韓 蕾董 捷黃家興和紹禹吳 杰

（1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所，昆明650201；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，農(nóng)業(yè)部授粉昆蟲(chóng)生物學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，北京100093）

蘭州熊蜂（Bombus lantschouensis）SMPD基因原核表達(dá)誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

韓 蕾1,2董 捷2黃家興2和紹禹1吳 杰2

（1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方蜜蜂研究所，昆明650201；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，農(nóng)業(yè)部授粉昆蟲(chóng)生物學(xué)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，北京100093）

蘭州熊蜂(Bombus lantschouensis)是我國(guó)優(yōu)良熊蜂蜂種，已成功實(shí)現(xiàn)人工飼養(yǎng)并應(yīng)用于設(shè)施作物授粉。鞘磷脂磷酸二酯酶（SMPD）是一種水解酶，參與鞘磷脂代謝過(guò)程并起關(guān)鍵作用。本研究從誘導(dǎo)溫度、IPTG濃度及誘導(dǎo)時(shí)間三個(gè)因素對(duì)SMPD基因的原核表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得最佳原核表達(dá)條件。結(jié)果表明：誘導(dǎo)溫度與誘導(dǎo)時(shí)間是影響SMPD蛋白表達(dá)量的主要因素，而誘導(dǎo)劑IPTG濃度影響較小。當(dāng)溫度為10℃，IPTG終濃度為0.1 mM，誘導(dǎo)時(shí)間為32 h時(shí)，目的蛋白表達(dá)量高，特異性好，能夠滿足該蛋白后續(xù)純化實(shí)驗(yàn)要求。本研究結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)展SMPD蛋白功能研究奠定重要基礎(chǔ)。

蘭州熊蜂；原核表達(dá)；SMPD基因；誘導(dǎo)條件

1 引言

鞘磷脂磷酸二酯酶（sphingomyelin phosphodiesterase,SMPD）是一種水解酶，能水解神經(jīng)鞘磷脂生成神經(jīng)酰胺[1]，參與細(xì)胞凋亡、生長(zhǎng)抑制等生理病理活動(dòng)。研究發(fā)現(xiàn)該基因與哺乳動(dòng)物的壽命和某些疾病相關(guān)，Kenichi Horinouchi等[2]利用基因敲除技術(shù)敲除小鼠SMPD基因后，小鼠出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢、神經(jīng)退化及壽命縮短等變化。隨后，Schneider等[3]首次在尼曼匹克?。∟iemann.Pick Disease，NPD)患者中發(fā)現(xiàn)SMPD基因處于缺乏狀態(tài)。此外，高軍等[4]通過(guò)RNA干擾技術(shù)發(fā)現(xiàn)該蛋白能夠參與哺乳動(dòng)物卵巢的保護(hù)，研究表明SMPD基因被激活后釋放到細(xì)胞表面，水解細(xì)胞膜上的鞘磷脂酶，導(dǎo)致神經(jīng)酰胺水平在數(shù)秒到數(shù)分鐘內(nèi)迅速上升，從而阻斷鞘磷脂酶的表達(dá)并抑制卵母細(xì)胞在抗腫瘤治療過(guò)程的凋亡。

在昆蟲(chóng)中，SMPD基因的研究較少。Kraut等[5]在研究神經(jīng)鞘脂類對(duì)果蠅發(fā)育和疾病的作用中發(fā)現(xiàn)：果蠅飼喂糖水后，鞘磷脂酶和神經(jīng)酰胺水平下調(diào)，而脂肪酸水平上調(diào)，因此推測(cè)該脂類可能在抑制脂肪酸合成中發(fā)揮作用。2012年，Joshua等[6]發(fā)現(xiàn)通過(guò)siRNA技術(shù)沉默妊娠期雌性舌蠅SMPD基因，導(dǎo)致雌性舌蠅的妊娠期延長(zhǎng)，子代數(shù)量和羽化能力降低，子代熱耐受力受損，共生菌減少以及影響子代繁殖力等一系列問(wèn)題。因此，昆蟲(chóng)SMPD基因可能參與昆蟲(chóng)的生殖過(guò)程。然而，關(guān)于SMPD基因在熊蜂上的研究還未見(jiàn)報(bào)道，蘭州熊蜂（Bombus lantschouensis）是我國(guó)良種熊蜂之一，被應(yīng)用于溫室作物授粉[7]。因此，開(kāi)展熊蜂SMPD基因研究，對(duì)該基因在熊蜂中的作用具有重要的指導(dǎo)意義。

前期實(shí)驗(yàn)已通過(guò)PCR擴(kuò)增了SMPD基因片段，并成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pCold-II-SMPD；該載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌后，經(jīng)異丙基-β-D巰基半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)后表明有融合目的蛋白表達(dá)。因此，本研究擬對(duì)蘭州熊蜂SMPD基因原核表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得高量表達(dá)SMPD蛋白，為制備SMPD蛋白的抗血清及進(jìn)一步功能研究奠定基礎(chǔ)。

2 材料與方法

2.1 菌液的活化及其鑒定

pCold-II-SMPD重組質(zhì)粒的BL21（DE3）重組菌由本研究室保存。按照1∶50將含pCold-II-SMPD重組質(zhì)粒的重組菌添加到5 ml含氨芐青霉素（AMP）的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 rpm/min震蕩培養(yǎng)過(guò)夜；提取pCold-IISMPD重組質(zhì)粒（中科瑞泰生物科技有限公司，北京）并用EcoRⅠ、SacⅠ限制性內(nèi)切酶（New England Biolabs，美國(guó)）雙酶切鑒定。

2.2 重組菌IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化

取一管活化后的菌液按照1∶50加到5 mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200 rpm/min振蕩培養(yǎng)；待菌液OD600達(dá)到0.4~0.6時(shí)，冰浴10 min，15℃放置30 min，加入誘導(dǎo)劑IPTG，使其終濃度分別為0、0.1、0.3、0.5、0.7和1.0 mM，放入15℃中誘導(dǎo)24 h，震蕩速度為160 rpm/min。

2.3 重組菌IPTG誘導(dǎo)溫度的優(yōu)化

取一管活化后的菌液按照2.2中的方法進(jìn)行誘導(dǎo)前樣品準(zhǔn)備，IPTG終濃度分別為0、0.1、0.3、0.5、0.7和1.0 mM，分別放入4和10℃中誘導(dǎo)24 h，震蕩速度為160 rpm/min。

2.4 重組菌誘導(dǎo)時(shí)間的優(yōu)化

取一管活化后的菌液按照2.2中的方法進(jìn)行誘導(dǎo)前樣品準(zhǔn)備，根據(jù)確定最適IPTG濃度和最適溫度，以160 rpm/min分別誘導(dǎo)8、16、24、32 h。

菌液誘導(dǎo)結(jié)束后于4℃、12000 rpm/min離心5 min；棄上清液，向菌體沉淀中加入1.5 ml PBS懸浮沉淀，再進(jìn)行上述離心，如此重復(fù)3次進(jìn)行菌體漂洗；按照細(xì)菌蛋白提取試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司，北京）的方法進(jìn)行蛋白提取；將提取獲得的上清和沉淀分別加入上樣緩沖液混勻，100℃煮沸5 min；各取7 μl。通過(guò)12%SDS-PAGE電泳檢測(cè)，考馬斯亮藍(lán)R250染色液染色30 min；最后，用脫色液脫色至條帶清晰，掃描分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 重組質(zhì)粒鑒定

將pCold-II-SMPD重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和SacⅠ雙酶切及電泳后，獲得兩個(gè)大小約為900和4800 bp條帶，與SMPD基因片段和pCold-II質(zhì)粒片段長(zhǎng)度一致（圖1），酶切鑒定結(jié)果表明，所得重組質(zhì)粒為目的重組質(zhì)粒，經(jīng)活化后的菌液可直接用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 pCold-II-SMPD重組質(zhì)粒雙酶切鑒定

3.2 不同溫度與IPTG濃度對(duì)SMPD蛋白表達(dá)量的影響

通過(guò)對(duì)SMPD重組菌進(jìn)行不同溫度與IPTG濃度組合誘導(dǎo)，結(jié)果表明：溫度對(duì)總蛋白的表達(dá)量影響較大，隨著溫度升高，總蛋白表達(dá)量呈遞增的趨勢(shì)；當(dāng)誘導(dǎo)溫度相同時(shí)，不同IPTG濃度對(duì)重組蛋白的表達(dá)量影響較小，經(jīng)比較分析確定該蛋白誘導(dǎo)最優(yōu)的溫度和IPTG濃度組合為10℃和0.1 mM（圖2）。

3.3 不同誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)SMPD蛋白表達(dá)量的影響

將SMPD蛋白以優(yōu)化后的最適溫度和IPTG濃度進(jìn)行不同時(shí)間誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果顯示：誘導(dǎo)溫度為10℃，誘導(dǎo)劑IPTG濃度為0.1 mM時(shí)，誘導(dǎo)時(shí)間在8、16、24和32 h時(shí)該蛋白均有表達(dá)，但在32 h時(shí)表達(dá)量最高。（圖3）。

4 討論

通過(guò)原核表達(dá)獲得大量目的蛋白是深入開(kāi)展基因功能研究的前提，而原核表達(dá)過(guò)程中，蛋白表達(dá)量不僅受目的基因序列的影響，同時(shí)也與表達(dá)菌株、表達(dá)系統(tǒng)、誘導(dǎo)劑IPTG濃度、誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度等因素相關(guān)[8-11]。本研究首次對(duì)熊蜂SMPD基因的原核表達(dá)的誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度及誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)各優(yōu)化條件對(duì)原核表達(dá)的影響程度不同，其中誘導(dǎo)溫度及誘導(dǎo)時(shí)間影響較大，而IPTG濃度影響較小。

在本研究中，隨著IPTG濃度的升高，SMPD蛋白表達(dá)量未出現(xiàn)明顯變化，此結(jié)果與陳雪燕等[12]研究結(jié)果一致。由于IPTG作為原核表達(dá)的誘導(dǎo)劑，具有不被菌體代謝、誘導(dǎo)效果長(zhǎng)久且誘導(dǎo)效率高[13]等優(yōu)點(diǎn)，但是高濃度的IPTG會(huì)對(duì)菌株產(chǎn)生一定的毒害作用，因此，在誘導(dǎo)效果沒(méi)有顯著差異的情況下，選擇0.1 mM為最適誘導(dǎo)劑濃度。原核表達(dá)的誘導(dǎo)溫度不僅影響菌體的生長(zhǎng)，同時(shí)也影響重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性和融合蛋白的表達(dá)水平，本研究在比較4、10和15℃這三個(gè)誘導(dǎo)溫度時(shí)，發(fā)現(xiàn)總蛋白表達(dá)量隨溫度升高呈遞增趨勢(shì)。其中，SMPD目的蛋白表達(dá)量逐漸增高，但與此同時(shí)非目的蛋白的表達(dá)量也明顯增多，表明溫度的增加也促進(jìn)了細(xì)菌內(nèi)其他蛋白的表達(dá)，因此綜合目的蛋白表達(dá)量和表達(dá)特異性，選擇10℃作為最適誘導(dǎo)溫度。

本次實(shí)驗(yàn)中，蘭州熊蜂SMPD基因在各種誘導(dǎo)條件下均以包涵體形式存在，在細(xì)胞破碎后的上清中幾乎未找到目的重組蛋白，而原核表達(dá)過(guò)程中，包涵體蛋白的形成原因是多方面的。造成本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的原因可能是由于昆蟲(chóng)基因利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)，使得該外源基因表達(dá)過(guò)程中對(duì)表達(dá)細(xì)胞產(chǎn)生一定的毒性，從而以不可溶的包涵體形式存在。

本研究明確了蘭州熊蜂SMPD基因原核表達(dá)的最佳誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度及誘導(dǎo)時(shí)間分別為10℃、0.1 mM和32 h。利用優(yōu)化的原核表達(dá)條件，可以獲得大量目的蛋白，為后續(xù)蛋白純化、抗體制備及深入開(kāi)展SMPD基因在蘭州熊蜂表達(dá)特性及功能研究奠定了基礎(chǔ)。

圖2 誘導(dǎo)溫度與誘導(dǎo)劑濃度對(duì)目的蛋白表達(dá)量影響

圖3 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)目的蛋白表達(dá)量影響

[1]Wigle D A,Jurisica I,Radulovich N,et al.Molecular profiling of non-small cell lung cancer and correlation with disease-free survival[J].Cancer Research,2002,62(11):3005-3008.

[2]Horinouchi K,Erlich S,Perl D P,et al.Acid sphingomyelinase deficient mice:a model of types A and B Niemann Pick disease[J]. Nature Genetics,1995,10(3):288-293.

[3]Schneider P B,Kennedy E P.Sphingomyelinase in normal human spleens and in spleens from subjects with Niemann-Pick disease[J].Journal of Lipid Research,1967,8(8):202-209.

[4]高軍，周燦權(quán)，張仁禮，等.靶向SMPD1基因的RNA干擾對(duì)人成纖維細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用[J].中山大學(xué)學(xué)報(bào),2007,28(2):159-164.

[5]Kraut R.Roles of sphingolipids in Drosophila development and disease[J].Journal of Neurochemistry,2011,116(5):764-778.

[6]Benoit J B,Attardo G M,Michalkova V,et al.Sphingomyelinase Activity in Mother's Milk Is Essential for Juvenile Development:A Case from Lactating Tsetse Flies[J].Biology of Reproduction,2012, 87(1):1-10.

[7]周志勇，張紅，梁鋮，等.西方蜜蜂和蘭州熊蜂在設(shè)施桃園的訪花偏好性比較[J].昆蟲(chóng)學(xué)報(bào),2015,58(12):1315-1321.

[8]張勁，郭靄光，豐美福.重組蛋白sHLA-G1的原核表達(dá)與純化[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào),2007,35(8):180-184．

[9]許艷，萬(wàn)敏，程巖，等.重組人白細(xì)胞介素24融合蛋白在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)的影響因素 [J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志,2004,11 (6):391-392．

[10]盧晟曄，王麗穎.大腸桿菌中外源蛋白高效表達(dá)的影響因素及策略研究的新進(jìn)展 [J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2006,10(9):1100-1103.

[11]曹紅，仇燕，王剛.外源基因在大腸桿菌中表達(dá)的優(yōu)化[J].河北師范大學(xué)學(xué)報(bào),2004,28(1):83-85．

[12]陳雪燕，曹新有，張羽.ScMYB原核蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的影響因素研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,40(3):1307-1308.

[13]畢云楓，姜仁鳳，何舒，等.D-乳糖醇代替異丙基-β-D-巰基半乳糖苷對(duì)重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的影響[J].食品科學(xué),2016,37(7): 128-133.

Optimization of inducing conditions for prokaryotic expression of SMPD gene from Bombus lantschouensis

Han Lei1,2,Dong Jie2,Huang Jiaxing2,He Shaoyu1,Wu Jie2
(1 Eastern Bee Research Institute,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201，China;2 Key Laboratory for Insect-Pollinator Biology of the Ministry of Agriculture,Institute of Apicultural Research，Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100093，China)

Bombus lantschouensis is an excellent pollinator for greenhouse crop in China.Sphingomyelin phosphodiesterase（SMPD）is a hydrolase enzyme that is involved in sphingolipid metabolism reactions.To increase the expression level of the SMPD protein in E.coli BL21 (DE3),the prokaryotic expression conditions of inducing temperature,IPTG concentration and incubation time were optimized.Results indicated that inducing temperature and time were the main factors affected the expression level of SMPD protein.However,the concentration of IPTG contributed to the express level very few.The optimized conditions for the highest expression level of the target protein are as follows:inducing temperature at 10℃，IPTG concentration is 0.1 mM and incubation time is 32 h.The current study provides a basic knowledge for studying the role of SMPD protein in Bombus lantschouensis in future.

Bombus lantschouensis;prokaryotic expression;SMPD gene;inducing conditions

韓蕾（1992-），女，在讀碩士，E-mail:hanlei2016@126.com

和紹禹（1952-），男，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail:kmhsy@163.com；吳杰（1962-），男，博士生導(dǎo)師，E-mail:apis@vip.sina.com