李文珂，薛明珠，李 丹，董 俊，王明月，張經(jīng)緯，孫雅念，陳建國，，胡長敏，，周東海，，丁明星，，張安定，3，韓 麗，

（1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院，湖北武漢 430070；3. 農(nóng)業(yè)部獸用診斷制劑創(chuàng)制重點實驗室，湖北武漢 430070）

湖北省武漢市某門診犬瘟熱病例統(tǒng)計分析

李文珂1，薛明珠2，李 丹1，董 俊1，王明月1，張經(jīng)緯1，孫雅念2，陳建國1，2，胡長敏1，2，周東海1，2，丁明星1，2，張安定1，3，韓 麗1，2

（1. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070；2. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院，湖北武漢 430070；3. 農(nóng)業(yè)部獸用診斷制劑創(chuàng)制重點實驗室，湖北武漢 430070）

為了解武漢市犬瘟熱的流行情況，以華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院的臨床病例為研究對象，應(yīng)用膠體金試紙條和RT-PCR檢測技術(shù)，調(diào)查了2015年9月至2016年10月間的門診犬瘟熱病例情況。本次調(diào)查共對2 967只門診犬進行了犬瘟熱檢測，其中檢出陽性143只，陽性檢出率為4.8%。從時間分布看，該期間大部分月份的犬瘟熱檢出陽性率在4%～5%之間，但在氣溫變化大的10月份較高，約為9%。從群間分布看，耐寒的金毛、薩摩耶、哈士奇、阿拉斯加犬以及耐熱懼寒的貴賓犬的陽性比例較高，總占比為54.5%；雄性犬陽性數(shù)量明顯高于雌性犬；發(fā)病犬的年齡分布和犬瘟熱的流行特點基本一致，以2～4月齡為主。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，疫苗免疫可明顯降低犬瘟熱的發(fā)病率和患病犬體內(nèi)的病毒含量。本研究結(jié)果在一定程度上反映了該病在武漢市的流行特點，并為該病的防治提供了重要的參考資料。

犬瘟熱；犬瘟熱病毒；流行病學(xué)；發(fā)病率；膠體金試紙條；RT-PCR

犬瘟熱（Canine distemper，CD） 是由犬瘟熱病毒（Canine distemper virus，CDV）感染引起的急性、熱性、高度接觸性傳染病，主要臨床特征是雙相熱，眼、鼻、消化道等處的粘膜炎癥，以及卡他性肺炎、皮炎及神經(jīng)癥狀[1-2]，常引起犬科、鼬科和部分浣熊科動物發(fā)病，病死率差異較大，一般在30%～80%之間波動[2]。近年來，隨著我國伴侶動物飼養(yǎng)量以及異地交流量的增加，犬瘟熱在我國犬中的發(fā)病率和病死率均有增高的趨勢[3]。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院的傳染病臨診病例，不僅數(shù)量多，而且覆蓋了武漢市各區(qū)，是武漢市最具代表性的伴侶動物醫(yī)院。因此，本研究以華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院的門診犬為代表，對2015年9月至2016年10月間的犬瘟熱發(fā)病情況做一調(diào)查，從而掌握該病的流行特點，并為該病的防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 主要儀器

Eppendorf高速冷凍離心機；博日科技有限公司生產(chǎn)的核酸擴增儀；北京六一公司生產(chǎn)的核酸電泳系統(tǒng)。

1.2 主要試劑

TRIzol Reagent，Invitrogen公司產(chǎn)品；Reverse Transcriptase XL（AMV） 反 轉(zhuǎn) 錄 酶、dNTPs、ExTaq DNA聚合酶、DL-2000 DNA Marker，均為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品。

1.3 病料

2015年9月至2016年10月，于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院采集了2 967份患病犬的鼻咽拭子。將鼻咽拭子浸在含有青霉素、鏈霉素的滅菌生理鹽水中，迅速送往實驗室檢測。

1.4 膠體金試紙條檢測

將所采集的鼻咽拭子，采用韓國Bioindist公司生產(chǎn)的膠體金試紙條進行CD檢測。

1.5 RT-PCR檢測

參 照 文 獻[4-5]中 建 立 的CDV RT-PCR檢測方法，選擇H基因的保守區(qū)域作為PCR擴增的靶序列，合成1對擴增760 bp的引物，P1：5'-CTTGTGTGTAGAAGAGAGC-3'；P2：5'-ATAAGAAATCGTCCGGATTG-3'。引物合成由上海生物工程公司完成。

將采集的鼻咽拭子先進行膠體金試紙條檢測，若為陰性，但來源犬的臨床癥狀明顯，就采用如下RT-PCR方法復(fù)檢。將采集的鼻咽拭子，先按照TRIzol Reagent使用說明書進行RNA抽提，后使用P1引物進行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，再按照94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，61 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min的程序進行PCR擴增。對擴增產(chǎn)物采用瓊脂糖電泳方法進行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 時間分布

本研究統(tǒng)計了華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院自2015年9月至2016年10月就診犬的CD發(fā)病情況。將所有的2 967只疑似發(fā)病犬，采用韓國Bioindist公司生產(chǎn)的犬瘟熱膠體金檢測試紙和RT-PCR方法進行診斷，結(jié)果檢出陽性143只（圖1），檢出陽性率為4.8%。

圖1 犬瘟熱陽性病例數(shù)以及就診犬病例數(shù)

對該期間各月份的CD檢出陽性率進行分析，發(fā)現(xiàn)大部分月份的檢出陽性率在4%～5%之間，但2015年10月和2016年10月的較高，分別為9.7%和8.8%，這可能與武漢市10月份氣溫多變有關(guān)。另外，2016年1月和5月的檢出陽性率較低，均在3%以下。這是否與1月份含有春節(jié)、5月份武漢市氣候最適宜等原因有關(guān)，值得深入探究。

2.2 群間分布

本研究對CD陽性犬的品種、性別、年齡進行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)金毛、薩摩耶、哈士奇和阿拉斯加等耐寒犬種以及貴賓犬等耐熱懼寒犬種的比例較高，總占比為54.5%（圖2）。雖然不清楚不同品種犬在武漢市的實際飼養(yǎng)量，但本研究仍可提示，對于金毛、貴賓、薩摩耶、哈士奇、阿拉斯加等犬種，易受到CDV的侵襲。

圖2 不同品種犬瘟熱病犬的陽性率占比

本研究對陽性犬的性別進行了分析，發(fā)現(xiàn)雌性犬占28.5%，而雄性則高達71.5%。由于不清楚本地區(qū)雌性和雄性犬的準(zhǔn)確飼養(yǎng)數(shù)量和比例，因此不能確定雄性犬更易感。

本研究對陽性犬的年齡進行了分析，發(fā)現(xiàn)2月齡以內(nèi)的仔犬占比較少，僅為5.1%，這可能與母源抗體的保護有關(guān)；2～4月齡幼犬占比較高，達到61.6%；超過5月齡犬的占比較低，超過2歲犬的占比更低（圖3）。這與CD的流行特點基本一致[1-2]。

本研究對陽性犬的免疫狀態(tài)進行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)未免疫或未按照規(guī)定免疫犬的占比為68.3%，而免疫犬的占比僅為19.0%。這說明疫苗免疫可預(yù)防該病的發(fā)生，但不能提供完全保護。另外，免疫期間（首免至完成免疫的時期）的陽性犬占比為12.7%，但該年齡段的陽性比例高達61.6%，這意味著免疫可有效降低發(fā)病率。遺憾的是，由于難于對犬的飼養(yǎng)規(guī)模和免疫狀態(tài)進行大規(guī)模調(diào)查，本研究僅從就診陽性犬是否免疫進行分析，不能精確反應(yīng)免疫對降低發(fā)病率的影響程度，但仍可提示免疫對防控該病的重要性。

圖3 犬瘟熱陽性犬中不同年齡犬的占比

進一步對檢測陽性和免疫情況進行聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)所有檢測為強陽性（++++）的均為非免疫或未按規(guī)定免疫的犬；弱陽性（+）的在非免疫或未按規(guī)定免疫犬中的占比為55%，但在免疫犬中的占比高達76%。這說明即是在發(fā)病犬中，免疫犬的病毒含量也相對較低，進一步證明了疫苗免疫的效果。

3 討論

本研究以華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)院門診犬為代表，對2015年9月至2016年10月期間的CD陽性情況進行了分析。由于膠體金檢測技術(shù)的敏感性較低，因此對臨床疑似，但膠體金檢測為陰性的犬，采用RT-PCR方法進行復(fù)檢。整體而言，本調(diào)查的CD陽性率略低于李華坤等[6]所調(diào)查的徐州地區(qū)（6.6%），也明顯低于黃淑芬等[8]所調(diào)查的廣州地區(qū)（13.1%）、楊學(xué)梅等[9]所調(diào)查的延邊地區(qū)（49%）、劉靖清[10]所調(diào)查的鹽城地區(qū)（33.3%），但明顯高于李欽等[7]所調(diào)查的上海地區(qū)（0.57%）。由于這些調(diào)查研究中的樣本數(shù)差別較大，采用的檢測技術(shù)的敏感性也有差異，因此很難確認各地區(qū)的CD發(fā)病情況具有可比性，這表明開展更加系統(tǒng)的流行病學(xué)分析十分必要。

通過對時間分布分析發(fā)現(xiàn)，大部分月份的月檢出陽性率較一致，主要在4%～5%之間，但10月份的陽性率較高，1月、5—6月的較低。通過比較其他地區(qū)門診陽性的比例發(fā)現(xiàn)，只有廣州市與此類似[11]，其他地區(qū)的調(diào)查結(jié)果與此相差較大[6-11]，這可能與地域和氣候差異，以及飼養(yǎng)規(guī)模和飼養(yǎng)習(xí)慣的影響有關(guān)，因此各地應(yīng)根據(jù)本地的流行特點，開展有針對性的防治。

通過群間分布分析發(fā)現(xiàn)，金毛、貴賓、薩摩耶、哈士奇、阿拉斯加等犬種的陽性數(shù)量較多，因此在武漢市，應(yīng)特別注意這些犬種的CD防控。另外，分析發(fā)現(xiàn)患病犬中雄性占比高達71.5%，與張艷雯等[11]調(diào)查的南寧地區(qū)的CD流行情況相似。這很可能與公犬飼養(yǎng)率高于母犬，以及公犬活動性較母犬高、與其他犬接觸更加頻繁有關(guān)。當(dāng)然，對于犬瘟熱陽性檢出率與性別的關(guān)系，還需結(jié)合其他地區(qū)熱發(fā)病犬的情況進一步明確。調(diào)查發(fā)現(xiàn)發(fā)病犬的年齡分布和CD的流行特點基本一致，因此應(yīng)特別注意2～4月齡幼犬的預(yù)防和治療。

本研究發(fā)現(xiàn)患病犬中，疫苗免疫犬的比例遠低于非免疫犬以及未按規(guī)定免疫犬，表明疫苗免疫可有效減低CD的發(fā)病率。這與其他地區(qū)的調(diào)查結(jié)果相符[6-11]。同時，檢測發(fā)現(xiàn)疫苗免疫犬就診時的病毒含量相對較低，這進一步驗證了疫苗免疫對于防控該病的效果。但也應(yīng)考慮到對CD的防控不能完全依賴疫苗，做好易感犬的衛(wèi)生消毒以及防止其與患病犬的接觸等在該病防治中也具有重要意義。當(dāng)然研制更有效的疫苗也是今后的研究方向。

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（責(zé)任編輯：朱迪國）

Statistical Analysis on Cases of Canine Distemper in an Animal Hospital in Wuhan City of Hubei Province

Li Wenke1，Xue Mingzhu2，Li Dan1，Dong Jun1，Wang Mingyue1，Zhang Jingwei1，Sun Yanian2，Chen Jianguo1，2，Hu Changmin1，2，Zhou Donghai1，2，Ding Mingxing1，2，Zhang Anding1，3，Han Li1，2

（1. College of Veterinary Medicine，Huazhong Agricultural University，Whuhan，Hube 430070；2. Animal hospital，Huazhong Agricultural University，Whuhan，Hube 430070；3. Key Laboratory of Development of Veterinary Diagnostic Products，Ministry of Agriculture，Whuhan，Hube 430070）

In order to recognize the epidemic status of canine distemper（CD）in Wuhan City，taking clinical cases from the animal hospital of Huazhong Agricultural University as the research subjects and using colloidal gold detection and RT-PCR，a total of 2 967 CD cases collected from September 2015 to October 2016 were tested and analyzed. Results showed that 143 of the 2 967 samples were tested positive for CDV，accounting for 4.8%. According to the time distribution，an average positive rate of 4%～5% in most months during the investigation was observed. In particular，the positive rate was much higher（about 9%）in October when temperature changed greatly. According to the group distribution，a high positive rate occurred in some cold-tolerant canines including Golden retriever，Alaskan Malamute，Siberian husky and Samoyed breed，and also in Poodle breed，which is heat resistant but cold intolerant， accounting for 54.5% of all CDV positive cases. Besides，the male dogs were much more susceptible than the female dogs. The ages of dogs infected by CD were mainly 2～4-month-old，which was consistent with its epidemic characteristics. Otherwise，vaccination could obviously help to decrease the morbidity and to lower virus load of theinfected animals. To some degree，this investigation reflected epidemic characteristics of CD in Wuhan City and it would provide important reference for its prevention and control.

Canine distemper（CD）；Canine distemper virus（CDV）；epidemiology；morbidity；Colloidal gold test strip；RT-PCR

S854.4

B

1005-944X（2017）04-0028-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.04.008

科技部重點研發(fā)專項（2016YFD0501007）；中央高校基本科研業(yè)務(wù)專項（2014QC002）

韓 麗