張霽紅，李明澤，曾朝珍，康三江，張海燕，張永茂*

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，甘肅蘭州730070）

優(yōu)勢醋酸菌株的篩選鑒定及乙醇脫氫酶活性研究

張霽紅，李明澤，曾朝珍，康三江，張海燕，張永茂*

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，甘肅蘭州730070）

為滿足蘋果醋液態(tài)深層發(fā)酵的需要，從果渣、泥土中選育出生長良好、遺傳穩(wěn)定的較優(yōu)醋酸菌株，實(shí)現(xiàn)高效率、高產(chǎn)量的蘋果醋中試生產(chǎn)。經(jīng)初篩、復(fù)篩、產(chǎn)酸試驗(yàn)、遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)、生理生化試驗(yàn)和16S rDNA序列分析鑒定，優(yōu)選菌株Y010鑒定為巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）。進(jìn)一步研究該菌株在蘋果醋發(fā)酵過程中乙醇脫氫酶（ADH）活性與產(chǎn)酸量、產(chǎn)酸速率的關(guān)系。結(jié)果表明：該菌株在醋酸發(fā)酵48 h時酶活較高，達(dá)到4.62 U/mL，產(chǎn)酸速率最大達(dá)到0.51 g/（L·h），發(fā)酵120 h總酸含量最高達(dá)到53.12 g/L，其ADH酶活與產(chǎn)酸速率變化趨勢一致。

醋酸菌屬；篩選；16S rDNA；醇脫氫酶；產(chǎn)酸速率

ZHANG Jihong,LI Mingze,ZENG Chaozhen,KANG Sanjiang,ZHANG Haiyan,ZHANG Yongmao*
(Agricultural Product Storage and Processing Institute,Gansu Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730070,China)

果醋發(fā)酵過程中菌種是影響品質(zhì)的重要因素之一[1]?，F(xiàn)代工業(yè)采用液態(tài)深層發(fā)酵，常用醋酸菌株為食醋菌種巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）AS1.41和滬釀1.01巴氏醋酸桿菌（Acetobacterpasteurianus），不僅產(chǎn)酸能力低、酒精耐受力差，而且發(fā)酵果醋形成的風(fēng)味不佳，同時，醋酸菌易變異、死亡，不易保存，優(yōu)良的果醋發(fā)酵菌種很難實(shí)現(xiàn)工業(yè)化[2-3]。目前，醋酸菌的篩選、馴化多采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)和分子生物學(xué)重組技術(shù)，特別是在果醋專用醋酸菌種篩選方面，研究較多，但達(dá)到市場化、工業(yè)化的菌種卻很少[4-5]。張蕾等[6]對處于對數(shù)期的醋酸菌株C1-0進(jìn)行紫外線誘變，獲得三株高產(chǎn)醋酸的醋酸菌株C1-11、C1-27、C1-30，比初始菌株C1-0產(chǎn)酸量分別提高4.5%、8.6%、2.6%，且遺傳穩(wěn)定性較好。鄧洪鈞等[7]從醋醅中篩選具有較好耐溫特性的醋酸菌WL021-1，并且通過常溫等離子體誘變，使得發(fā)酵周期縮短約7h，發(fā)酵效率提高約10%。TRECKJ等[8]研究表明，耐高酸醋酸菌的乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）活力遠(yuǎn)高于低濃度生長產(chǎn)酸的菌株。NAKANO S等[9]利用基因工程技術(shù)分離出醋酸菌中主要由乙酸誘導(dǎo)合成的AatA蛋白質(zhì)，過量表達(dá)的AatA蛋白質(zhì)使醋酸菌細(xì)胞內(nèi)的醋酸濃度維持在較低水平，有效提高了菌株的耐酸性和產(chǎn)酸速率。

本研究從果園泥土、腐爛蘋果中分離篩選優(yōu)良醋酸菌株，在初篩、復(fù)篩等傳統(tǒng)醋酸菌種篩選方法基礎(chǔ)上，結(jié)合生理生化試驗(yàn)及16SrDNA鑒定確定優(yōu)選菌株的種屬。并進(jìn)一步研究該菌株在蘋果醋醋酸發(fā)酵過程中乙醇脫氫酶（ADH）活性以及其與醋酸菌株產(chǎn)酸能力的關(guān)系，希望得到酶活力較高、遺傳穩(wěn)定性好、產(chǎn)酸能力較高的菌株，為蘋果醋工業(yè)化生產(chǎn)中優(yōu)良醋酸菌株的選育提供理論依據(jù)[10]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種來源及實(shí)驗(yàn)材料

醋酸菌株CICC20056、CICC 7009：中國微生物菌種保藏中心；滬釀1.01：上海市釀造科學(xué)研究所。土壤樣品取自甘肅省慶陽市西峰區(qū)仕社村蘋果園樹冠下0～20 cm處，腐爛蘋果隨機(jī)取樣于甘肅省慶陽市西峰區(qū)仕社村蘋果園自然下落的腐爛蘋果。

1.1.2 主要試劑

無水乙醇、碳酸鈣、氯化鐵、氫氧化鈉、鐵氰化鉀、硫酸鐵、十二烷基磺酸鈉、葡萄糖、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、檸檬酸、磷酸等（均為分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；酵母膏、瓊脂（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；Triton X-100：北京拜爾迪生物技術(shù)公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，滅菌后冷卻至50℃，加入體積分?jǐn)?shù)為3%的無水乙醇。

分離培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，瓊脂18 g/L，碳酸鈣15 g/L，無水乙醇體積分?jǐn)?shù)3%。

斜面保藏培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母粉10 g/L，瓊脂18 g/L，碳酸鈣10 g/L，無水乙醇體積分?jǐn)?shù)3%。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母粉15 g/L，磷酸二氫鉀0.5 g/L，硫酸鎂0.5 g/L，pH 6.5。

產(chǎn)酸培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L，酵母粉15 g/L，經(jīng)滅菌冷卻后加入體積分?jǐn)?shù)7%無水乙醇，分裝至250 mL三角瓶，每瓶30mL。

分離培養(yǎng)基和斜面保藏培養(yǎng)基經(jīng)過165℃、30 min干熱滅菌，待溫度降至70℃時加入碳酸鈣和無水乙醇。其他培養(yǎng)基121℃，20 min高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S-CW電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；ZHJH-C1112B超凈工作臺、ZWY-2102恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TGL-16MC冷凍離心機(jī)：長沙維爾康湘鷹離心機(jī)有限公司；HH-S4電熱恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；UV2400紫外可見分光光度計：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株篩選步驟[11]

（1）初篩

稱取10.0 g土樣或腐爛蘋果樣，置于90.0 mL帶有玻璃珠的無菌水中，搖床振蕩30 min，取1.0 mL菌液至基礎(chǔ)培養(yǎng)基（裝液量30 mL/250 mL），30℃、200 r/min條件下富集培養(yǎng)48h后，取出增值液用無菌水稀釋至10-5、10-6、10-7濃度，取各濃度稀釋液0.2mL，涂布法接種于分離培養(yǎng)基上，30℃恒溫培養(yǎng)72 h后，挑選透明圈較大的菌落純化后轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)保存。對保存后的單菌落菌株在碳酸鈣平板培養(yǎng)基上進(jìn)一步分離，根據(jù)其透明圈直徑與菌落直徑之比的HC值（HC=透明圈直徑/菌落直徑）大小進(jìn)行初篩。

（2）復(fù)篩

將初篩菌種分別接種于產(chǎn)酸培養(yǎng)基上，每株3次重復(fù)，在30℃靜置恒溫培養(yǎng)120 h后，測定總酸產(chǎn)量（以乙酸計）并比較。

（3）優(yōu)選菌株馴化試驗(yàn)

將優(yōu)選出的菌株分別接種于酒精含量為6%vol的蘋果酒中進(jìn)行醋酸發(fā)酵，發(fā)酵溫度30℃、150 r/min，分別振蕩培養(yǎng)1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d，每天取樣檢測其醋酸產(chǎn)量，從中篩選出產(chǎn)酸性能良好的醋酸菌。

（4）遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)

將篩選出的醋酸菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)（傳4代），每一代活化后二級種子液接種于酒精含量為6%vol的蘋果酒中進(jìn)行醋酸發(fā)酵，30℃、150r/min振蕩培養(yǎng)6d，測定醋酸產(chǎn)量，并觀察每次傳代后菌株的菌落特征、個體形態(tài)特征、以及在蘋果酒中的產(chǎn)酸量和變化。

1.3.2 菌株鑒定

（1）生理生化鑒定：參見張紀(jì)忠的《微生物分類學(xué)》[12]和周德慶的《微生物學(xué)教程》[13]。

（2）16S rDNA鑒定[14]

純種菌株Y010轉(zhuǎn)接于斜面送工業(yè)微生物菌種保藏中心進(jìn)行16SrDNA鑒定，檢測方法參考“細(xì)菌16S rDNA檢測方法”。鑒定用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取目標(biāo)菌株Y010的總DNA，然后用設(shè)計合成的通用引物和高保真DNA聚合酶進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerasechainreaction，PCR）擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行DNA測序，并與數(shù)據(jù)庫中已知細(xì)菌比較獲得樣品種屬信息，選取近似菌種序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 乙醇脫氫酶活性研究

（1）粗酶液制備[15]

取相應(yīng)時間的發(fā)酵液（100 mL），于4℃，8 000 r/min條件下離心10 min，用50 mmol/L（pH 5.8）的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌2次，然后重新懸浮于該緩沖液中（0.1 g濕菌體/3 mL PBS），在冰浴下進(jìn)行超聲破碎，超聲功率240 W，破碎30 s暫停30 s，總時間10 min，破碎液作為粗酶液待用。

（2）乙醇脫氫酶（ADH）活性的測定[16]

ADH酶活的測定：參照WOOD氏法[11]，取0.5 mL Mcllvaine緩沖液（pH 4.0），1.0 mol/L乙醇（乙醛）溶液0.1 mL，粗酶液0.1 mL，6%Triton X-100 0.1 mL于10 mL比色管中，25℃保溫5 min后加入0.1 mol/L鐵氰化鉀溶液0.2 mL，在25℃條件下放置反應(yīng)5 min（同時做空白對照），然后加入硫酸鐵-Dupanol溶液0.5 mL終止反應(yīng)，25℃下放置20 min，加入3.5 mL蒸餾水混合后，用紫外可見分光光度計測定波長660 nm條件下的光密度值。以25℃、pH 4.0條件下，1 min氧化1 μmol乙醇的酶量為1個酶活力單位；4.0光密度值等

于氧化1 μmol乙醇。

酶活性（U/mL）=A660nm×1/4 ×1/5 ×1/酶液（mL）×稀釋倍數(shù)1.3.4指標(biāo)測定及計算方法

總酸（以乙酸含量計）測定：采用酸堿滴定法；酒精含量測定：蒸餾瓶法。

醋酸產(chǎn)量（g/L）=[（CNaOH×V）/2] ×60

式中：CNaOH表示滴定的NaOH濃度，mol/L；V表示消耗NaOH的體積，mL；2表示取樣量，mL；60為乙酸摩爾質(zhì)量，g/mol。

產(chǎn)酸速率=Δ產(chǎn)酸量（g/L）/Δh

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離純化初篩結(jié)果

經(jīng)過富集培養(yǎng)、分離純化和產(chǎn)酸定性試驗(yàn)，共獲得20個單菌株。從腐爛蘋果中分離篩選出10個菌株編號為X001～X010，從蘋果園泥土中分離篩選出10個菌株編號為Y001～Y010，其HC值如表1所示。

表1 菌株初篩結(jié)果Table 1 Preliminary screening results of strains

根據(jù)其變色圈直徑與菌落直徑之比的HC值大小，對形態(tài)一致的單菌落進(jìn)行初篩，由表1中可知，菌株X004、X005、X007、X008、X009、Y010、Y002、Y004的HC值較大，其值范圍在2.67～3.38。

2.2 復(fù)篩結(jié)果

對初篩出的菌株X004、X005、X007、X008、X009、Y010、Y002、Y004進(jìn)一步進(jìn)行產(chǎn)酸試驗(yàn)復(fù)篩，以菌株滬釀1.01、7009、20056為對照，其結(jié)果如圖1所示。

圖1 各菌株總酸產(chǎn)量Fig.1 Total acid production of different strains

由圖1可知，菌株Y010、X004、X009的產(chǎn)酸量相對較高，其產(chǎn)酸量分別為40.12 g/L、35.48 g/L、35.02 g/L，其中菌株Y010的產(chǎn)酸量高于對照菌株（其中滬釀1.01為39.12 g/L，7009為38.26g/L，20056為35.56g/L）。因此菌株Y010、X004、X009為優(yōu)選菌株。

2.3 優(yōu)選菌株馴化試驗(yàn)結(jié)果

圖2 優(yōu)選菌株發(fā)酵過程中醋酸產(chǎn)量變化Fig.2 Acetic acid production change of the dominate strains in fermentation process

由圖2可知，在整個發(fā)酵過程中，醋酸產(chǎn)量隨時間延長呈增大趨勢，發(fā)酵前96 h醋酸產(chǎn)量迅速增加，96 h后醋酸產(chǎn)量增長速度減慢，但總體酸含量增加。菌株Y010從發(fā)酵48 h后產(chǎn)酸速率和產(chǎn)酸量增加幅度大于菌株X004、X009和對照菌株滬釀1.01，故優(yōu)選菌株在蘋果醋發(fā)酵液中產(chǎn)酸量較高，可作為蘋果醋發(fā)酵菌株進(jìn)一步研究。

2.4 遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

優(yōu)選菌株Y010、X009、Y010以及對照菌株1.01在蘋果醋醋酸發(fā)酵中連續(xù)培養(yǎng)4代后，產(chǎn)酸量結(jié)果如下（每代相同條件下培養(yǎng)第6天測總酸含量）。

表2 連續(xù)培養(yǎng)4代后的穩(wěn)定性Table 2 Stability of continuous culture of four generations

由表2可知，經(jīng)4代遺傳穩(wěn)定性培養(yǎng)后，菌株X004、X009產(chǎn)酸量和酒精轉(zhuǎn)化率都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，只有菌株Y010產(chǎn)酸量和酒精轉(zhuǎn)化率隨傳代次數(shù)的遞增呈微上升趨勢，整個變幅在1%內(nèi)，且產(chǎn)酸量和酒精轉(zhuǎn)化率大于對照菌株，表明其遺傳穩(wěn)定性良好，產(chǎn)酸量較高。

2.5 菌種鑒定

2.5.1 細(xì)胞形態(tài)、菌落形態(tài)

優(yōu)選菌株Y010的電鏡掃描圖及在平板上的鈣溶圈分別見圖3和圖4。

圖3 優(yōu)選菌株Y010電鏡掃描圖Fig.3 Electron micrographs of the dominate strain Y010

圖4 優(yōu)選菌株Y010在平板上的鈣溶圈Fig.4 Dissolved calcium circle of dominate strain Y010 on the tablet

由圖3和圖4可知，優(yōu)選菌株Y010菌落圓形，表面濕潤光滑、邊緣整齊、小凸起、碳酸鈣溶解圈明顯，細(xì)胞形態(tài)G-，菌體呈短桿狀，無芽孢，（0.8～1.0）μm×（1.5～2.5）μm，單個或成堆排列，有黏液物質(zhì)分布。

2.5.2 生理生化特征

對菌株Y010進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，測定結(jié)果見表3。

表3 菌株Y010生理生化試驗(yàn)測定結(jié)果Table 3 Determination results of physiological and biochemical test of strain Y010

由表3可知，其生理生化試驗(yàn)結(jié)果與伯杰細(xì)菌手冊中醋桿菌屬中巴氏醋酸桿菌的生理生化特征相近[17]。

2.5.3 16S rDNA鑒定

所得16S rDNA序列在NGBI網(wǎng)站經(jīng)序列對比，挑選與之有較高同源性的菌株16S rDNA序列，采用MEGA5.0軟件，鄰位連接法顯示菌株產(chǎn)酸細(xì)菌與相關(guān)種的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行1 000次的相似度重復(fù)計算，圖中發(fā)育樹節(jié)點(diǎn)只顯示Bootstrap值＞50%，上標(biāo)的“T”表示模式菌株，菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果見圖5。

圖5 細(xì)菌Y010的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain Y010 based on 16S rDNA gene sequence

由圖5可知，在系統(tǒng)發(fā)育樹上產(chǎn)酸菌株Y010與醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianussubsp.pasteurianusLMG 1262T（BACG01000075）非常接近，16S rDNA序列相似性高達(dá)100%。再結(jié)合菌落形態(tài)特征、個體形態(tài)特征、生理生化鑒定，參考《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[18]及《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》鑒定菌株。確定出產(chǎn)酸菌株Y010為醋桿菌屬（Acetobacter sp.）巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus），可作為蘋果醋發(fā)酵專用菌種進(jìn)一步研究。

2.6 醋酸發(fā)酵過程中乙醇脫氫酶酶活與產(chǎn)酸量、產(chǎn)酸速率之間的關(guān)系

2.6.1 乙醇脫氫酶酶活與產(chǎn)酸量的關(guān)系

優(yōu)選菌株Y010在蘋果醋發(fā)酵過程中ADH酶活和產(chǎn)酸量的關(guān)系，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，當(dāng)菌液培養(yǎng)48 h時，ADH酶活和產(chǎn)酸總量均隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸上升，即ADH酶活和產(chǎn)酸總量呈正相關(guān)；但是，當(dāng)菌液培養(yǎng)48 h后，ADH酶活隨著培養(yǎng)時間的延長卻逐漸下降，而產(chǎn)酸總量隨著培養(yǎng)時間的延長而逐漸上升，這是因?yàn)楫a(chǎn)酸量是一個逐步積累的過程，在整個發(fā)酵過程中產(chǎn)酸量逐漸增大，最大達(dá)到53.12 g/L。

圖6 優(yōu)選菌株Y010醋酸發(fā)酵過程中ADH酶活、產(chǎn)酸量變化曲線Fig.6 Change curve of ADH activity and total acid production of the dominate strain Y010 in fermentation process

2.6.2 乙醇脫氫酶酶活與產(chǎn)酸速率的關(guān)系

乙醇脫氫酶是醋酸桿菌氧化產(chǎn)醋酸的關(guān)鍵酶，在醋酸發(fā)酵過程中ADH酶活和產(chǎn)酸速率如表4所示。由表4可知，乙醇脫氫酶ADH酶活與產(chǎn)酸速率變化趨勢相一致，48h時，ADH酶活最大達(dá)到4.62 U/mL，此時，產(chǎn)酸速率也最大達(dá)到0.51 g/（L·h），故ADH酶活越高，產(chǎn)酸越快。故ADH酶活和產(chǎn)酸速率可作為優(yōu)良醋酸菌選育的依據(jù)。

表4 優(yōu)選菌株Y010醋酸發(fā)酵過程中ADH酶活和產(chǎn)酸速率Table 4 Relationship between ADH activity and acid yield of the dominate strain Y010 in fermentation process

3 結(jié)論

巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）廣泛存在于水果、蔬菜、醋和飲料中，具有醋桿菌屬的特性，適于果醋發(fā)酵。本研究從腐爛蘋果、果園泥土中分離、篩選適合蘋果醋發(fā)酵的較優(yōu)醋酸菌，采用傳統(tǒng)的菌株篩選方法，經(jīng)初篩、復(fù)篩、產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)、遺傳穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)、生理生化試驗(yàn)以及16S rDNA鑒定結(jié)果，初步確定出優(yōu)選菌株Y010為巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus），為工業(yè)菌株的篩選和鑒別菌株性能優(yōu)劣提供重要參考依據(jù)。

通過進(jìn)一步研究優(yōu)選菌株Y010在蘋果醋發(fā)酵過程中，其ADH酶活與產(chǎn)酸速率、產(chǎn)酸濃度之間的關(guān)系，得到在醋酸發(fā)酵體系中ADH酶活和產(chǎn)酸速率呈現(xiàn)出較高的一致性，酶活越高產(chǎn)酸速率越大。發(fā)酵48 h時，菌體Y010生長活躍，ADH酶活最大，達(dá)到4.62 U/mL，產(chǎn)酸速率最快達(dá)到0.51 g/（L·h）。而產(chǎn)酸量隨著發(fā)酵時間延長逐漸增大，120 h最大達(dá)到53.12 g/L。

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TS264.2

0254-5071（2017）05-0100-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.05.021

2016-11-16

國家自然科學(xué)基金地區(qū)基金項(xiàng)目（31460449）；甘肅省農(nóng)牧廳生物技術(shù)專項(xiàng)（GNSW-2013-31）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金資助（CARS-28）

張霽紅（1977-），女，副研究員，碩士，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩?/p>

*通訊作者：張永茂（1957-），男，研究員，本科，研究方向?yàn)楣呒庸ぁ?/p>