汪超 譚韻雅 楊勝偉

摘要[目的]提高油樟內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物的積累。[方法] 將不同誘導(dǎo)子（油樟油水濁液、油樟葉水提液和油樟愈傷組織）添加到油樟內(nèi)生菌（YY26、YG42）的培養(yǎng)體系中，研究其對(duì)內(nèi)生菌生長(zhǎng)及其次生代謝產(chǎn)物（1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇、α-松油醇）的影響。[結(jié)果]從內(nèi)生菌生長(zhǎng)情況來看，油樟愈傷組織對(duì)內(nèi)生菌YY26的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，而對(duì)YG42的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用；油樟油水濁液對(duì)2種內(nèi)生菌的生長(zhǎng)都有一定的抑制作用；油樟葉水提液對(duì)2種內(nèi)生菌的生長(zhǎng)均無顯著影響。從次生代謝產(chǎn)物積累來看，油樟葉水提液對(duì)2種內(nèi)生菌產(chǎn)1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇及α-松油醇具有較強(qiáng)的促進(jìn)作用，且對(duì)1，8-桉葉油素的促進(jìn)作用最強(qiáng)。當(dāng)油樟葉水提液濃度為1.00%時(shí)，內(nèi)生菌YY26的1，8-桉葉油素產(chǎn)量最高，比對(duì)照組提高了11.80倍；當(dāng)油樟葉水提液濃度為2.50%時(shí)，內(nèi)生菌YG42中的1，8-桉葉油素產(chǎn)量達(dá)到最大值，與對(duì)照組相比增加了7.73倍。油樟愈傷組織對(duì)總揮發(fā)性物質(zhì)的促進(jìn)作用最強(qiáng)，當(dāng)其濃度為10.00%時(shí)，對(duì)內(nèi)生菌YY26總揮發(fā)性物質(zhì)的促進(jìn)作用最強(qiáng)，比對(duì)照組提高了13.26倍。[結(jié)論]該研究在一定程度上提高了油樟內(nèi)生菌（YY26、YG42）次生代謝產(chǎn)物的積累量，為其今后的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞油樟；內(nèi)生菌；1，8-桉葉油素；松油烯-4-醇；α-松油醇

中圖分類號(hào)Q942文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）20-0014-04

Abstract[Objective] To improve the accumulation of secondary metabolites of endophytic fungi of Cinnamomum longepaniculatum. [Method] Different inducers（oil， water extract and callus from C. longepaniculatum，were added in the culture system of endophytic fungi（YY26，YG42）of C. longepaniculatum to study their effects on the growth of endophytic fungi and their secondary metabolites（1，8eucalyptol， terpinen4ol， αterpineol）. [Result] As for the growth of endophytic fungi， callus from C. longepaniculatum had obvious inhibitory effects on the growth of YY26，but it had promoting effects on the growth of YG42. Oil from C. longepaniculatum had some inhibiting effects on the growth of YY26 and YG42. Water extracts from C.longepaniculatum had no significant effect on the growth of YY26 and YG42. As for the accumulation of secondary metabolites，water extract from C.longepaniculatum had stronger promoting effects on the yield of 1，8 cineole， terpinen4ol and αterpineol of YY26 and YG42， and it had the strongest promoting effects on the yield of 1，8 cineole.When the concentration of water extract was 1.00%，the yield of 1，8cineole of YY26 was the highest， which was increased than that of control group by 11.80 times. When the concentration of water extract was 2.50%， the yield of 1，8cineole of YG42 was the highest， which was increased than that of control group by 7.73 times.Callus from C.longepaniculatum had the strongest promoting effects on total volatile of secondary metabolites. When the concentration of callus from C.longepaniculatum was 10.00%，it had the strongest promoting effects on total volatile substances of YY26， which was increased than that of control group by 13.26 times. [Conclusion]The accumulation amount of secondary metabolites of YY26 and YG42 in C.longepaniculatum were improved， which can lay a foundation for its industrialized production in the future .

Key wordsCinnamomum longepaniculatum；Endophytic fungi；1，8cineole；Terpinen4ol；αterpineol

植物內(nèi)生菌在長(zhǎng)期的進(jìn)化過程中，與宿主細(xì)胞形成了互利共生的友好關(guān)系。目前，有關(guān)內(nèi)生菌生物學(xué)作用的研究報(bào)道逐年增多，尤其是關(guān)于內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物積累的研究已成為熱點(diǎn)[1-2]。從植物中直接分離的內(nèi)生菌，其次級(jí)代謝產(chǎn)物的含量目前普遍偏低，工業(yè)化批量生產(chǎn)困難[3-4]。因此，提高植物體內(nèi)內(nèi)生菌中的次級(jí)代謝產(chǎn)物顯得尤為重要。目前，提高植物體內(nèi)內(nèi)生菌中的次級(jí)代謝產(chǎn)物的方法很多，其中將生物因子（前體物質(zhì)）作為誘導(dǎo)子來影響代謝產(chǎn)物的積累，是一種有效且易操作的方法[5-6]。

宿主細(xì)胞與內(nèi)生菌之間存在物質(zhì)交換，因此宿主植物細(xì)胞中可能存在促進(jìn)內(nèi)生菌產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的前體物質(zhì)。從宿主植物細(xì)胞中提取相關(guān)的代謝物，并將其作為誘導(dǎo)子添加到內(nèi)生菌的培養(yǎng)體系中，可能會(huì)促進(jìn)內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的積累。筆者在油樟內(nèi)生菌（YY26、YG42）培養(yǎng)體系中添加不同誘導(dǎo)子（油樟油、油樟水提液及油樟愈傷組織），研究其對(duì)內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物的影響，旨在提高內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

①3種誘導(dǎo)子：油樟油水濁液、油樟葉水提液及油樟愈傷組織。②2種油樟內(nèi)生菌：YY26[從油樟葉中分離的真菌，編號(hào)為26，鑒定為子囊菌綱酵母目?jī)?nèi)孢霉科擬內(nèi)孢霉屬（Endomycopsis Dekker）]和YG42[從油樟根中分離的真菌，編號(hào)為42，鑒定為半知菌類從孢梗目從孢?？葡〗z頭孢霉屬（Haplotrichum LK.ex Fr.）][7]，由宜賓學(xué)院發(fā)酵資源與應(yīng)用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇及α-松油醇均購(gòu)自北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司。

1.2培養(yǎng)基

①平板培養(yǎng)基（1 L）：麥芽浸膏20 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，瓊脂20 g，pH 5.0。②發(fā)酵培養(yǎng)基（1 L）：麥芽浸膏20 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，pH 5.0。

1.33種誘導(dǎo)子的制備

1.3.1油樟油水濁液誘導(dǎo)子的制備。采摘新鮮的油樟葉，洗凈后剪碎，放入燒瓶中，水蒸氣蒸餾4 h。先用乙醚萃取，再用旋蒸儀濃縮。用無水硫酸鈉干燥，得到油樟葉揮發(fā)油。然后配制乳化劑，將吐溫-80和斯盤-80按體積比 7∶3混合均勻，置于60 ℃水浴鍋中充分?jǐn)嚢?。此混合乳化劑的HLB（親水親油平衡值）值為12.0（水包油乳化劑）。最后，將油樟葉揮發(fā)油與乳化劑按體積比1∶5混合，倒入研缽中，沿同一個(gè)方向充分研磨（約1 min），再加入水，研磨并過濾，滅菌備用。

1.3.2油樟葉水提液誘導(dǎo)子的制備。將新鮮的油樟葉片洗凈并晾干，取40 g置于打漿機(jī)中，添加一定的蒸餾水打磨2 min，過濾后得到水提液，滅菌備用。

1.3.3

油樟愈傷組織誘導(dǎo)子的制備。取培養(yǎng)20 d后新鮮的油樟愈傷組織（培養(yǎng)條件為 B5+0.5 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA+3.0%蔗糖+0.7%瓊脂，pH 5.8，25 ℃），置于研缽中充分研磨，得到油樟愈傷組織誘導(dǎo)子。

1.4孢子懸液的制備

將YG42、YY26內(nèi)生菌分別接種于平板培養(yǎng)基上，28 ℃下培養(yǎng)4 d，然后用無菌水洗滌平板，得到孢子菌懸液，并稀釋其濃度至107個(gè)/mL。

1.51，8-桉葉油素、松油烯-4-醇和α-松油醇3種物質(zhì)混合標(biāo)樣的制備與檢測(cè)

分別稱取1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇和α-松油醇各0.5 g，置于容量瓶中，用乙醇將其配制成濃度10 g/L的3種標(biāo)準(zhǔn)溶液?；旌蠘?biāo)樣的配制，則用超純水將其稀釋為0.01 mg/L。將細(xì)胞發(fā)酵液和混合標(biāo)樣分別頂空進(jìn)樣，采用氣相色譜（GC）檢測(cè)。

氣相色譜檢測(cè)條件如下：HP-5（30 m×320 μm×0.25 μm）毛細(xì)管柱，平衡溫度95 ℃，平衡時(shí)間20 min；載氣為氮?dú)猓瑲錃饬魉?0 mL/min，空氣流速400 mL/min，氮?dú)馕泊禋?5 mL/min，頂空進(jìn)樣，分流比3.0。柱箱程序如下：90 ℃保持4 min，然后以20 ℃/min增至130 ℃保持5 min，再以 20 ℃/min 增至190 ℃保持1 min，最后20 ℃/min增至240 ℃保持1 min。

1.6生物量的測(cè)定將細(xì)胞培養(yǎng)物抽濾得到細(xì)胞，置于烘箱中45 ℃干燥至恒重，稱其質(zhì)量為細(xì)胞干重。

1.7誘導(dǎo)子的添加

在2種孢子懸液中分別添加不同濃度的誘導(dǎo)子（油樟油水濁液、油樟葉水提液和油樟愈傷組織），在最適培養(yǎng)條件下發(fā)酵后，取樣并檢測(cè)其生物量及次級(jí)代謝產(chǎn)物（1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇、α-松油醇及總揮發(fā)性物質(zhì)）的積累量，分析3種誘導(dǎo)子對(duì)次生代謝產(chǎn)物積累的影響。由于總揮發(fā)性物質(zhì)無法用標(biāo)品定量，因此所有產(chǎn)物均用峰面積表示積累量。

1.8精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)

取配制的0.01 mg/L混合標(biāo)樣10 mL置于頂空進(jìn)樣瓶中，按照“1.5”中方法重復(fù)進(jìn)樣5次，計(jì)算1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇、α-松油醇及總揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積RSD分別為1.62%、1.83%、1.71%、1.59%；取同一供試品在同一天內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣5次，并連續(xù)進(jìn)樣3 d，計(jì)算1，8-桉葉油素、γ-松油烯、α-松油醇及總揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積RSD分別為1.96%、1.69%、1.38%、1.82%。

1.9回收率試驗(yàn)

取“1.5”中配制的10 g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液，以超純水為溶劑，配制成濃度分別為1.0、0.5、0.1 mg/L的混合標(biāo)樣，分別取5 mL置于頂空進(jìn)樣瓶中，再分別加入5 mL已測(cè)樣品，按照“1.5”中方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算出1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇、α-松油醇及總揮發(fā)性物質(zhì)的峰面積的回收率分別為101.12%、99.89%、99.47%、100.43%，RSD分別為1.78%、1.92%、1.66%、1.44%。

2結(jié)果與分析

2.1樣品中揮發(fā)性成分鑒定結(jié)果

發(fā)酵液中揮發(fā)性成分鑒定結(jié)果見圖1。從圖1可以看出，1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇和α-松油醇的出峰時(shí)間分別為2.840、5.157和5.325 min。樣品（圖1B）與標(biāo)品（圖1A）的出峰時(shí)間相同，被認(rèn)為是與標(biāo)品相同的物質(zhì)。

2.2誘導(dǎo)子對(duì)內(nèi)生真菌生物量的影響

由表1可知，油樟愈傷組織對(duì)YG42的生物量具有促進(jìn)作用，且隨著其濃度的增加，促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)其濃度為10.00%時(shí)YG42的生物量比對(duì)照組增加了23.61%。油樟葉水提液對(duì)2種內(nèi)生菌均無顯著影響；油樟油水濁液誘導(dǎo)子對(duì)2種內(nèi)生菌均有一定的抑制作用，且隨著其濃度的增加，對(duì)內(nèi)生菌的抑制作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)油樟油水濁液濃度為10.00%時(shí)，YY26和YG42的生物量分別為對(duì)照組的71.12%和70.53%。油樟愈傷組織對(duì)YY26的生物量具有抑制作用，隨著其濃度的增加，抑制作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)其濃度為10.00%時(shí)，YY26的生物量?jī)H為對(duì)照組的31.10%。

2.3誘導(dǎo)子對(duì)內(nèi)生真菌1，8-桉葉油素的影響

由表2可知，油樟水提液對(duì)2種內(nèi)生菌的1，8-桉葉油素積累均具有促進(jìn)作用，其促進(jìn)作用呈先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)油樟水提液濃度為1.00%時(shí)，YY26的1，8-桉葉油素積累量最高，與對(duì)照組相比增加了11.80倍，當(dāng)油樟水提液濃度為2.50%時(shí)，YG42的1，8-桉葉油素積累量最高，與對(duì)照組相比增加了7.73倍。油樟油水濁液對(duì)2種內(nèi)生菌的1，8-桉葉油素積累均具有先促進(jìn)后抑制的作用，當(dāng)其濃度為0.25%時(shí)YY26和YG42的1，8-桉葉油素積累量最高，與對(duì)照組相比分別提高1.11和1.29倍。油樟愈傷組織對(duì)受試菌體的1，8-桉葉油素積累均呈抑制作用，且隨著濃度的增加其抑制作用逐漸增強(qiáng)，當(dāng)愈傷組織濃度為10.00%時(shí)，2種內(nèi)生菌的1，8-桉葉油素積累量最低，分別為對(duì)照組的45.12%和52.77%。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2017年

2.4誘導(dǎo)子對(duì)內(nèi)生真菌松油烯-4-醇的影響

由表3可知，油樟水提液均能促進(jìn)2種內(nèi)生菌松油烯-4-醇的產(chǎn)生，當(dāng)其濃度為1.00%時(shí)，2種內(nèi)生菌的松油烯-4-醇產(chǎn)量均達(dá)到最大值，分別為8.32和5.86。油樟愈傷組織能誘導(dǎo)內(nèi)生菌YY26松油烯-4-醇的產(chǎn)生，而對(duì)YG42內(nèi)生菌的積累松油烯-4-醇幾乎無影響，當(dāng)其濃度為1.00%時(shí)內(nèi)生菌YY26松油烯-4-醇的積累量達(dá)到最大值，為0.38。而油樟油水濁液對(duì)2種內(nèi)生菌的松油烯-4-醇積累均呈抑制作用，且濃度越大，抑制作用越強(qiáng)。

2.5誘導(dǎo)子對(duì)內(nèi)生真菌α-松油醇的影響

由表4可知，油樟愈傷組織誘導(dǎo)子對(duì)內(nèi)生菌YY26產(chǎn)α-松油醇具有一定的促進(jìn)作用，隨著其濃度的增加，促進(jìn)作用呈先強(qiáng)后弱的趨勢(shì)，當(dāng)其濃度為2.50%時(shí)內(nèi)生菌YY26中α-松油醇積累量達(dá)到最大值（0.5），而對(duì)內(nèi)生菌YG42中α-松油醇的積累量幾乎無影響。油樟水提液對(duì)2種內(nèi)生菌中α-松油醇的積累量均呈先促進(jìn)后抑制的作用，當(dāng)油樟水提液濃度為1.00%時(shí)對(duì)內(nèi)生菌YY26中α-松油醇積累量的促進(jìn)作用最強(qiáng)，此時(shí)α-松油醇積累量為3.96；當(dāng)油樟水提液濃度為0.50%時(shí)，對(duì)內(nèi)生菌YG42中α-松油醇積累的促進(jìn)作用最強(qiáng)，此時(shí)α-松油醇積累量為1.30。油樟水濁液對(duì)2種內(nèi)生菌中α-松油醇積累均具有抑制作用，且其濃度越大，抑制作用越強(qiáng)。

2.6誘導(dǎo)子對(duì)內(nèi)生真菌總揮發(fā)性物質(zhì)的影響

從表5可以看出，3種誘導(dǎo)子對(duì)內(nèi)生菌的總揮發(fā)性物質(zhì)的影響程度各不相同。油樟愈傷組織對(duì)內(nèi)生菌YY26的總揮發(fā)性物質(zhì)積累表現(xiàn)出誘導(dǎo)作用，而對(duì)內(nèi)生菌YG42的總揮發(fā)性物質(zhì)積累無顯著影響，且隨著濃度的增加，其促進(jìn)作用越強(qiáng)，當(dāng)濃度為10.00%時(shí)其促進(jìn)作用最強(qiáng)，與對(duì)照組相比提高了13.26倍。油樟水提液對(duì)內(nèi)生菌YY26中總揮發(fā)性物質(zhì)的積累具有先促進(jìn)后抑制的作用，當(dāng)其濃度為1.00%時(shí)其促進(jìn)作用最強(qiáng)，與對(duì)照組相比提高了0.87倍；對(duì)內(nèi)生菌YG42中總揮發(fā)性物質(zhì)的積累具有抑制作用，且隨著濃度的增加，其抑制作用越強(qiáng)。油樟油對(duì)2種內(nèi)生菌的總揮發(fā)性物質(zhì)積累均具有抑制作用，且濃度越大，抑制作用越強(qiáng)，與之前研究結(jié)果基本一致。

3結(jié)論與討論

向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)子是促進(jìn)次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量常用的方法。該試驗(yàn)結(jié)果表明，油樟油誘導(dǎo)子在低濃度時(shí)對(duì)2種內(nèi)生菌的1，8-桉葉油素產(chǎn)量均具有誘導(dǎo)作用，而在高濃度下卻對(duì)其具有抑制作用，考慮到油樟油中本身就含有大量的1，8-桉葉油素，據(jù)此推測(cè)可能是外源1.8-桉葉油素對(duì)2種內(nèi)生菌產(chǎn)1，8-桉葉油素的相關(guān)基因的表達(dá)存在調(diào)節(jié)作用。Expósito等[8]研究表明外源紫杉醇誘導(dǎo)子對(duì)紫杉醇相關(guān)基因的表達(dá)存在調(diào)控作用。在高濃度時(shí)油樟油對(duì)2種內(nèi)生菌的生長(zhǎng)具有一定的抑制作用，可能是因?yàn)橛驼劣椭斜旧碛休p微的毒性[9-10]；在高濃度下油樟油對(duì)2種內(nèi)生菌中揮發(fā)性物質(zhì)的積累均有抑制作用，可能是由于油樟油本身具有揮發(fā)性，在充滿菌絲體的培養(yǎng)基中產(chǎn)生渦旋作用，使其揮發(fā)速度比對(duì)照組快，也可能是被內(nèi)生菌轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，具體還有待進(jìn)一步研究。

油樟水提液對(duì)2種內(nèi)生菌的1，8-桉葉油素、松油烯-4-醇和α-松油烯的積累均具有明顯的促進(jìn)作用，表明油樟水提液中可能含有某些能促進(jìn)1，8-桉葉油素等生產(chǎn)的物質(zhì)，這些物質(zhì)能夠誘導(dǎo)1，8-桉葉油素等物質(zhì)生物合成相關(guān)基因的表達(dá)。吳欣[6]在滑桃樹種子提取物對(duì)其內(nèi)生菌Streptomyces sp.WXC 菌株中富倫菌素B產(chǎn)量的影響研究中，證實(shí)滑桃樹種子提取物作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)了活性化合物富倫菌素B生物合成基因的表達(dá)，進(jìn)而提高了富倫菌素B的產(chǎn)量，但具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

油樟愈傷組織對(duì)油樟內(nèi)生真菌YY26的生長(zhǎng)具有抑制作用，但卻促進(jìn)了其次生代謝產(chǎn)物的生成，表明在逆境的情況下有利于內(nèi)生菌產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物。對(duì)YG42的生長(zhǎng)卻具有促進(jìn)作用，表明油樟愈傷組織中會(huì)產(chǎn)生一些物質(zhì)對(duì)YY26的生長(zhǎng)有抑制作用，而其中的一些物質(zhì)又能夠?yàn)閅G42提供生長(zhǎng)的必要因子，促進(jìn)YG42的生長(zhǎng)，但對(duì)其次生代謝產(chǎn)物的積累卻無顯著影響，可能是由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)都用于細(xì)胞生長(zhǎng)，而1，8-桉葉油素等物質(zhì)的基因缺乏表達(dá)。

綜上所述，培養(yǎng)基中的營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)油樟內(nèi)生真菌中次生代謝產(chǎn)物積累的影響較大。從油樟水提液與油樟愈傷組織的不同誘導(dǎo)效果來看，1，8-桉葉油素等物質(zhì)的生物合成受許多因素的影響，油樟水提液中含有細(xì)胞組織液及其他油樟內(nèi)生菌所產(chǎn)物質(zhì)比油樟愈傷組織中所含物質(zhì)豐富。因此，在今后的研究中應(yīng)加強(qiáng)對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分的優(yōu)化，還可嘗試多種內(nèi)生菌共培養(yǎng)的發(fā)酵方式。該研究提高了油樟內(nèi)生真菌YY26和YG42的次生代謝產(chǎn)物的積累量，為其今后的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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