史慶玲 徐立新 閆瑾 肖琳琳

摘要[目的]采用TaqMan定量PCR技術(shù)檢測(cè)水稻中外源基因含量。[方法]采用TaqMan定量PCR技術(shù)以編碼磷脂酶D基因PLD為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻中外源TT51-1的含量。利用DNA梯度稀釋法分別求內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因PLD和TT51-1的Ct值與拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，并將得到的Ct值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求取樣品中外源基因的拷貝數(shù)。[結(jié)果]內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因PLD標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.403x+39.939，R2=0.993；TT51-1基因標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.35x+37.37，R2=0.991，轉(zhuǎn)基因含量為1.21%，不確定度為0.45。[結(jié)論]TaqMan定量PCR技術(shù)可以用于確定轉(zhuǎn)基因作物外源基因含量。

關(guān)鍵詞TaqMan定量PCR；轉(zhuǎn)基因；水稻；拷貝數(shù)

中圖分類號(hào)S188文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）23-0123-02

Detection of Foreign Gene Content in Transgenic Rice by TaqMan Quantitative PCR

SHI Qingling，XU Lixin，YAN Jin et al

（Seed Administrative Station of Henan， Zhengzhou，Henan 450046）

Abstract[Objective] Foreign gene content in transgenic rice was detected by TaqMan quantitative PCR.[Method]Taqman quantitative PCR technique was adopted to detect exogenous TT511 gene content in transgenic rice with PLD as endogenous reference gene. The method of gradient dilution was used to separately calculate Ct value of endogenous reference gene and relevance standard curve equation of logarithm of copies，and then to calculate the copies of samples through substituting thusobtained Ct into standard curve equation.[Result]The standard curve equation of endogenous reference gene was y = -3.403x + 39.939，R2=0.993； the standard curve equation of TT511 gene was y = -3.35x + 37.37，R2=0.991. The content of transgene was 1.21%，the uncertainty was 0.45. [Conclusion]TaqMan quantitative PCR technology can be used to determine the foreign gene content of transgenic crops.

Key wordsTaqMan quantitative PCR；Transgene；Rice；Copies

作者簡(jiǎn)介史慶玲（1983—），女，山西太谷人，農(nóng)藝師，博士，從事分子生物學(xué)研究。

收稿日期2017-05-10

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，水稻作為世界上主要的、消費(fèi)量最大的谷類作物，已成為植物基因工程研究的主要對(duì)象，建立一個(gè)精確有效的水稻轉(zhuǎn)基因定量檢測(cè)體系，對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻進(jìn)行監(jiān)管很有必要，這是一項(xiàng)艱巨長(zhǎng)遠(yuǎn)的任務(wù)[1]。依據(jù)歐盟轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)簽法規(guī)，植物轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品檢測(cè)分為3個(gè)步驟：篩選、鑒定和定量[2]。篩選是為了確定植物產(chǎn)品中是否有轉(zhuǎn)基因成分；鑒定是確定轉(zhuǎn)入外源基因的類型；定量是確定轉(zhuǎn)基因的含量。對(duì)于我國(guó)轉(zhuǎn)基因監(jiān)管工作人員來(lái)說(shuō)，他們不僅要知道農(nóng)作物是否為轉(zhuǎn)基因品種，轉(zhuǎn)了何種類型的基因，還要知道有多少外源基因。TaqMan實(shí)時(shí)定量PCR能夠精確地確定樣品轉(zhuǎn)基因成分含量，是目前有效的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品定量檢測(cè)方法[3]。

1材料與方法

1.1材料

轉(zhuǎn)基因水稻樣品是由農(nóng)業(yè)部科技發(fā)展中心提供的能力驗(yàn)證樣品，分別是轉(zhuǎn)基因成分含量為100%的標(biāo)準(zhǔn)樣品與待測(cè)樣品。

TaqMan熒光定量反應(yīng)試劑盒為Promega mix，實(shí)時(shí)熒光PCR的引物和探針由上海Invitrogen有限公司合成，引物和探針序列見表1。所用定量PCR儀為Bio-Red IQ5 。

1.2基因組DNA提取

標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品DNA利用康為世紀(jì)的DNA提取試劑盒來(lái)提取。標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA溶液經(jīng)NanoDrop1000測(cè)定后，用0.1×TE梯度稀釋。

1.3轉(zhuǎn)基因標(biāo)樣中內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和外源基因標(biāo)準(zhǔn)曲線的生成

外源基因TT51-1與內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因PLD引物和探針的合成依據(jù)農(nóng)業(yè)部2122號(hào)公告-8-2014。將標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA用01×TE依次稀釋為100、10、1、0.1、0.01 ng/μL 5個(gè)梯度，每個(gè)濃度3次重復(fù)。外源基因TT51-1的PCR反應(yīng)體系為25 μL，12.5 μL 2×TaqMan Mix，DNA模板2.0 μL，10 μmol/L的引物F、R及探針?lè)謩e加2.0、2.0、1.0 μL，無(wú)菌水補(bǔ)齊總體積。內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因PLD的PCR反應(yīng)體系為25 μL，12.5 μL 2×TaqMan Mix，DNA模板2.0 μL，10 μmol/L的引物FR及探針各加0.5 μL，無(wú)菌水補(bǔ)齊總體積。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 60 s，循環(huán)數(shù)45；在第二階段的退火延伸時(shí)段收集熒光信號(hào)。利用Bio-Red IQ5軟件生成內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因和外源基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4試樣中TT51-1轉(zhuǎn)化體含量的計(jì)算

采用相對(duì)定量的方法計(jì)算轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)，首先分別根據(jù)構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測(cè)樣品中轉(zhuǎn)基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的拷貝數(shù)，即根據(jù)每一個(gè)待測(cè)樣定量PCR檢測(cè)的Ct值和構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的拷貝數(shù)（表2）。計(jì)算拷貝數(shù)的公式如下：N=10（y-b）/a，其中N為拷貝數(shù)；a為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；b為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；y為待測(cè)樣的Ct值。

通過(guò)公式C=NTT51-1/NPLD×100%，即可算出待測(cè)樣品中轉(zhuǎn)化體的含量，其中NTT51-1為TT51-1轉(zhuǎn)化體的含量；NPLD為內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因PLD的拷貝數(shù)。通過(guò)公式計(jì)算擴(kuò)展不確定度U=2×0.048 12+（0.182 9×C）2。

2結(jié)果與分析

2.1試樣中外源基因及內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因拷貝數(shù)

轉(zhuǎn)基因和內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立是用定量PCR的方法分析轉(zhuǎn)基因植株中外源基因拷貝數(shù)的關(guān)鍵步驟[4]。在應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算外源基因或內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的拷貝數(shù)前，首先要確定建立的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線可靠、合理。根據(jù)實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)模型可知，PCR的擴(kuò)增效率E一般在0～1.0，但是普遍認(rèn)為最佳的標(biāo)準(zhǔn)曲線的PCR擴(kuò)增效率為0.9～1.1[5-6]。由圖1、2可知，內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因PLD的擴(kuò)增效率為96.7%，TT51-1的擴(kuò)增效率為98.9%，均滿足定量PCR的要求。內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線中R2為0.993，TT51-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線中R2為0.991，因此建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線適合用于轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的分析。

2.2待測(cè)樣中TT51-1轉(zhuǎn)化體含量及定量結(jié)果不確定度

利用標(biāo)準(zhǔn)樣品建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測(cè)樣品的Ct值，計(jì)算出待測(cè)樣品中內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因及轉(zhuǎn)化體TT51-1的拷貝數(shù)。結(jié)果表明，3次重復(fù)試驗(yàn)內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因PLD的拷貝數(shù)平均值為64390，轉(zhuǎn)化體TT51-1的拷貝數(shù)平均值為53 316.74。由此可知，轉(zhuǎn)化體TT51-1的含量為643.90/53 316.74×100%=121%。將計(jì)算結(jié)果代入不確定度的計(jì)算公式中，得到U為045。

3討論與結(jié)論

我國(guó)很早就關(guān)注轉(zhuǎn)基因作物的安全問(wèn)題，早在1993年12月，國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)就頒布了《基因工程安全管理辦法》。鑒于轉(zhuǎn)基因作物安全問(wèn)題的重要性，轉(zhuǎn)基因作物檢測(cè)人員需要掌握準(zhǔn)確高效的檢測(cè)方法。傳統(tǒng)的Southern Blot方法，雖然有準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)，但存在費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)，而且Southern Blot方法要利用同位素，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和實(shí)驗(yàn)室要求較高。TaqMan熒光定量PCR具有很高的靈敏度和非常好的動(dòng)力學(xué)檢測(cè)范圍，特異性的PCR反復(fù)進(jìn)行擴(kuò)增，儀器收集熒光信號(hào)，保證了熒光信號(hào)強(qiáng)度與探針和特異性片段的結(jié)合數(shù)呈正相關(guān)，這樣循環(huán)閾值就與PCR體系中起始DNA量的對(duì)數(shù)值之間有了嚴(yán)格的線性關(guān)系，因此根據(jù)樣品的循環(huán)閾值參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，可準(zhǔn)確計(jì)算出標(biāo)本內(nèi)核酸的起始濃度。采用基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)轉(zhuǎn)基因作物外源基因拷貝數(shù)進(jìn)行檢測(cè)，是確定轉(zhuǎn)基因作物外源基因含量的重要技術(shù)。

該研究通過(guò)建立水稻標(biāo)準(zhǔn)樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，選擇合適的斜率及相關(guān)系數(shù)并優(yōu)化TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系，對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻中外源TT51-1含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明TaqMan定量PCR技術(shù)可以用于確定轉(zhuǎn)基因作物外源基因含量。雖然TaqMan定量PCR技術(shù)是一種簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因作物拷貝數(shù)的計(jì)算方法，但是鑒于PCR技術(shù)的靈敏性，該方法需要合適的引物、探針。因此，在鑒定不同作物基因拷貝數(shù)的時(shí)候需要對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，并選擇合適的引物與探針。

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