張恒 馮仁軍 王靜毅 云天艷 李成梁 張銀東 張錫炎

摘 要 以干旱馴化和未馴化的香蕉幼苗為研究材料，采用實時熒光定量PCR方法檢測干旱脅迫過程中6個miRNAs的表達變化。結(jié)果表明：6個miRNAs在所有香蕉幼苗的干旱脅迫響應過程中均有表達，但其表達模式存在差異，在直接干旱處理下，miR156k、miR160a、miR162a、miR164a、miR166d的表達均呈現(xiàn)升高-降低的趨勢，miR397b的表達則呈現(xiàn)升高-降低-升高-降低的趨勢；在馴化后干旱處理下，miR156k、miR162a、miR166d、miR397b的表達均呈現(xiàn)升高-降低的趨勢，miR160a、miR164a的表達則呈現(xiàn)升高-降低-升高-降低的趨勢。干旱脅迫響應過程中（除處理后第10天外），馴化后的香蕉幼苗中miRNAs的表達量基本上高于未馴化香蕉幼苗中miRNAs的表達量，同時還發(fā)現(xiàn)miR160a和miR164a的表達量都非常高。上述研究結(jié)果將為香蕉干旱脅迫應答研究奠定基礎。

關(guān)鍵詞 香蕉；干旱脅迫；miRNAs；表達分析

中圖分類號 S668.1 文獻標識碼 A

The Expression Analysis of Banana miRNAs

Under Drought Stress

ZHANG Heng1， FENG Renjun2 *， WANG Jingyi2 ， YUN Tianyan1，

LI Chengliang1， ZHANG Yindong1 **， ZHANG Xiyan2 **

1 College of Agronomy， Hainan University， Haikou， Hainan 570228， China

2 Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology， CATAS / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources

of Tropical Crops， Ministry of Agriculture， Haikou， Hainan 571101， China

Abstract The miRNAs expression of drought-acclimated and non-acclimated banana plantlets were researched under the drought stress by Real-time PCR. The experimental results showed that the expression of six miRNAs were detected in all plantlets under the drought stress， but the expression patterns of these miRNAs were differential. The expression profiles of miR156k， miR160a， miR162a， miR164a and miR166d were increased first and decreased later， and the expression pattern of miR397b showed a tendency of increase first then decrease， again rise again fall in the non-acclimated banana plantlets. On the other hand， in the drought-acclimated banana plantlets， the expression profiles of miR156k， miR162a， miR166d and miR397b were increased first and decreased then， and the expression patterns of miR160a and miR164a showed a tendency of increase first then decrease，again rise again fall. At all time points except for the 10th day after drought treatment， the expressional levels of most miRNAs in the acclimated banana plantlets were higher than those in the non-acclimated plantlets， and the expressional levels of miR160a and miR164a were higher than those of the other four miRNAs in any plantlets at any time points. These research findings should lay a better foundation for the further research of drought-stress response mechanism in banana.

Key words bananas； drought stress； miRNAs； expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.01.015

香蕉（Musa spp.）是一種多年生大型常綠單子葉草本植物，產(chǎn)于熱帶和亞熱帶地區(qū)，是世界上主要水果之一，也是重要的糧食和經(jīng)濟作物[1]。干旱是一個始終存在的世界性難題，嚴重影響了香蕉的產(chǎn)量與品質(zhì)，是香蕉生產(chǎn)的主要非生物脅迫因素之一。microRNA（miRNA）是一類不編碼蛋白質(zhì)、不具有開放閱讀框的內(nèi)源性的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈RNA，廣泛存在于真核生物中，與生物體的生長發(fā)育關(guān)系密切[2]。目前，與非生物脅迫相關(guān)的miRNAs已在多種植物中有研究報道。眾多國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs具有高度的保守性與表達時序性。擬南芥的miR393、miR319、miR397、miR167、miR168、miR171和miR408在干旱條件下的表達量均提高；苜蓿在缺水條件下，其miR393、miR398a和miR408的表達量均上調(diào)，而miR169在根中的表達量則下調(diào)；在豌豆、玉米、大麥和小麥中均發(fā)現(xiàn)與干旱相關(guān)的miRNAs的表達能受干旱和ABA誘導[3-12]。但是，目前有關(guān)香蕉干旱脅迫miRNAs的研究卻未見報道。

成熟的miRNA序列通常只有20～24 bp，由于長度太短，給cDNA第一鏈的合成以及后續(xù)的PCR擴增帶來了一定的難度。隨著人們對miRNA研究的不斷深入，越來越多的手段可以用來解決這一問題。目前，miRNA相關(guān)的研究方法主要有以下幾種：Northern blotting法、莖環(huán)RT-PCR法、miRNA芯片技術(shù)、polyA聚合酶加尾法[13-17]。本實驗室通過高通量測序的方法在前期研究中發(fā)現(xiàn)了6個與干旱脅迫相關(guān)的miRNAs（miR156k、miR160a、miR162a、miR164a、miR166d和miR397b）。本研究采用莖環(huán)RT-PCR法對前期研究獲得的6個miRNAs的表達情況進行研究，分析這些miRNAs在干旱脅迫下香蕉幼苗中的表達差異性和時序性，從而為與香蕉干旱脅迫相關(guān)的miRNAs研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

巴西香蕉幼苗購自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院組培中心。將香蕉幼苗置于光照、溫度和濕度相對穩(wěn)定的條件下進行培養(yǎng)，培養(yǎng)15 d后，待其長至約30 cm高時，開始對幼苗進行干旱處理。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 本研究共設2個處理和1個對照：未經(jīng)干旱馴化的香蕉幼苗干旱處理（DNH）、經(jīng)干旱馴化的香蕉幼苗干旱處理（DH）和對照（DC）。香蕉幼苗的干旱馴化：對正常生長的香蕉幼苗停止?jié)菜瑢ζ鋵嵤┳匀桓珊?，干?0 d后對其進行澆水，直到這些受到嚴重旱害的香蕉幼苗表型恢復正常，這些能恢復正常生長的香蕉幼苗即為干旱馴化香蕉幼苗。然后對馴化和未馴化香蕉幼苗進行干旱處理，從第0天開始，每間隔1 d對處理和對照進行取樣。在10個時間點（0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 d）分別采集處理和對照的頂部功能葉，清潔后將其置于液氮中速凍，于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 莖環(huán)RT-PCR法引物設計 莖環(huán)引物一般由2部分的序列構(gòu)成，它們分別為5′端的由38個固定堿基構(gòu)成的序列和3′端的8個與成熟miRNA 3′端反向互補的序列。通過莖環(huán)引物引導，miRNA被特異地反轉(zhuǎn)錄為一段約70 bp的cDNA序列[18-19]。本研究分別設計了6個miRNAs的莖環(huán)引物、PCR正向引物和PCR通用引物（表1）。

1.2.3 香蕉葉片總RNA的提取 采用改良的CTAB法[20]對香蕉葉片的RNA進行提取，提取完后取3 μL總RNA進行1%瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外分光光度計下檢測所提取的RNA純度。

1.2.4 cDNA第一鏈的合成 以提取到的香蕉葉片總RNA為模板，利用表1所設計的特異性莖環(huán)引物，根據(jù)美國Invitrogen公司的M-MLV Reverse Transcriptase（C28025-021）說明書進行cDNA第一鏈的合成。

1.2.5 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測miRNAs的表達量 以香蕉5s rRNA作為內(nèi)參基因、去離子水作為模板的陰性對照、反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA第一鏈為模板，按表2的體系進行qRT-PCR擴增，檢測干旱脅迫下馴化和未馴化香蕉幼苗miRNAs的表達量。所使用的儀器為美國安捷倫公司的Mx3005P熒光定量PCR儀。miRNAs的相對表達量采用2-△△Ct法計算獲得，計算公式為：△△Ct=（Ct miRNAs-Ct 5s rRNA）處理-（Ct miRNAs-Ct 5s rRNA）對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對香蕉幼苗表型的影響

香蕉幼苗在干旱脅迫下的表型變化如圖1所示。隨著時間的推移和干旱程度的加深，香蕉幼苗出現(xiàn)明顯變化，如生長停止，葉片萎蔫并下垂。從第4天起，香蕉幼苗底部的功能葉片開始出現(xiàn)輕度的萎蔫；到第10天時，香蕉幼苗最頂端的功能葉開始萎蔫，此時底部功能葉已嚴重脫水；到第14天時，香蕉幼苗頂部功能葉嚴重萎蔫，底部功能葉卷曲、枯黃，最終壞死。

2.2 香蕉總RNA提取質(zhì)量分析

采用改進的CTAB法從香蕉葉片中提取總RNA。每孔上樣量為3 μL，進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，驗證所提取RNA的完整性（圖2）。結(jié)果顯示，所提取的香蕉葉片總RNA中28s rRNA與18s rRNA條帶清晰，28s rRNA的亮度約是18s rRNA的2倍，且無降解及拖尾現(xiàn)象，同時還富集到了16s rRNA與5.8s rRNA，其中16s rRNA可能是葉綠體RNA。取2 μL樣液稀釋至200 μL，進行分光光度計檢測，結(jié)果顯示，A260/A280比值為1.962～2.085，符合A260/A280為1.9～2.1的范圍，能夠滿足后續(xù)試驗的要求。

2.3 干旱脅迫對馴化和未馴化香蕉幼苗miRNAs表達的影響

本研究檢測了馴化和未馴化香蕉幼苗葉片中6個miRNAs（miR156k、miR160a、miR162a、miR164a、miR166d、miR397b）在干旱脅迫下10個時間點（0 d、2 d、4 d……18 d）的表達量。結(jié)果如圖3所示，馴化和未馴化香蕉葉片中6個miRNAs在干旱下的10個時間點均有表達，隨著干旱程度的加深，miRNAs的表達處于動態(tài)變化中。在干旱脅迫下，未馴化香蕉葉片中miR156k、miR160a、miR162a、miR164a、miR166d的表達量在時間上均呈現(xiàn)升高-降低的變化趨勢（單峰），且均在干旱處理第10天時表達量達到峰值；但miR397b的表達量在時間上則呈現(xiàn)升高-降低-升高-降低的變化趨勢（雙峰），且在干旱處理第2天和第8天時表達量達到峰值。馴化香蕉葉片中miR156k、miR162a、miR166d、miR397b的表達量在時間上均呈現(xiàn)升高-降低的趨勢（單峰），且均在干旱處理第8天時表達量達到峰值；而miR160a、miR164a的表達量呈現(xiàn)升高-降低-升高-降低趨勢（雙峰），且均在干旱處理第4天和第10天時表達量達到峰值。

從表達量上看，所檢測的馴化和未馴化香蕉葉片中6個miRNAs在干旱脅迫下10個時間點的表達量均具有明顯差異。總體來說除了干旱處理第10天外，馴化后香蕉葉片miRNAs表達量基本上高于未馴化香蕉葉片中的表達量。另外，無論是馴化還是未馴化香蕉葉片中，miR160a和miR164a的表達量都非常高。

3 討論

香蕉是芭蕉科芭蕉屬多年生大型常綠單子葉草本植物，其生長發(fā)育對水分需求量大，對干旱十分敏感。干旱是重要的非生物脅迫之一，嚴重影響植物的生長發(fā)育。本研究在干旱脅迫下檢測了干旱馴化和未馴化香蕉幼苗中6個miRNAs的表達變化。結(jié)果表明，干旱馴化和未馴化香蕉幼苗中miRNAs在干旱脅迫下的表達變化趨勢不同，概括起來可大致將其分為2種：一種是呈上升-下降的“單峰型”趨勢，如未馴化香蕉幼苗的miR156k、miR160a、miR162a、miR164a、miR166d，以及馴化幼苗的miR156k、miR162a、miR166d、miR397b；另一種是呈升高-降低-升高-降低的“雙峰型”趨勢，如未馴化香蕉幼苗的miR397b，以及馴化幼苗的miR160a、miR164a。

干旱脅迫下馴化和未馴化香蕉幼苗的miRNAs在個別時間點的表達量非常高，如未馴化幼苗的miR156k、miR160a、miR162a、miR164a、miR166d在處理的第10天，馴化幼苗的miR156k、miR162a、miR166d、miR397b在處理的第8天。未馴化香蕉幼苗的miRNAs在第10天時對干旱脅迫的響應最為劇烈，說明干旱10 d是未馴化香蕉幼苗的一個非常關(guān)鍵的時間點，即未馴化香蕉幼苗響應干旱脅迫的一個臨界點；而馴化香蕉幼苗的miRNAs卻在第8天對干旱脅迫的響應最為劇烈，但此時其miRNAs表達量遠低于未馴化香蕉幼苗的miRNAs在第10天時的表達量。因此，從干旱響應時間上看，馴化香蕉幼苗的miRNAs對干旱脅迫的應答要早于未馴化香蕉幼苗的miRNAs。此外，除干旱處理第10天外，馴化香蕉幼苗中miRNAs表達量基本上都高于未馴化香蕉幼苗中miRNAs的表達量。推測其機理：當未馴化香蕉植株首次面對干旱脅迫時，由于其不能識別干旱脅迫，于是其可能會調(diào)動體內(nèi)所有與脅迫相關(guān)的代謝途徑去響應干旱脅迫，最后通過調(diào)整相關(guān)代謝途徑的動態(tài)平衡去適應干旱脅迫，同時建立起對干旱脅迫的識別和防御系統(tǒng)，形成“干旱記憶”；而當馴化香蕉植株面對干旱脅迫時，其體內(nèi)早已建立的干旱識別和防御系統(tǒng)能很快識別干旱脅迫，并僅調(diào)用干旱脅迫防御系統(tǒng)進行脅迫響應，所以能較快較易地適應干旱脅迫。另外，無論是馴化還是未馴化香蕉幼苗中，miR160a和miR164a的表達量都非常高，推測其可能在香蕉植株抗旱過程中扮演著重要的角色，但這還需要進一步實驗證明。

前人的研究結(jié)果表明，本研究所選取的6個miRNAs在不同物種的多種脅迫下均有表達，但在香蕉中尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)此類miRNAs的報道（表3）。孫現(xiàn)軍[21]和孔德艷[22]通過構(gòu)建基因定點突變體系，分別在大豆和水稻中證明了miR160a與miR397b響應于干旱脅迫，但沒有從定量的角度對其進行表達分析。本研究在干旱馴化和未馴化香蕉幼苗中定量分析了這6個miRNAs在響應干旱脅迫過程中的表達變化特征，這將為與香蕉干旱脅迫相關(guān)的miRNAs研究奠定基礎。

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