邱增鈺，王亞平，李博藝，謝彪，劉國峰，肖冬光*

（1.天津科技大學生物工程學院天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津300457；2.金開生物工程有限公司，四川成都611130；3.尤特爾生物科技有限公司，山東鄒城273500）

溫度對高溫大曲液態(tài)培菌過程菌群結構的影響

邱增鈺1，王亞平1，李博藝1，謝彪2，劉國峰3，肖冬光1*

（1.天津科技大學生物工程學院天津市工業(yè)微生物重點實驗室，天津300457；2.金開生物工程有限公司，四川成都611130；3.尤特爾生物科技有限公司，山東鄒城273500）

選用高溫大曲在30℃、37℃、40℃、43℃和53℃不同溫度條件下液體培養(yǎng)，對培養(yǎng)過程中微生物菌群結構和代謝產(chǎn)物的變化進行了分析。結果表明，較低的培養(yǎng)溫度有利于酵母菌和乳酸菌的生長，而較高的培養(yǎng)溫度有利于耐高溫細菌和霉菌的生長。其中，酵母菌在37℃培養(yǎng)60 h數(shù)量最多，霉菌在53℃培養(yǎng)48 h數(shù)量最多，乳酸菌在37℃培養(yǎng)24 h數(shù)量最多，總細菌在40℃培養(yǎng)24 h數(shù)量最多。從代謝產(chǎn)物的分析結果看，酒精度和總酸含量在37℃時含量最高，乙酸乙酯、總酯含量在30℃時最高，α-氨基酸態(tài)氮含量在53℃時最高。可根據(jù)增強發(fā)酵活力、提高酒度和酯含量等需求，延長不同培養(yǎng)溫度范圍的保持時間。

高溫大曲；菌群結構；代謝產(chǎn)物；液態(tài)培養(yǎng)

QIU Zengyu1,WANG Yaping1,LI Boyi1,XIE Biao2,LIU Guofeng3,XIAO Dongguang1*

(1.Tianjin Key Lab of Industrial Microbiology,College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457, China;2.Jinkai Biological Technology Company,Chengdu 611130,China;3.Youter Bio-Technology Co.,Ltd.,Zoucheng 273500,China)

醬香型白酒是中國白酒的典型香型之一，其“四高一長”（高溫制曲、高溫堆積、高溫發(fā)酵、高溫流酒和長期貯存）的獨特工藝造就了醬香型白酒獨特的風味特征，在世界范圍內(nèi)產(chǎn)生了廣泛的影響[1]。高溫大曲在白酒發(fā)酵過程中具有重要的地位，因其開放型的發(fā)酵工藝、自然接種，讓微生物種類、數(shù)量和消長情況極為復雜[2]，至今尚未完全研究透徹大曲在釀酒發(fā)酵過程中各種微生物的作用機理[3-4]。而其生產(chǎn)工藝的堆積工序，是大曲酒工藝中的獨特方式，堆積發(fā)酵是富集有益微生物、酶類的重要工序，也是在多種酶類共同作用下合成風味物質和風味前體物質的重要過程[5]。據(jù)多年的生產(chǎn)經(jīng)驗，溫度是培菌過程中的主要控制指標，大多通過堆積厚度、大小、形狀和室溫來控制，一般收堆溫度控制在28～32℃，堆積發(fā)酵56～72 h，局部堆積溫度高達54.6～58.5℃，所產(chǎn)酒醬香比較突出[6]。近年來，有許多關于醬香型白酒堆積過程微生物演替規(guī)律和代謝產(chǎn)物分析的報道，如張榮[7]從高溫大曲中篩選出三株產(chǎn)醬香功能細菌，并發(fā)現(xiàn)55℃高溫環(huán)境是菌株BL-L1發(fā)酵產(chǎn)生醬香香氣的重要條件；王貴軍等[8]對醬香型白酒酒醅堆積和窖內(nèi)發(fā)酵過程中微生物、理化性質、工藝研究進展等方面進行了總結，得出窖內(nèi)發(fā)酵上、中、下層次就的風格不同，上層產(chǎn)的基酒醬味突出，下層酒窖香突出的理論；黃永光等[9]對醬香型白酒生產(chǎn)堆積發(fā)酵過程酒醅中的酵母菌進行分離、形態(tài)學初篩和鑒定分析，從堆積酒醅中共分離鑒定出釀酒酵母，拜氏接合酵母，膠紅酵母等屬種酵母并對發(fā)酵性能及其發(fā)酵代謝風味成分貢獻進行研究；申孟林等[10]依據(jù)大曲原料和制作工藝，對大曲中微生物的來源、主要微生物類群以及各類微生物的主要功能進行分析。在堆積過程中，由于各處物料溫度、濕度、供氧的差異，導致了釀酒微生物及其代謝產(chǎn)物的多樣性。在研究微生物菌群結構和代謝時不同取樣點微生物的種類和代謝產(chǎn)物相差很大，所得的結果各不相同，對生產(chǎn)的指導意義有限。

由于不同溫度對高溫大曲培菌過程菌群結構及代謝產(chǎn)物的影響不同，收堆溫度為28～32℃，局部堆積溫度高達54.6～58.5℃，高溫大曲堆積發(fā)酵時間一般為56～72 h，獲得培菌成熟醅（即酒精度不再變化），因此該文通過采用液態(tài)培菌法，選取30℃、37℃、40℃、43℃和53℃條件下培養(yǎng)72 h獲得培菌液，并分析培養(yǎng)過程中各個時間點下霉菌、酵母菌、細菌和乳酸菌的菌群結構[11]以及代謝產(chǎn)物的變化，總結高溫大曲不同培菌溫度下菌群結構的演替規(guī)律，觀察代謝產(chǎn)物與菌群結構的對應關系，為醬香型白酒高溫堆積工藝的改進和完善提供一些理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

高粱（含淀粉63.71%）：產(chǎn)地東北；醬香大曲：貴州國臺酒業(yè)有限公司；液化酶（酶活2×104U/mL）：丹麥諾維信公司。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

（1）馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，氯霉素100 μg/mL，瓊脂2%。

（2）酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：酵母浸粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，氯霉素100 μg/mL，瓊脂2%。

（3）MRS培養(yǎng)基（乳酸細菌瓊脂培養(yǎng)基）：蛋白胨10g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，檸檬酸氫二銨2 g/L，葡萄糖20 g/L，吐溫-80 1 mL/L，乙酸鈉5 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，硫酸鎂0.58 g/L，硫酸錳0.25 g/L，放線菌酮25 μg/mL，pH 6.2～6.6，瓊脂2%。

（4）LB培養(yǎng)基（細菌基礎瓊脂培養(yǎng)基）：酵母浸粉5g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，放線菌酮25 μg/mL，瓊脂2%。

1.2 儀器與設備

UVmini-1240分光光度計：島津儀器（蘇州）有限公司；Agilent 7890B氣相色譜儀、Agilent HP-INNOWAX色譜柱（30 m×320 μm×0.25 μm）：美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高溫大曲培菌液制備方法

取高粱粉20 g，加入80 mL的水和16 μL液化酶，攪拌均勻，加熱至85～90℃，液化1 h。在0.1 MPa、121℃下糊化30 min，冷卻至30℃，加入5 g的高溫大曲，補水至120 mL，混勻，在不同溫度下培菌72 h，培菌溫度及升溫方式見表1。培菌過程每12 h取樣分析，培養(yǎng)72 h為培菌成熟醅。

表1 不同溫度培菌控制方式Table 1 Control modes of microbial culture at different temperature

1.3.2 微生物菌群計數(shù)

（1）平板菌落計數(shù)法。在無菌操作下，將三角瓶中培菌液搖勻，取1 mL菌液進行10倍稀釋法，稀釋到合適的濃度，取100 μL加入裝有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，涂布均勻，同一稀釋度操作三個平行樣品，倒置培養(yǎng)。培養(yǎng)一段時間后，取平板生長數(shù)量在20～100之間的平板進行計數(shù)，三個平行數(shù)據(jù)取平均值，絕對誤差小于5%。

（2）霉菌用PDA培養(yǎng)基[12]，酵母菌用YPD培養(yǎng)基[13]，乳酸菌用MRS培養(yǎng)基[14]，總細菌數(shù)用LB培養(yǎng)基[15]。

1.3.3 主要理化指標測定

培菌液酒精度的測定：將培菌成熟醅進行蒸餾，取100mL蒸餾液，用酒精計法測量[16]。還原糖測定：菲林滴定法[17]。α-氨基酸態(tài)氮測定：茚三酮法[18]?？偹釡y定：酸堿滴定指示劑法[19]?？傰y定：酸堿滴定指示劑法[19]。

1.3.4 主要風味物質測定

取培菌蒸餾液進行氣相色譜測定：氣相色譜檢測條件：Agilent HP-INNOWAX色譜柱（30 m×320 μm×0.25 μm）；載氣為高純氮氣（純度＞99.999%）；柱流速為0.8 mL/min；進樣口溫度200℃；檢測器溫度150℃；程序升溫：起始溫度50℃保持8 min，以5℃/min升至150℃，保持15 min；進樣體積為1 μL；分流進樣，分流比為10∶1。

2 結果與分析

2.1 高溫大曲不同溫度下培菌過程微生物菌群結構分析

高溫大曲培菌過程中的微生物種類很多，培菌過程中微生物菌群的演替規(guī)律對酒質的好壞和風味物質的含量有著很大的影響。由于各種微生物生長與代謝的最適溫度不同，通過調(diào)節(jié)溫度即可以調(diào)節(jié)不同微生物的比例和動態(tài)變化，進而調(diào)節(jié)風味物質的比例和酒質。白酒發(fā)酵過程中的主要功能菌群為霉菌、酵母菌、細菌，其中乳酸菌對于平衡各類微生物的生長和代謝有很大影響，所以同時對高溫大曲不同培菌溫度下乳酸菌的演替規(guī)律進行分析。

2.1.1 30℃條件下培菌過程中菌群結構的變化

高溫大曲30℃條件下培菌過程中霉菌、酵母菌、乳酸菌和總細菌數(shù)的變化情況結果見圖1。由圖1可知，霉菌菌量從培養(yǎng)開始逐漸減少，在36h左右菌落數(shù)幾乎為零，分析原因，可能是由于霉菌為好氧菌[20]，當酵母菌和細菌生長較快，使培養(yǎng)液中的含氧量很快耗盡導致霉菌死亡。酵母菌在60h達到峰值1.0×108CFU/mL（菌數(shù)對數(shù)值為8.00）。乳酸菌數(shù)和總細菌數(shù)在24h達到峰值，其含量分別為1.4×108CFU/mL（菌數(shù)對數(shù)值8.15）、1.8×108CFU/mL（菌數(shù)對數(shù)值為8.26），此后其數(shù)量有所減少，乳酸菌所占比重增加，分析原因乳桿菌屬是發(fā)酵中后期的絕對優(yōu)勢菌屬，是乳酸的主要產(chǎn)生菌屬[21]。

圖1 高溫大曲30℃培菌過程中微生物數(shù)量變化Fig.1 Changes of microbial count at 30℃during high temperature Daqu cultivation

2.1.2 37℃條件下培菌過程中菌群結構的變化

高溫大曲37℃條件下培菌過程中霉菌、酵母菌、乳酸菌和總細菌數(shù)的變化情況結果見圖2。由圖2可知，霉菌菌落的變化規(guī)律與30℃培菌時差別不大。酵母菌在60 h達到峰值3.1×108CFU/mL（菌數(shù)對數(shù)值為8.49），明顯高于30℃培養(yǎng)時的酵母菌量。乳酸菌和總細菌數(shù)在24h量達到峰值，分別為5×108CFU/mL（菌數(shù)對數(shù)值8.90）和1.1×109CFU/mL（菌數(shù)對數(shù)值為9.04），然后逐漸減少，其中酵母菌、乳酸菌和細菌總數(shù)的峰值數(shù)明顯高于30℃培養(yǎng)時的菌數(shù)峰值數(shù)。

圖2 高溫大曲37℃培菌過程中微生物數(shù)量變化Fig.2 Changes of microbial count at 37℃during high temperature Daqu cultivation

2.1.3 高溫大曲40℃條件下培菌過程中菌群結構的變化

高溫大曲40℃條件下培菌過程中霉菌、酵母菌、乳酸菌和總細菌數(shù)的變化情況結果見圖3。由圖3可知，霉菌菌數(shù)從培養(yǎng)開始越來越少，在60h左右菌落數(shù)幾乎為零，其變化規(guī)律與30℃、37℃大致相同；酵母菌在60h達到峰值1.0×108CFU/mL（菌數(shù)對數(shù)值為8.00），其菌落數(shù)與30℃時相當，但比37℃有所減少；乳酸菌和總細菌菌落數(shù)在24 h達到峰值，分別為3×108CFU/mL（菌數(shù)對數(shù)值為8.48）和2.6×109CFU/mL（菌數(shù)對數(shù)值為9.42），其中乳酸菌菌落數(shù)比37℃時有所減少，而總細菌菌落數(shù)比37℃時有所增加。

圖3 高溫大曲40℃培菌過程中微生物數(shù)量變化Fig.3 Changes of microbial count at 40℃during high temperature Daqu cultivation

2.1.4 高溫大曲43℃條件下培菌過程中菌群結構的變化

高溫大曲43℃條件下培菌過程中霉菌、酵母菌、乳酸菌和總細菌數(shù)的變化情況結果見圖4。由圖4可知，霉菌菌量在前12 h有所增加，12 h至48 h有所減少，48 h后菌落數(shù)又開始增加，至72 h達最高值，為培養(yǎng)開始時的3.8倍。霉菌菌量有所增長，可能是由于培養(yǎng)溫度較高，其他菌群繁殖速度減慢或停止生長，耗氧量減少，所以霉菌繁殖增加。酵母菌在24 h時有所減少，在36 h后又開始增加，至60 h達到峰值2.8×107CFU/mL（菌數(shù)對數(shù)值為7.45）。分析原因，可能是升溫階段，許多非耐高溫的酵母菌逐漸減少，耐高溫的酵母菌凸顯生長優(yōu)勢，開始生長繁殖，所以43℃時酵母菌數(shù)峰值延遲。乳酸菌和總細菌菌落數(shù)在24h達到峰值，分別為1×108CFU/mL（菌數(shù)對數(shù)值為8.00）和1.1×109CFU/mL（菌數(shù)對數(shù)值為9.04），后隨之減少，其中乳酸菌和總細菌菌落數(shù)較40℃時有所減少。

圖4 高溫大曲43℃培菌過程中微生物數(shù)量變化Fig.4 Changes of microbial count at 43℃during high temperature Daqu cultivation

2.1.5 高溫大曲53℃下培菌過程中菌群結構的變化

高溫大曲53℃下培菌過程中霉菌、酵母菌、乳酸菌和總細菌數(shù)的變化情況結果見圖5。由圖5可知，霉菌菌量前12h有所增加，在12h后開始減少，36h后又開始增加，后又開始減少。而酵母菌在12 h后開始減少，在48 h達到峰值3.4×103CFU/mL（菌數(shù)對數(shù)值3.53）后幾乎為零，分析原因，可能是53℃培養(yǎng)時，只有升溫培養(yǎng)階段的前24 h酵母菌菌落數(shù)增加，培養(yǎng)至36h后培養(yǎng)溫度逐漸升高到達53℃，由于培養(yǎng)溫度過高，酵母菌開始大量死亡，48 h已無活的酵母菌。乳酸菌在12 h達到峰值8.3×107CFU/mL（菌數(shù)對數(shù)值7.92）后隨之減少，在36 h之后幾乎為零，由于培養(yǎng)溫度逐步升高，乳酸菌開始死亡?？偧毦鋽?shù)在12 h量達到峰值3.3×108CFU/mL（菌數(shù)對數(shù)值8.52）后遂漸減少，在培養(yǎng)過程中隨著溫度和酸度的升高，其細菌數(shù)量逐漸減少，后期生存的細菌大部分為耐高溫耐酸細菌[22-24]，所以總細菌數(shù)量較其他四個溫度明顯減少。

圖5 醬香大曲53℃培菌過程中微生物數(shù)量變化Fig.5 Changes of microbial count at 53℃during high Moutai flavor Daqu cultivation

2.2 高溫大曲不同溫度下培菌過程理化指標分析

2.2.1 不同溫度培菌液的理化指標

（1）不同溫度培菌成熟醅酒精度情況分析

圖6 不同培養(yǎng)溫度對培菌液酒度的影響Fig.6 Effect of different culture temperature on alcohol content of fermentation broth

高溫大曲在不同溫度下培菌72 h培菌液的酒精度檢測結果見圖6。由圖6可知，30℃、40℃、43℃條件下酒精度差別不大，在37℃時酒精度最高，53℃時其酒精度幾乎為零。分析原因，37 ℃時酵母菌數(shù)量最多，因此酒精度最高。

（2）不同溫度培菌液α-氨基酸態(tài)氮情況分析

高溫大曲在不同溫度下培菌液的α-氨基氮含量檢測結果見圖7。由圖7可知，在30℃、37℃、40℃、43℃條件下培養(yǎng)時，培養(yǎng)24 h時的α-氨基酸態(tài)氮含量最高，其含量范圍為140～180 mg/L；而53℃培養(yǎng)時，在72 h時的α-氨基酸態(tài)氮含量最高，達到226 mg/L。分析原因，蛋白酶的最適作用溫度在40℃左右，37℃培養(yǎng)時，α-氨基酸態(tài)氮在24 h后逐漸下降，主要是37℃培養(yǎng)時微生物的生長總量最多，微生物的生長消耗了較多的α-氨基酸態(tài)氮；53℃培養(yǎng)時，微生物的生長總量最少，微生物的消耗的α-氨基酸態(tài)氮也最少，至72 h時積累了較多的α-氨基酸態(tài)氮。

圖7 不同培養(yǎng)溫度對培菌液α-氨基氮含量的影響Fig.7 Effect of different culture temperature on α-amino nitrogen content of fermentation broth

（3）不同溫度培菌成熟醅總酸情況分析

高溫大曲在不同溫度下培菌液總酸含量檢測結果見圖8。由圖8可知，37℃時酸度最高，其次為40℃和30℃，53℃時，總酸含量最少，約為37℃時的1/9。分析原因，在30℃、37℃、40℃培菌液中，總酸含量較大，說明嗜酸菌生長溫度更適合30～40℃；而37℃時酸度最高，與之對應的乳酸菌含量最多；53℃培養(yǎng)時，24h后乳酸菌大量死亡，因而其總酸含量較少。

圖8 不同培養(yǎng)溫度對培菌液總酸含量的影響Fig.8 Effect of different culture temperature on total acid content of fermentation broth

（4）不同溫度培菌成熟醅總酯情況分析

高溫大曲在不同溫度下培菌液總酯含量檢測結果見圖9。由圖9可知，在30℃時，總酯含量最高，其次為53℃和40℃，37℃時酯含量最低。分析原因，由于酵母產(chǎn)酯適合在較低溫度，故30℃時酯含量高；化學合成溫度越高越快，因此53℃時，酯含量也較高；40℃左右是酯化酶合成最適溫度，所以40℃時酯的含量中等。

圖9 不同培養(yǎng)溫度對培菌液總酯含量的影響Fig.9 Effect of different culture temperature on total ester content of fermentation broth

2.2.2 高溫大曲不同培菌溫度下培菌成熟醅風味物質分析

高溫大曲不同培菌溫度下培養(yǎng)72 h后培菌成熟醅中常見風味物質的分析數(shù)據(jù)檢測結果見表2。由表2可知，30℃培菌成熟醅中的乙酸乙酯含量到達210 mg/L左右，明顯高于其他溫度時的含量，說明乙酸乙酯合成適宜溫度為30℃，在37℃培菌培菌成熟醅中乙酸含量高達150mg/L，說明乙酸合成適宜溫度為37℃，在30℃、37℃、40℃、43℃時高級醇中異丁醇、異戊醇、苯乙醇的含量差別不大，乙酸異丁酯只有30℃時有少量含量，53℃培菌成熟醅中常見風味物質含量較低。

表2 主要風味物質含量分析結果Table 2 Results of main flavor substance contents analysis mg/L

3 結論

從不同溫度下培菌過程微生物菌群結構來看，實驗結果表明，霉菌為好氧菌，在43℃培養(yǎng)12 h時菌落數(shù)最多。酵母菌在37℃培養(yǎng)至60 h時菌落數(shù)最多。乳酸菌在37℃培養(yǎng)至24 h時菌落數(shù)最多。細菌在40℃培養(yǎng)至24 h時菌落數(shù)最多。

從理化指標來看，酒精度在37℃培養(yǎng)時最高，53℃培養(yǎng)時酒精度幾乎為零。比較不同培養(yǎng)時間α-氨基酸態(tài)氮的變化情況，24 h時培養(yǎng)溫度為37℃時α-氨基氮含量最高，48 h時培養(yǎng)溫度為40℃時α-氨基酸態(tài)氮含量最高，72 h時培養(yǎng)溫度為53℃時α-氨基酸態(tài)氮含量最高。從總酸情況來看，37℃培養(yǎng)時酸度最高，53℃培養(yǎng)時酸度最低。從總酯含量看，30℃時總酯含量最高，其次是53℃和40℃。從常見風味物質含量看，30℃時，風味物質的種類和總量都最多，隨著培養(yǎng)溫度的上升，風味物質總量逐漸下降。53℃時，非耐高溫菌逐漸失活，常見風味物質含量較低，但耐高溫菌的生長繁殖，產(chǎn)生特殊的醬香風味成分，分析原因，高溫培養(yǎng)環(huán)境，是芽孢桿菌富集，芽孢桿菌屬細菌可以產(chǎn)生吡嗪、芳香族類、有機酸類物質，它們可能對白酒的風味產(chǎn)生重要作用[25]。

從實驗結果來看，溫度對高溫大曲培菌過程菌群結構及代謝產(chǎn)物有很大影響，如果要提高霉菌量，以生產(chǎn)多種釀酒酶系，就應適當加強供氧量，提高堆積的松散度或減少堆積厚度；如要增強發(fā)酵活力，提高酒度和酯含量，就應適當延長溫度在30～37℃范圍內(nèi)的時間，以促進酵母菌的生長與代謝，并合成較多的乙酸酯類物質；如要提高酸度和乳酸酯的含量，就應適當延長溫度在37～40℃范圍內(nèi)的時間，以促進乳酸菌等產(chǎn)酸菌群的生長。如要增加風味前體物質α-氨基氮的含量，促進醬香風味物質的形成，就應適當提高堆積厚度，增加43～53℃的高溫區(qū)域，從而提高耐高溫菌群的數(shù)量。

4展望

微生物在白酒發(fā)酵過程中發(fā)揮著至關重要的作用，生物多樣性與后期發(fā)酵風味的產(chǎn)生密切相關，各菌種相互平衡、協(xié)同作用，有利于發(fā)酵的進行。因此研究高溫大曲在堆積培菌過程中的菌群結構變化，對提高酒質，穩(wěn)定醬香白酒品質有著重要的影響，也為實現(xiàn)高溫大曲堆積培菌過程中微生物的可控性提供依據(jù)。

由于高溫大曲培菌過程中微生物種類繁多，結構復雜，受環(huán)境影響大，其不可控性較高，了解其微生物的生長規(guī)律性，即可獲得較為成熟的培菌方式，逐漸揭開醬香白酒主要風味物質的神秘面紗。探究微生物生長規(guī)律，對醬香白酒具有非常重要的學術意義和應用價值。

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TS261.1

0254-5071（2017）05-0030-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.007

2016-12-03

國家高技術研究發(fā)展計劃‘863計劃’項目（2012AA022108）；中國白酒3C計劃項目（1400040024）

邱增鈺（1992-），女，碩士研究生，研究方向為發(fā)酵工程。

*通訊作者：肖冬光（1954-），男，教授，博士，研究方向為發(fā)酵工程。