單敏　李濤　何晶　李文?！⊥跣√m　羅榮廷　于圣青

摘要：[目的]了解鴨疫里默氏桿菌AS87-01740基因分子生物學(xué)特性，確定其編碼蛋白抗原性，為鴨疫里默氏桿菌亞單位疫苗研發(fā)提供新的靶標(biāo)抗原選擇。[方法]采用PCR克隆鴨疫里默氏桿菌AS87-01740基因，以DNASTAR和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分別進(jìn)行基因生物信息學(xué)分析；利用pCold-TF原核表達(dá)載體在大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并分別以SDS-PAGE和Westemblotting檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)形式及其抗原特異性。[結(jié)果]從鴨疫里默氏桿菌基因組擴(kuò)增獲得的AS87-017405因編碼框全長(zhǎng)618bp，編碼205個(gè)氨基酸，理論分子量約21.87kD，理論等電點(diǎn)（pI）8.2，正電荷氨基酸總數(shù)17個(gè)，負(fù)電荷氨基酸總數(shù)16個(gè)。AS87—01740蛋白序列在同種屬分離株中，與2型血清型分離株（11845、YM、GD和CH-2）有很高的相似性（>99%），與1型血清型分離株（cH一1和CH-3）的相似性為92%；在不同種屬中，與金黃桿菌（Chryseobacteriumsp.）、動(dòng)物潰瘍伯格菌（Bergeyellazoohelcum）和腦膜炎敗血伊麗莎白菌（Elizabeth-kingiameningosepticum）的相似性分別為61%、60%和57%。經(jīng)異丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)獲得的融合蛋白分子量約77kD，以可溶性表達(dá)形式為主。Westemblotting檢測(cè)結(jié)果表明，融合蛋白能與鴨疫里默氏桿菌陽(yáng)性血清發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。[結(jié)論]AS87-01740基因編碼蛋白在不同鴨疫里默氏桿菌分離株中具有很高的保守性，且能與其陽(yáng)性血清發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，是研發(fā)鴨疫里默氏桿菌疫苗的潛在抗原。

關(guān)鍵詞：鴨疫里默氏桿菌；AS87-01740基因；生物信息學(xué)；原核表達(dá)；免疫原性

中圖分類號(hào)：S852.612 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）11-2058-06

0引言

[研究意義]鴨疫里默氏桿菌（Riemerellaanatipes-tifer，RA）為革蘭氏陰性菌，隸屬于黃桿菌科（Flavo-bacteriaceae），主要引起鴨、火雞、鵝等禽類急性或慢性敗血癥，以2-3周齡禽類最易感，其臨床癥狀以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎和腦膜炎等炎癥為主，也有部分病鴨表現(xiàn)出神經(jīng)癥狀、干酪性輸卵管炎和生長(zhǎng)障礙（岳嘉蘋(píng)等，2014）。自1982年我國(guó)首次暴發(fā)鴨疫里默氏桿菌病以來(lái)，因其發(fā)病范圍廣、死亡率高，已成為危害養(yǎng)鴨產(chǎn)業(yè)的主要細(xì)菌性疾病之一，給我國(guó)養(yǎng)鴨業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失（郭玉璞等，1982；蘇敬良等，1999）。至今，國(guó)際上已報(bào)道的鴨疫里默氏桿菌共21種血清型（程安春等，2003），由于其血清型復(fù)雜，且各血清型問(wèn)幾乎無(wú)交叉免疫保護(hù)力，從而限制了滅活疫苗的推廣應(yīng)用。因此，尋找有效抗原蛋白研制鴨疫里默氏桿菌疫苗是保障養(yǎng)鴨產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的關(guān)鍵。[前人研究進(jìn)展]目前，文獻(xiàn)報(bào)道的鴨疫里默氏桿菌有效抗原主要有莢膜（含己糖胺）、外膜蛋白（Omp）、VapD蛋白、潛在表面蛋白（P45）和DNA復(fù)制蛋白等。蘇敬良等（1998）分別制備莢膜粗提物和經(jīng)苯酚抽提純化的莢膜產(chǎn)物，經(jīng)免疫接種試驗(yàn)證明，二者對(duì)鴨疫里默氏桿菌病的保護(hù)率分別為90%和70%，且前者抗體水平下降速度低于后者。Subra-manian等（2000）首次從鴨疫里默氏桿菌野毒株、ATCC株Omp蛋白中鑒定出保守且具有抗原性的外膜蛋白A（OmpA）。Huang等（2002）分別對(duì)血清15型鴨疫里默氏桿菌的OmpA基因和血清19型鴨疫里默氏桿菌表面蛋白進(jìn)行原核表達(dá)，經(jīng)ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)這兩種重組蛋白均具有一定的免疫原性。Hu等（2011）通過(guò)自殺性質(zhì)粒同源重組的方法構(gòu)建缺失OmpA基因的血清1型鴨疫里默氏桿菌CH3AOmpA株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該缺失株的粘附入侵能力明顯降低，故推斷OmpA基因參與鴨疫里默氏桿菌對(duì)宿主的粘附和侵襲感染過(guò)程，可能是重要的毒力因子。徐盼（2014）通過(guò)原核表達(dá)鴨疫里默氏桿菌OmpA基因，證實(shí)OmpA蛋白具有免疫原性，能夠刺激宿主產(chǎn)生體液免疫和一定的細(xì)胞免疫。雷云等（2016）基于Om-pA基因?qū)馁F州分離獲得的12株鴨疫里默氏桿菌進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果顯示12株鴨疫里默氏桿菌可分為兩大群，其OmpA蛋白中有規(guī)律的變異位點(diǎn)為100（R/G）、143（S/P）、145（m/I）和268（S/P）。Somu等（2016）通過(guò)比較印度喀拉拉地區(qū)和我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)鴨疫里默氏桿菌的Omp蛋白，結(jié)果顯示這兩個(gè)地區(qū)鴨疫里默氏桿菌分離株的Omp蛋白序列無(wú)顯著差異，故Omp蛋白可作為檢測(cè)鴨疫里默氏桿菌的有效靶標(biāo)蛋白。[本研究切入點(diǎn)]因鴨疫里默氏桿菌血清型較多，現(xiàn)有的疫苗保護(hù)率差（王小蘭，2015），而亟需尋找新的抗原蛋白。本課題組前期通過(guò)隨機(jī)突變庫(kù)篩選法，篩選得到一株毒性明顯下降的突變菌株（LDso約是野生株的1/300），經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)其突變基因?yàn)锳S87-01740基因，基因編碼蛋白屬于外膜蛋白家族（OMPs），至今國(guó)內(nèi)外尚無(wú)有關(guān)該基因的研究報(bào)道。[擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題]對(duì)編碼鴨疫里默氏桿菌表面蛋白的AS87-01740基因進(jìn)行克隆及原核表達(dá)，確定其編碼蛋白抗原性，以期為鴨疫里默氏桿菌亞單位疫苗研發(fā)提供新的靶標(biāo)抗原選擇。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

鴨疫里默氏桿菌由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所保存提供；pCold-TF載體購(gòu)自TaKaRa公司；異丙基硫代-β-D半乳糖苷（IPTG）、普通質(zhì)粒小提試劑盒及大腸桿菌DH5a、BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、膠回收試劑盒購(gòu)自Fermentas公司；His標(biāo)簽純化磁珠購(gòu)自瑞士Biotool公司。

1.2引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中的鴨疫里默氏桿菌CP007204.1基因序列，用PrimerPremier5.0進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物兩端分別添加EcoRⅠ和XhoⅡ酶切位點(diǎn)（下劃線部分）及保護(hù)性堿基（小寫(xiě)字母），擴(kuò)增目的片段大小為595bp。其中，上游引物為5'-actGAATTCATGAAAAAATTATTTTTAGGATTAGCGG-3'，下游引物為5'-agcCTCGAGGAATTTAACTCCTAAACCTACTTGG-3。引物由上海英濰捷基公司合成。

1.3目的基因克隆

使用基因組提取試劑盒提取菌株基因組用作PCR擴(kuò)增DNA模板。PCR反應(yīng)體系50.0μL：2×TaqMix25.0μL，DNA模板2.0μL，上、下游引物各1.0μL，滅菌雙蒸水21.0μL。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5min；95℃1min，52℃1min，72℃40s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后切膠，并回收目的片段。

1.4目的基因測(cè)序及進(jìn)化樹(shù)分析

采用DNASTAR和NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分別進(jìn)行AS87-01740基因生物信息學(xué)分析，并以MAGA7.0構(gòu)建AS87-01740蛋白系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1.5表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定

AS87-01740基因全長(zhǎng)片段及pCold-TF載體用EcoRI和XholI進(jìn)行雙酶切，回收酶切目的片段并重組，以重組質(zhì)粒pCold-AS87-01740轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；次日挑取單菌落培養(yǎng)，經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒送至上海華津生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。同時(shí)，以重組質(zhì)粒pCold-AS87-01740轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，然后涂布于含氨芐的LB瓊脂培養(yǎng)基上，37℃過(guò)夜培養(yǎng)；次日挑取單菌落接種于含氨芐的LB液體培養(yǎng)基（5mL）中，采用PCR進(jìn)行篩選鑒定。

1.6重組蛋白原核表達(dá)及抗原性分析

按1：100比例將測(cè)序驗(yàn)證正確的陽(yáng)性重組菌株接種到100mL含氨芐的LB液體培養(yǎng)基中，37℃下?lián)u床（200r/min）培養(yǎng)2.0-2.5h，于OD_600nm達(dá)0.6-0.8時(shí)加入IPTG至終濃度為1mmol/L，18℃下誘導(dǎo)表達(dá)24h，收集菌體后采用高壓破碎，離心分離上清液和包涵體，以SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)形式。經(jīng)His標(biāo)簽蛋白純化磁珠純化后的融合蛋白使用Westernblotting進(jìn)行抗原性分析。

2結(jié)果與分析

2.1鴨疫里默氏桿菌AS87-01740基因克隆結(jié)果

以鴨疫里默氏桿菌基因組為DNA模板，采用設(shè)計(jì)的AS87-01740特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)約在600bp處出現(xiàn)單一的清晰條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果一致。

2.2AS87-01740基因測(cè)序及進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果

測(cè)序結(jié)果表明，AS87-01740基因編碼框全長(zhǎng)618bp，編碼205個(gè)氨基酸，理論分子量約21.87kD，理論等電點(diǎn)（pI）8.2，正電荷氨基酸總數(shù)17個(gè)，負(fù)電荷氨基酸總數(shù)16個(gè)。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，并以DNASTAR進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，結(jié)果表明，AS87-01740蛋白屬于外膜蛋白家族（OMPs），其氨基酸序列在同種屬分離株中，與2型血清型分離株（11845、YM、GD和CH-2）有很高的相似性（>99%），與1型血清型分離株（CH-1和CH-3）的相似性為92%（圖2）；在不同種屬中，與金黃桿菌（Chryseo-bacteriumsp.）、動(dòng)物潰瘍伯格菌（Bergeyellazoohel-cum）和腦膜炎敗血伊麗莎白菌（Elizabethkingiame-ningosepticum）的相似性分別為61%、60%和57%（圖3）?；诙嘀匦蛄斜葘?duì)分析結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)金黃桿菌與腦膜炎敗血伊麗莎白菌先聚為一支，再與鴨疫里默氏桿菌聚類，而動(dòng)物潰瘍伯格菌菌與以上3種菌株形成較遠(yuǎn)的分支（圖4）。

2.3原核表達(dá)載體鑒定結(jié)果

PCR鑒定重組質(zhì)粒pCold-AS87-01740，可擴(kuò)增獲得約600bp的目的片段（圖5），與預(yù)期結(jié)果相符。將PCR鑒定結(jié)果呈陽(yáng)性的克隆株送至上海華津生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果顯示獲得的pCold-AS87-01740陽(yáng)性克隆與目的序列的相似性達(dá)100%，說(shuō)明目的片段亞克隆成功。

2.4融合蛋白表達(dá)形式檢測(cè)結(jié)果

以測(cè)序正確的陽(yáng)性重組質(zhì)粒pCold-AS87-01740轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞，18℃下1mmol/LIPTG誘導(dǎo)表達(dá)24h（180r/min）后，采用SDS-PAGE檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)形式。結(jié)果顯示，在77kD位置附近出現(xiàn)明顯表達(dá)的目的蛋白條帶（圖6），且上清液中的融合蛋白表達(dá)量較包涵體中的更多，說(shuō)明融合蛋白以可溶性表達(dá)形式為主。

2.5融合蛋白純化及其抗原性分析結(jié)果

采用His標(biāo)簽蛋白純化磁珠對(duì)融合蛋白上清液進(jìn)行純化，得到的純凈目的蛋白大小約77kD（圖7），與預(yù)期結(jié)果相符。Westernblotting檢測(cè)結(jié)果表明，純化后的融合蛋白能與鴨疫里默氏桿菌陽(yáng)性血清發(fā)生較強(qiáng)的特異性免疫反應(yīng)（圖8），是研發(fā)鴨疫里默氏桿菌疫苗的潛在抗原。

3討論

AS87-01740基因編碼蛋白屬于外膜蛋白家族（OMPs），OMPs是革蘭氏陰性菌細(xì)胞外膜的主要結(jié)構(gòu)蛋白，包括OmpA、脂蛋白（Lipoprotein，Lpp）和微孔蛋白（P0rins）等，在細(xì)菌外膜維持、黏附、入侵、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)運(yùn)輸及功能蛋白合成等方面發(fā)揮重要作用（周業(yè)菲，2013）。此外，OMPs能在缺乏免疫佐劑輔助的情況下誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)，且能輔助其他抗原內(nèi)化和交叉提呈，具有潛在的免疫載體功能（Lut-wycheeta1.，1995；RahmanandKawai，2000），可同時(shí)誘導(dǎo)動(dòng)物體的體液免疫和細(xì)胞免疫，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于疫苗研發(fā)領(lǐng)域（Puohiniemieta1.，1990；Jeannineta1.，2000）。因此，鴨疫里默氏桿菌的OmpA作為跨膜蛋白，在維持其外膜結(jié)構(gòu)上具有重要作用（Sonntageta1.，1978；周祖濤等，2008），可作為黏附素或侵襲素，與細(xì)菌毒力密切相關(guān)。

本研究采用PcR成功克隆獲得鴨疫里默氏桿菌的AS87-01740基因，并利用pcold-TF原核表達(dá)載體在大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)出融合蛋白。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果表明，誘導(dǎo)表達(dá)獲得的融合蛋白以可溶性的表達(dá)形式為主，且能與鴨疫里默氏桿菌陽(yáng)性血清發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，是研發(fā)鴨疫里默氏桿菌疫苗的潛在抗原。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLSAT比對(duì)分析結(jié)果表明，AS87-01740基因編碼蛋白在不同血清型鴨疫里默氏桿菌中具有很高的保守性，可作為鴨疫里默氏桿菌的共有抗原。但系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，AS87-01740同源蛋白在金黃桿菌、動(dòng)物潰瘍伯格菌和腦膜炎敗血伊麗莎白菌等種屬中也有分布，意味著AS87-01740基因編碼的同源蛋白可能是一種毒力因子，可在不同細(xì)菌種屬中擴(kuò)散。因此，今后需進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)AS87-01740蛋白的研究，以期為研發(fā)鴨疫里默氏桿菌新疫苗和新藥物提供技術(shù)儲(chǔ)備。

4結(jié)論

AS87-01740基因編碼蛋白在不同鴨疫里默氏桿菌分離株中具有很高的保守性，且能與其陽(yáng)性血清發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，是研發(fā)鴨疫里默氏桿菌疫苗的潛在抗原。

（責(zé)任編輯蘭宗寶）