xù)增加，堿性蛋白酶逐漸失去活性，酶解效果減弱，導(dǎo)致碧根果油提取率下降。因此，確定最佳酶解pH為12.00。

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果。

結(jié)合單因素試驗結(jié)果，選定烘烤溫度為120 ℃，酶解時間1.5 h，以料液比（A）、酶添加量（B）、酶解pH（C）3個因素作為響應(yīng)變量，碧根果油提取率為響應(yīng)值，采用3因素3水平的Box-Behnken中心組合試驗優(yōu)化工藝參數(shù)，具體因素和水平設(shè)計見表1，試驗設(shè)計方案和結(jié)果見表2。

2.2.2 模型的建立及顯著性分析。運用Design-Expert 8.0得到碧根果油提取率（Y）對自變量料液比（A）、酶添加量（B）、酶解時間pH（C）的二次多項回歸模型：Y=80.59+0.76A-0.60B+3.58C+0.03AB-5.75AC+9.77BC-2.64A2-7.27B2-14.20C2。

其中F回歸=87.24>F0.01（9，4）=14.66；P值<0.000 1，表明模型極顯著。F失擬項=0.560.05，表明失擬不顯著。該模型的修正相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.979 8，說明模型能解釋97.98%的響應(yīng)值變化。綜上所述，該模型的可信度和擬合度均很高，因此可用該模型回歸方程預(yù)測水酶法提取碧根果油的工藝條件。此外，pH的一次項、交互項、二次項、料液比和酶添加量的二次項均達(dá)到極顯著水平（P<0.01）。

2.2.3 響應(yīng)面分析與最優(yōu)工藝條件確定。響應(yīng)面分析及優(yōu)化模型中A、B、C交互作用對響應(yīng)值碧根果油提取率的影響如圖6、7、8所示。該組圖反映3個因素中任何2因素交互影響碧根果油提取率的效果。從圖6～8可以看出，提取率在試驗區(qū)域內(nèi)存在最大值，它隨著2個因素值的不斷升高而升高，達(dá)到最大值后又逐漸下降。

再對三維非線性回歸模型進行求一階偏導(dǎo)，并令其為零，得出提取率最優(yōu)的條件：A=0.00，B=0.10，C=0.15，轉(zhuǎn)化為實際參數(shù)，即料液比為1∶8（g∶mL），酶添加量為2.05%，pH為12.15，在此條件下碧根果油的提取率為80.84%，驗證值為82.24%，兩者相對偏差為0.86%<5%，說明該模型能夠較好地預(yù)測實際碧根果油提取率情況。

3 結(jié)論

該試驗選用Alcalase 堿性蛋白酶提取碧根果油，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選用料液比、酶添加量和pH作為研究對象，通過3因素3水平的Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化水酶法提取碧根果油最佳工藝條件，即烘烤溫度120 ℃，料液比為

1∶8（g∶mL），酶添加量為2.05%，pH為12.15，酶解時間1.5 h。

在此條件下，碧根果油的提取率可達(dá)到82.24%，與預(yù)測結(jié)果基本一致。

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