劉曉婧 凌紅麗 蔣貽海 張園園 趙明 楊光烈 于春梅 薄宗義

摘要[目的]制備H9N2亞型禽流感病毒單克隆抗體和鑒定表位。[方法]選取H9N2亞型禽流感病毒（AIV）WD-1株的純化抗原免疫BALB/c小鼠，對獲得2株抗H9N2亞型禽流感病毒的特異性單抗4C10和6E3表位進行鑒定。[結(jié)果]單抗4C10和6E3分別屬于IgG1和IgG2b亞型，ELISA檢測效價分別為1∶103和1∶105；HI效價分別為215和214；2株單抗均具有雞胚中和活性。利用噬菌體展示表位技術(shù)對2株單抗的抗原表位進行鑒定，結(jié)果顯示均為針對HA 蛋白的1個線性表位。[結(jié)論]該研究為禽流感病毒快速診斷方法的建立提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞禽流感病毒；H9N2亞型；單抗；抗原表位

中圖分類號S852.4文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）10-0129-03

Preparation of H9N2 Subtype Avian Influenza Virus Antibodies and Epitope Identification

LIU Xiaojing， LING Hongli*， JIANG Yihai et al

（Qingdao Vland Biological Products Co. Ltd，Qingdao，Shandong 266114）

Abstract[Objective] To prepare H9N2 subtype avian influenza virus antibodies and identify epitope.[Method] The epitopes of two monoclonal antibodies （McAbs） specific to H9 subtype avian influenza virus （AIV） were identified by cell fusion with the BALB/c mice immunized with purified H9N2 AIV WD1. [Result]The 4C10 and 6E3 were belonged to IgG 1 and IgG 2b，repectively. The ELISA titers were 1∶103 and 1∶105. The HI titers in their ascites were 215 and 214. Two monoclonal antibodies had chicken embryo neutralizing activity. The antigen epitopes of two monoclonal antibodies were all linera epitopes targeting HA protein. [Conclusion] The study laid the foundation for the establishment of rapid diagnostic method of avian influenza virus.

Key wordsAvian influenza virus；H9N2 subtype；Monoclonal antibody；Antigen epitopes

禽流感（Avian Influenza，AI）是由A型流感病毒引起的一種禽類傳染病，感染動物表現(xiàn)出從呼吸系統(tǒng)到全身敗血癥等多種癥狀[1-2]。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，目前對養(yǎng)殖業(yè)危害比較大的是H5和H9亞型禽流感。H9亞型禽流感病毒本身引起的死亡率較低，但能與其他病原混合感染易感動物，引起較高的死亡率，此外也有H9亞型禽流感病毒感染人的報道[3]。目前主要采取疫苗免疫和嚴格的生物安全措施來控制該病。鑒于H9亞型禽流感病毒對養(yǎng)禽業(yè)的危害及其在公共衛(wèi)生學(xué)上的意義，加強對此亞型病毒的檢測和疫病防控迫在眉睫[4]。該研究選取了 H9N2亞型禽流感病毒W(wǎng)D-1株，制備了針對HA蛋白且具有中和活性的特異性單克隆抗體（McAbs）。利用噬菌體展示表位技術(shù)對其抗原保護決定簇進行鑒定[5]，以期獲得具有免疫保護功能的抗原表位。該研究旨在通過體外篩選、人工制備等方法，獲得禽流感病毒特異性McAbs，以期為禽流感病毒快速診斷方法的建立提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1主要試驗材料

H9N2 亞型禽流感病毒株WD-1由青島蔚藍生物制品有限公司提供；H5、H7、H9亞型標準血凝抗原及血清均從哈爾濱獸醫(yī)研究所獲得；對照病毒株NDV 毒株Lasota 由青島蔚藍生物制品有限公司提供；IBV 毒株Massachussetts41和SP2/0細胞由青島蔚藍生物制品有限公司生藥研發(fā)實驗室保存；表達AIV（H9N2）的HA重組質(zhì)粒Pet28a-HA 由青島蔚藍生物制品有限公司生藥研發(fā)實驗室構(gòu)建；SPF雞胚購自梅里亞；6～8周齡SPF BALB/c 雌性小鼠購自北京醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。

1.2主要試劑

PrimeSTAR HS DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶、DNA Marker均購自TaKaRa公司；T4 DNA連接酶購自NEB公司；質(zhì)粒抽提試劑盒、膠回收試劑盒購自Axygen公司；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、辣根過氧化物酶（HRP）標記的兔抗鼠IgG（IgG-HRP）抗體和兔抗鼠IgG-FITC均購自Sigma公司；Ni-NTA Agarose和Chromatography Column純化柱均購自Qiagen公司；Prestained Protein Ladder 購自MBI公司；PEG6000購自Merc公司；蔗糖購自上海國藥；噬菌體展示肽庫試劑盒購自NEB公司。

1.3H9亞型禽流感病毒的純化

將保存的禽流感病毒用生理鹽水按1∶10 000倍稀釋后接種于10日齡雞胚，每個雞胚注射0.2 mL，37 ℃、60%濕度培養(yǎng)3 d后將雞胚置于4 ℃過夜，收集尿囊液測定其血凝活性。反復(fù)凍融3次后離心取上清，緩慢攪拌加入NaCl至 0.5 mol/L，再攪拌加入等體積10%的PEG6000，4 ℃過夜。8 000 r/min離心30 min取沉淀，加入原體積10%的PBS混懸后4 ℃過夜。8 000 r/min離心取上清，用20%、40%、60%的蔗糖18 000 r/min密度梯度離心2 h，收集病毒層，加入適量PBS后18 000 r/min離心2 h取沉淀PBS混懸，測定血凝價和蛋白濃度，分裝后于-20 ℃保存?zhèn)溆?。同時SPF雞胚尿囊液同上操作留存陰性對照品。

1.4動物免疫

將H9N2 禽流感病毒經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化后，按每只100 μg（ 0.2 m L）分點皮下注射BALB/c小鼠。初次免疫后14 d，再皮下分點加強免疫1次。融合前3 d，采用尾靜脈注射法加強免疫1次。

1.5雜交瘤細胞的制備

參照文獻[6]，將小鼠脾細胞和SP2/0 融合后的細胞用禽流感病毒蛋白間接ELISA和HA間接ELISA平行檢測，取雙陽性的克隆，用有限稀釋法進行克隆培養(yǎng)?？寺?次后獲得穩(wěn)定分泌特異性McAbs。將取得的陽性細胞株上清用HI試驗做篩選，取有HI效價的克隆進行建株。

1.6HA1重組蛋白間接ELISA 方法的建立

按常規(guī)間接ELISA 操作，利用方陣法確定McAbs 的篩選條件。將該試驗制備的重組HA1蛋白純化后濃度為1.25 mg/mL，用包被液對其進行1∶10、1∶50、1∶100、1∶200、1∶500 倍稀釋，用PBS對陽性血清進行1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000倍稀釋。以陽性孔OD值最接近于1，P/N 值大于2.1的蛋白和血清濃度作為最佳工作濃度。

1.7陽性雜交瘤細胞的篩選與克隆純化

用間接ELISA檢測方法及間接免疫熒光法（Immunofluorence assay，IFA）檢測雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，篩選出的陽性雜交瘤細胞，及時進行克隆純化及擴大培養(yǎng)，克隆純化采用有限稀釋法進行。剩余細胞擴大培養(yǎng)后進行細胞凍存。

1.8McAbs的特性鑒定

1.8.1

Western blot分析。按常規(guī)SDS-PAGE方法：6%濃縮膠，15%分離膠進行電泳后，PVDF膜，15 V轉(zhuǎn)印30 min，將轉(zhuǎn)印后的PVDF膜封閉過夜后，PBST洗滌后將腹水1∶200稀釋后37 ℃孵育1 h，洗滌后加二抗37 ℃孵育1 h，洗滌后DAB避光顯色15～30 min至條帶清晰，用蒸餾水終止顯色反應(yīng)。

1.8.2

免疫球蛋白亞類鑒定。應(yīng)用SBA ClonotypingTM System/HRP抗體亞類鑒定試劑盒（Southern Biotech公司）鑒定AIV H9單克隆抗體的亞類。具體操作：取AIV純化病毒作為抗原包被的間接ELISA板，以雜交瘤細胞培養(yǎng)上清作為一抗；以1∶250倍稀釋HRP標記的羊抗鼠IgA、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM、κ、λ作為二抗；室溫下TMB避光顯色15 min，讀取OD450值。

1.8.3

特異性檢測。對篩選判為陽性的細胞培養(yǎng)上清，采用間接ELISA方法和血凝抑制試驗，分別與H5 亞型、H7亞型和H9亞型AIV 血凝素分型抗原、EDS-76病毒、NDV、IBV 抗原進行特異性交叉檢測。

1.9McAbs腹水的制備與純化

取10～12周齡的BALB/c雌鼠，每只腹腔注射0.5 mL滅菌液體石蠟，7 d后腹部注射5×105個陽性雜交瘤細胞，7～10 d后觀察小鼠腹部膨大明顯時，立即采集腹水。8 000 r/min，離心5 min，以去除油脂，收集上清，分裝后于-20 ℃凍存。

將腹水按照HiTrap Protein G HP說明書，使用Protein G柱進行純化。純化后的腹水用SDS-PAGE電泳進行純度鑒定。

1.10McAbs腹水的抗體效價

獲得的AIV H9單抗腹水自1∶100開始進行10倍連續(xù)稀釋至1∶108，用建立的間接ELISA方法測抗體效價，同時設(shè)立陰、陽性對照。P/N比值大于2.1的McAbs的最大稀釋度為其效價。

1.11雞胚中和試驗

1.11.1

雞胚半數(shù)致死量（LD50）的測定。取9日齡雞胚分為11組，每組5只雞胚，其中1組作為對照組。將AIV H9胚毒按10-1～10-10做倍比稀釋。分別將倍比稀釋的病毒液經(jīng)尿囊腔接種到雞胚中，每只注射0.2 mL，對照組注射等量的生理鹽水。逐日觀察每組雞胚的死亡數(shù)，并記錄。按Reed和Muench氏法計算雞胚半數(shù)致死量LD50。

1.11.2

雞胚中和試驗。通過對雞胚半數(shù)致死量的測定，選擇病毒液的稀釋度，用滅菌生理鹽水將病毒稀釋成每0.1 mL含有100個LD50。將雜交瘤細胞株培養(yǎng)上清按10-1～10-6做倍比稀釋。將病毒液分別與稀釋單抗細胞培養(yǎng)上清等量混合，于37 ℃感作1 h。試驗組為6組，其中不同稀釋度的單抗分別為1組，另設(shè)正常對照組和病毒對照組（100個LD50），共8組。對試驗組每個稀釋度接種5只雞胚，每只02 mL，正常對照組注射02 mL生理鹽水，病毒對照組接種0.2 mL含有100個LD50的病毒液，置于37 ℃孵化箱孵育144 h，棄去24 h內(nèi)死亡的雞胚，此后每6 h照蛋1次，及時將死亡胚取出，至144 h將雞胚全部取出，并放置4 ℃保存。逐日觀察每組雞胚的死亡數(shù)，并記錄。按Reed和Muench氏法計算中和指數(shù)。

1.12McAbs抗原表位的鑒定

按照NEB 公司的噬菌體展示肽說明書對McAbs對應(yīng)的抗原表位進行鑒定。測定擴增前后噬菌體的滴度，經(jīng)過3輪淘篩，第3輪淘選產(chǎn)物測完滴度后隨機挑取噬菌體克隆進行擴增。在擴增噬菌斑進行DNA測序時，利用ELISA方法檢測所選多肽對靶分子的結(jié)合能力。

將100 μL的純化單抗以 100 μg/mL 的濃度包被 96 孔板，每個待鑒定克隆包被1排，在密封的濕盒中4 ℃包被過夜。甩出多余靶分子溶液，在紙巾上拍除殘液。每孔加滿封阻液，4 ℃封閉1 h。另外，還需單獨準備一個微量滴定板進行噬菌體的系列稀釋，也要用封阻液封阻。甩出封阻液，TBST洗板6次，甩去洗液。在單獨的封阻板中每孔預(yù)先加入200 μL TBST，每排第1孔加1×1012個病毒子，開始對噬菌體進行4倍系列稀釋至第12孔，2×105個病毒子。將稀釋好的噬菌體加入包被有靶分子的板中，室溫振蕩作用1 h。TBST 洗板 6 次，甩出洗液。二抗每孔加入 M13-HRP抗體（1∶5 000倍稀釋）200 μL，室溫振蕩作用1 h。TBST 洗板 6 次，甩出洗液。加入OPD顯色液100 μL/孔，顯色 10 min，終止液終止，酶標儀讀值OD492。按各個噬菌體OD值（S）與陰性對照OD值（N）的比值（S/N）>2.1鑒定陽性克隆株。

2結(jié)果與分析

2.1H9亞型禽流感病毒的純化與鑒定

收獲的接毒尿囊液經(jīng)蔗糖梯度差速離心后，可明顯分為4個條帶。分別取出4個條帶，測定其血凝滴度，確定病毒抗原主要所在位置。結(jié)果表明，40%處的蛋白帶血凝價為1∶214；60%處蛋白帶血凝價為1∶ 216，將其同時收集作為免疫抗原。

2.2雜交瘤細胞株的篩選及特性分析

經(jīng)過3次亞克隆純化，最終獲得3株能分泌McAbs的雜交瘤細胞株：4C10、5D8和6E3。

2.2.1

Western blot分析結(jié)果。采用H9N2亞型禽流感病毒W(wǎng)D-1株重組HA1蛋白，對3株單抗4C10、5D8和6E3進行Western blot鑒定。其中單抗4C10和6E3均在約51 kD處有明顯條帶，證明為HA1蛋白的單抗，5D8未見條帶，可能為針對HA1蛋白的構(gòu)象抗體。

2.2.2

單克隆抗體的免疫球蛋白亞類鑒定。采用美國

Southern Biotech公司的SBA ClonotypingTM System/HRP抗體亞類鑒定試劑盒對所獲得的3株針對AIV H9的單抗進行免疫球蛋白亞類鑒定，鑒定結(jié)果顯示，單抗4C10和5DB均屬于IgG1/；單抗6E3屬于IgG2b/。

2.3單克隆抗體的抗體效價（ELISA和HI效價）

對3株單抗制備的腹水效價進行測定，結(jié)果如表1所示。ELISA檢測效價單抗6E3的效價最高（1∶105）；HI檢測效價單抗4C10和6E3的腹水效價較高，分別為215和214。

2.6McAbs抗原表位鑒定

利用噬菌體12肽庫淘選針對H9亞型AIV 單抗4C10和6E3的克隆，3輪淘洗后，能與單克隆抗體4C10和6E3特異性結(jié)合的噬菌體得到了選擇性富集，隨機挑取20個克隆，經(jīng)ELISA陽性鑒定后獲得10個陽性克隆（P/N≥2.1）。

陽性克隆經(jīng)上海生工生物工程有限公司測序，對測序結(jié)果進行對比分析，2株單抗對比顯示其一致序列為CSKYIGIKS，與所用毒株的HA 蛋白編碼氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)其與aa257～aa265有7 個氨基酸位點完全匹配，提示257CRKYIGVKS265為HA 抗原的1個線性表位。

3討論

近年來H9亞型禽流感病毒的變異加劇，對養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和社會公共安全的威脅也越來越大。病毒分離鑒定和HI試驗等方法是目前診斷禽流感病毒的常用手段，但多用于實驗室的檢測，而臨床上期待針對禽流感病毒的快速診斷試劑，如免疫膠體金試紙條、禽流感多重檢測基因芯片等產(chǎn)品。

該研究應(yīng)用雜交瘤技術(shù)，通過體外篩選、人工制備等方法研制出了針對H9亞型禽流感病毒HA1蛋白的特異性單克隆抗體，并鑒定出一段具有免疫保護功能的抗原結(jié)合表位，旨在通過對功能性抗原表位的進一步研究，針對性地開發(fā)出一系列有應(yīng)用價值的快速診斷和治療用禽流感功能型抗體。通過對抗體的表達及親和力改進，實現(xiàn)抗體的大規(guī)模制備，推動禽流感病毒抗體產(chǎn)業(yè)化進程。