楊楠　王靜　余友恒

摘要[目的]探究生姜的活性提取物對銅綠假單胞菌抑制作用的機理。[方法]采用有機溶劑浸提法提取生姜中的活性物質(zhì)，探討生姜在不同條件下的活性提取物對銅綠假單胞菌的抑制效果及抑菌機理。[結(jié)果]生姜提取物對銅綠假單胞菌有明顯的抑制作用，且生姜提取物的穩(wěn)定性較好，不同因素處理下仍具有較強的抑菌性。通過對微生物的生長曲線和電導(dǎo)率的測定，進一步證明生姜的活性提取物抑制了銅綠假單胞菌的生長。[結(jié)論]生姜的活性提取物對銅綠假單胞菌有較好的抑制作用。

關(guān)鍵詞生姜；活性提取物；銅綠假單胞菌；抑菌作用；機理

中圖分類號S632.5文獻標(biāo)識碼

A文章編號0517-6611（2017）20-0095-03

Abstract[Objective] The research aimed to study the mechanism of the inhibitory effect of the active extract of Zingiber officinale Roscoe on Pseudomonas aeruginosa. [Method] The effective components of Zingiber officinale Roscoe were extracted by organic solvent extraction，the antibacterial activities and mechanism of Zingiber officinale Roscoe against Pseudomonas aeruginosa in different condition were discussed.[Result]The active extract of Zingiber officinale Roscoe had obvious inhibitory effect on Pseudomonas aeruginosa，and the stability of extract was good.The inhibitory effects of Zingiber officinale Roscoe still had a strong antiseptic power after various treatments.Through the determination of bacterial growth curve and electric conductivity， it was further proved that the active extract of Zingiber officinale Roscoe inhibited the growth of Pseudomonas aeruginosa.[Conclusion] Zingiber officinale Roscoe had better antibacterial effect on Pseudomonas aeruginosa.

Key wordsZingiber officinale Roscoe； Active extracts；Pseudomonas aeruginosa；Antimicrobial activity；Mechanism

姜是姜科植物姜（Zingiber officinale Roscoe）的根莖，是日常生活中常見的香辛調(diào)味料。生姜是一種廣泛應(yīng)用的藥食兩用植物，作為傳統(tǒng)中藥廣泛應(yīng)用于臨床。現(xiàn)代研究表明，生姜具有抗氧化、抗炎、保護心血管、降血糖、降低膽固醇以及抗腫瘤的作用[1]。對于生姜的化學(xué)成分研究已有報道[2-5]，姜的化學(xué)成分復(fù)雜，已發(fā)現(xiàn)的有100多種，可歸屬為揮發(fā)油、姜辣素、二苯基庚烷三大類。姜辣素和二苯基庚烷具有較強的防腐及抗氧化作用，有研究表明，生姜提取物對多種微生物有明顯抑制作用[6-8]。這些研究對于食品行業(yè)中天然防腐劑的開發(fā)具有重要意義。筆者以水產(chǎn)品中典型的腐敗菌銅綠假單胞菌為檢驗對象，通過測定不同溫度、有機試劑及pH對生姜提取物穩(wěn)定性的影響來探討生姜抑菌作用的穩(wěn)定性，并通過測定生姜提取物處理過的銅綠假單胞菌前后的生長曲線及電導(dǎo)率來初探生姜提取物的抑菌機理。

1材料與方法

1.1材料與試劑

生姜（新鮮生姜購于遼寧大連市場）；銅綠假單胞菌（來自大連民族大學(xué)食品安全實驗室）；牛肉膏、蛋白胨、瓊脂，均為生化試劑；NaCl（AR級）、HCl（AR級）、NaOH（AR級）、無水乙醇（AR級）、甲醇（AR級）、丙酮（AR級）、乙腈（AR級）。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基按參考文獻[9]自制。

1.2儀器與設(shè)備

CJ-1680超凈工作臺、HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋、JA-2003型電子天平、ZK-027型恒溫干燥箱、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、XA-1型高速萬能粉碎機、恒溫培養(yǎng)箱、立式壓力蒸汽滅菌器、UV-2550紫外分光光度計、搖床以及實驗室其他常規(guī)儀器。

1.3試驗方法

1.3.1生姜活性物質(zhì)的提取。

生姜，洗凈，用刀切成5 mm左右薄片，放入恒溫干燥箱中。在80 ℃下烘干6～8 h，再用高速萬能粉碎機將姜粉碎。參考范紫煊[10]的方法，稱取100 g 姜粉，以1∶2∶8的比例放入姜粉、無水乙醇和無菌水進行浸泡，充分攪勻，置于水浴鍋上，溫度為50 ℃，浸泡6 h以上。浸泡后，趁熱緩慢分離出上清液，進行抽濾。將抽濾液裝入圓底燒瓶，并連接好減壓回收裝置，將圓底燒瓶置于恒溫水浴鍋中，減壓回收乙醇。最初瓶內(nèi)劇烈沸騰，等到蒸餾緩慢進行，冷凝液也漸漸減少，則停止加熱，取下圓底燒瓶。將生姜提取物用保鮮膜包裹，防止其成分的揮發(fā)。

1.3.2抑菌效力試驗。采用牛津杯法[11]，即將適量銅綠假單胞菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，過夜振搖培養(yǎng)（37 ℃，100 r/min）；再將50 μL過夜培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，振搖培養(yǎng)（37 ℃，100 r/min）6 h，得到銅綠假單胞菌。

融化后的牛肉膏蛋白胨營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，冷卻凝固后加入菌懸液，用玻璃涂布棒均勻涂在培養(yǎng)基表面，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)15 min，使瓊脂表面干燥待用。用無菌鑷子將牛津杯（直徑9 mm）置于含菌培養(yǎng)皿（每個培養(yǎng)皿內(nèi)2個牛津杯）中，每個牛津杯內(nèi)加樣150 μL，以生理鹽水（以CK表示）為陰性對照。將培養(yǎng)皿置于37 ℃培養(yǎng)24 h，取出后測其抑菌圈直徑大小。以上操作均在無菌條件下進行。

1.3.3不同濃度生姜活性提取物對抑菌效果的影響。

根據(jù)抑菌圈測定結(jié)果，采用瓊脂打孔法測定樣品MIC。于超凈工作臺內(nèi)，向每個滅菌培養(yǎng)皿中傾注10～15 mL的高壓滅菌過的牛肉膏蛋白胨進行鋪底，每個培養(yǎng)皿厚度均勻，待瓊脂冷卻凝固后，備用。吸取200～300 μL銅綠假單胞菌菌液加入到冷卻后的培養(yǎng)基中，用鑷子夾取牛津杯放在制好的抑菌圈培養(yǎng)皿內(nèi)，并在培養(yǎng)皿上做好標(biāo)記。每個牛津杯內(nèi)分別加樣150 μL，同時設(shè)立滅菌水為空白對照。將培養(yǎng)皿移入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在接下來的6～12 h內(nèi)觀察菌體的生長情況。重復(fù)3個平板。

1.3.4熱穩(wěn)定性試驗。

將質(zhì)量濃度為2.00%的生姜活性提取物溶液分成不同的組分，在20、40、60、80、100和120 ℃ 6個水浴溫度下處理20 min，采用牛津杯法觀察溫度對生姜活性提取物抑菌活性的影響。重復(fù)3個平板。

1.3.5不同有機試劑對生姜活性提取物抑菌效果的影響。

分別用甲醇、丙酮、乙腈和乙醇處理質(zhì)量濃度為2.00%的生姜活性提取物溶液1 h，同樣采用牛津杯法觀察不同有機試劑對生姜活性提取物抑菌活性的影響。重復(fù)3個平板。

1.3.6不同pH對生姜活性提取物抑菌效果的影響。

將質(zhì)量濃度為2.00%的生姜活性提取物溶液分成不同的組分，用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)配成6個pH區(qū)間（3～4、4～5、5～6、6～7、7～8和8～9），采用牛津杯法觀察pH對生姜活性提取物抑菌活性的影響。重復(fù)3個平板。

1.3.7細菌生長曲線。

將適量銅綠假單胞菌接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，過夜振搖培養(yǎng)（37 ℃，160 r/min）。再將50 μL過夜培養(yǎng)物接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，振搖培養(yǎng)（37 ℃，100 r/min）12 h，得到銅綠假單胞菌。取少量假單胞菌過夜培養(yǎng)至對數(shù)期，加入生姜提取物使其終濃度為2%，于30 ℃、160 r/min搖床振搖培養(yǎng)。于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h分別取樣，在600 nm處測定其吸光值。

1.3.8菌液電導(dǎo)率的測定。

取少量培養(yǎng)至對數(shù)期的銅綠假單胞菌，向其中加入生姜提取物使其濃度為2.00%，于37 ℃、160 r/min搖床振搖培養(yǎng)。參考李婷婷等[12]的方法，在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h分別取樣測定培養(yǎng)液的電導(dǎo)率，確定金屬離子滲出的變化趨勢。

2結(jié)果與分析

2.1抑菌效力試驗試驗結(jié)果表明，生姜提取物對銅綠假單胞菌有很強的抑制作用。當(dāng)生姜提取物質(zhì)量濃度高于0.25%時，對銅綠假單胞菌有抑菌效果，生姜提取物質(zhì)量濃度為0.25%～2.00%時，抑菌圈直徑逐漸增大；當(dāng)生姜提取物質(zhì)量濃度為4.00%時，其抑菌效果最明顯，抑菌圈直徑為20.3 mm。

2.2熱穩(wěn)定性試驗

由圖1可知，生姜的活性提取物經(jīng)6種溫度處理15 min后，抑菌效力并未受較大影響。與常溫對照組相比，40 ℃的抑菌圈達到最大，表明此溫度下的抑菌效力最好。而隨著溫度的升高，抑菌圈有不同程度的減小，溫度為120 ℃時，抑菌效力最差。60～120 ℃各個溫度條件下抑菌圈直徑無明顯變化，可見不同溫度對生姜活性提取物的處理不影響其中有效成分的抑菌活性。說明生姜活性提取物的熱穩(wěn)定性較好。

2.3有機試劑對生姜提取物抑菌效力的影響

由圖2可知，分別經(jīng)甲醇、丙酮、乙腈和乙醇處理過的生姜活性提取物，除乙醇處理后抑菌圈增大較多，其余3種有機溶劑的抑菌效力均比較穩(wěn)定?？梢?，生姜提取物不受有機試劑的影響，穩(wěn)定性良好。

2.4pH對生姜提取物抑菌效力的影響由試驗結(jié)果可知，當(dāng)pH在5～6、6～7、7～8、8～9，生姜活性提取物的抑菌能力具有一定的穩(wěn)定性，抑菌圈直徑保持在14.9～15.3 mm；而在酸性（pH為3.0）條件下，抑菌效力達到最大，抑菌圈直徑達15.9 mm，但不排除因過酸條件下鹽酸抑制銅綠假單胞菌的生長。

2.5細菌生長曲線

菌液的光密度值（OD值）可以用來衡量菌液中細菌數(shù)目的多少，且菌懸液的濃度與其吸光值成正比。因此，OD值變化可以反映生姜提取物對銅綠假單胞菌的抑制作用。由圖3可知，經(jīng)生姜提取物處理的試驗組的細菌生長曲線與正常培養(yǎng)的對照組存在明顯差異；且對照組中銅綠假單胞菌在12 h進入穩(wěn)定期，而生姜處理組因細菌受到抑制，其生長緩慢，在18 h才進入穩(wěn)定期，表明生姜提取物能有效抑制銅綠假單胞菌菌體生長繁殖。

2.6菌液電導(dǎo)率的測定

細菌細胞膜是細菌的保護屏障。當(dāng)細菌遇到不利生長條件或者抑菌劑作用時，細菌細胞膜會遭到破壞，喪失其半透性且流動性降低，進而菌體的保護屏障被打破，內(nèi)部電解質(zhì)（如K+）大量滲入至培養(yǎng)液，導(dǎo)致培養(yǎng)液的電導(dǎo)率的改變。因此，菌液電導(dǎo)率的變化反映了細菌細胞膜通透性的變化情況[13]。

由圖4可知，當(dāng)銅綠假單胞菌培養(yǎng)液經(jīng)生姜提取物處理過后，其電導(dǎo)率明顯高于未處理的對照組，說明在生姜活性提取物的存在下使細胞膜遭到破壞，導(dǎo)致細菌細胞膜流動性降低，通透性增大，從而大量電解質(zhì)外滲。

3結(jié)論與討論

該試驗采用有機溶劑浸提法提取生姜活性成分，并用涂布平板法來進行銅綠假單胞菌菌落的培養(yǎng)。試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，生姜活性提取物對銅綠假單胞菌有明顯的抑制作用，當(dāng)生姜提取物質(zhì)量濃度高于0.25%時，對銅綠假單胞菌有抑菌效果，而且經(jīng)溫度、有機試劑和pH等處理后仍具有抑菌效力，

表明生姜活性提取物具有較好的穩(wěn)定性。

生姜提取物對銅綠假單胞菌生長曲線的影響顯示，銅綠假單胞菌生長進入穩(wěn)定期時，對照組OD值明顯高于處理組OD值，且對照組中銅綠假單胞菌在12 h進入穩(wěn)定期，而生姜處理組因細菌受到抑制，生長緩慢，在18 h才進入穩(wěn)定期，表明生姜提取物對銅綠假單胞菌菌體生長繁殖有抑制作用。

菌液電導(dǎo)率的結(jié)果顯示，處理組經(jīng)生姜提取物處理過的銅綠假單胞菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率明顯高于未經(jīng)生姜提取物處理的對照組，說明生姜的活性提取物對細菌的細胞壁和細胞膜有破壞作用，使其通透性增大，大量電解質(zhì)外泄。

根據(jù)試驗結(jié)果初步得出，生姜活性提取物對銅綠假單胞菌有較強的抑制作用，并且穩(wěn)定性良好。生姜提取液可能通過破壞銅綠假單胞菌的細胞壁，改變細胞膜的通透性，從而抑制其繁殖。

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